本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種澤蘭內(nèi)酯作為制備抗肝癌和結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥嚴(yán)重威脅人類健康。近年來癌癥的發(fā)病率持續(xù)上升，成為僅次于心腦血管疾病的第二大致死性疾病。隨著醫(yī)學(xué)的進步，臨床上涌現(xiàn)出大量抗腫瘤藥物。但是化療藥物的毒副作用使其臨床應(yīng)用受到了極大限制，發(fā)掘毒副作用小、價格低廉的化療藥物已成為醫(yī)藥工作者亟待解決的一大課題。

腫瘤是機體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個細(xì)胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的異常病變。我國的腫瘤病例數(shù)相當(dāng)龐大，有資料顯示占全世界病例數(shù)的55％。

沙旋覆花(Inulasalsoloides(Turcz.)Ostenf.)為菊科旋覆花屬，多年生草本植物。主要分布在我國新疆、甘肅、陜西、內(nèi)蒙古、河北、青海北部和東部、山西北部和遼寧西部等地區(qū)。又名絞蛆爬(《內(nèi)蒙古中草藥》)，禿女子草、黃喇嘛、黃花蒿、蓼子樸(《中國沙漠地區(qū)藥用植物》)，小葉旋復(fù)花、額勒森-阿拉坦-都蘇拉(蒙名)、沙地旋覆花、黃蓬花、小旋覆花、山貓眼。

天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有新穎和多樣性的特點。結(jié)構(gòu)新穎的活性天然產(chǎn)物是先導(dǎo)化合物的重要來源之一，其發(fā)現(xiàn)不僅會推動化學(xué)與藥學(xué)研究的進展，還可能導(dǎo)致藥物新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。當(dāng)前使用的抗腫瘤藥物中，超過60％是直接或間接來自天然產(chǎn)物，如抗腫瘤藥物紫杉醇和長春花生物堿等。從傳統(tǒng)中藥和藥用植物中尋找具有抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物，研究其作用機制，從而研制抗腫瘤治療藥物是當(dāng)前研究的熱點。

沙旋覆花主要化學(xué)成分較為豐富，倍半萜類為其特征性化學(xué)成分。此外，該植物還含有少量的三萜類成分。倍半萜類是沙旋覆花的主要活性成分，根據(jù)其碳骨架類型旋覆花屬植物中報道的倍半萜類化合物主要分為無環(huán)倍半萜；裂環(huán)桉型；欖烷型；吉馬烷型和愈創(chuàng)木烷型。此外，旋覆花屬植物還含有少量二萜類化合物；黃酮類化合物及甾體類化合物。我們對采自新疆和田地區(qū)的沙旋覆花進行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究并做了體外抗腫瘤活性檢測，以期從中分離得到具有抗腫瘤活性的化合物。

澤蘭內(nèi)酯是沙旋覆花的提取物，屬于天然產(chǎn)物，為吉馬烷型倍半萜。澤蘭內(nèi)酯對人口腔表皮樣癌細(xì)胞KB及小鼠淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞P-388有顯著的抑止作用，于文獻(Bing-Nan ZHOU，Nai-Sheng BAI，Long-Ze LIN.Sesquiterpenes lactones from InulaSalsoloides.Pergamon 1994，36(3):721-724.)中報道。另外澤蘭內(nèi)酯對人肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞也有明顯的細(xì)胞毒性，于文獻(李勇,叢斌,趙陸.土木香根中3種倍半萜內(nèi)酯化合物抑制人肺腫瘤細(xì)胞增殖活性及其構(gòu)效關(guān)系的研究.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報.2010,31(6):621-624.)(Jongkyu Lee，CheolHwangbo,Jung-JoonLee.The sesquiterpene lactone eupatolide sensitizesbreast cancer cells toTRAIL through down-regulation of c-FLIP expression.Oncology reports,2010,23:229-237.)(曾增超.澤蘭內(nèi)酯對人宮頸癌細(xì)胞增殖的影響及其機制探討.河北醫(yī)科大學(xué)，2010年.)報道。但至今未有報道有關(guān)澤蘭內(nèi)酯對肝、腸癌細(xì)胞的抑止作用。隨著人們對其化學(xué)和生物學(xué)研究的深入，其分子作用機制將逐步明確，這將進一步推動此類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾和構(gòu)效關(guān)系研究，并有助于提高沙旋覆花的藥用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種澤蘭內(nèi)酯作為制備抗肝癌和結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用，克服了上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，其能有效解決至今未有報道有關(guān)澤蘭內(nèi)酯對肝、腸癌細(xì)胞的抑止作用的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下措施來實現(xiàn)的：一種澤蘭內(nèi)酯作為制備抗肝癌和結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。

下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案的進一步優(yōu)化或/和改進：

上述澤蘭內(nèi)酯為從沙旋覆花或者其他旋覆花屬植物中提取，經(jīng)純化分離得到；或，澤蘭內(nèi)酯為化學(xué)合成方法得到。

上述澤蘭內(nèi)酯的劑型為片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、注射液、粉針劑中的一種。

上述澤蘭內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明首次提出了澤蘭內(nèi)酯對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29兩種細(xì)胞株的生長均有不同程度的抑制作用；且澤蘭內(nèi)酯對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的生長抑制作用明顯優(yōu)于陽性藥TPT(鹽酸拓?fù)涮婵?；說明澤蘭內(nèi)酯對體外腫瘤細(xì)胞具有明顯的抗腫瘤作用，具有較好的藥用前景。

附圖說明

附圖1為化合物澤蘭內(nèi)酯結(jié)構(gòu)式。

附圖2為化合物澤蘭內(nèi)酯¹H-NMR。

附圖3為化合物澤蘭內(nèi)酯¹³C-NMR。

附圖4為化合物澤蘭內(nèi)酯高分辨質(zhì)譜。

附圖5為澤蘭內(nèi)酯的關(guān)鍵COSY(粗線)和HMBC(箭頭)信號圖。

具體實施方式

本發(fā)明不受下述實施例的限制，可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案與實際情況來確定具體的實施方式。

實施例1，該澤蘭內(nèi)酯作為制備抗肝癌和結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。

實施例2，作為上述實施例的優(yōu)化，澤蘭內(nèi)酯為從沙旋覆花或者其他旋覆花屬植物中提取，經(jīng)純化分離得到；或，澤蘭內(nèi)酯為化學(xué)合成方法得到。

實施例3，作為上述實施例的優(yōu)化，澤蘭內(nèi)酯的劑型為片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、注射液、粉針劑中的一種。

實施例4，作為上述實施例的優(yōu)化，澤蘭內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

上述澤蘭內(nèi)酯在制備抗肝癌和結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用如下：

一、澤蘭內(nèi)酯的制備

澤蘭內(nèi)酯可為化學(xué)合成方法得到；或，澤蘭內(nèi)酯也可按現(xiàn)有方法從沙旋覆花或者其他旋覆花屬植物中提取，經(jīng)純化分離得到，從沙旋覆花中提取澤蘭內(nèi)酯的步驟如下：a)將沙旋覆花(采自新疆和田地區(qū)，植物樣本由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所民族藥物研究室研究員楊偉俊鑒定，并留樣于新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所食品研究檢測室，標(biāo)號為S.X.F.0001)全草80kg，用體積分?jǐn)?shù)為50％至95％乙醇浸泡提取，每次浸泡使用的乙醇體積為待提取的沙旋覆花藥材質(zhì)量的5倍，共浸泡提取3次，每次24小時；合并乙醇浸泡提取液，減壓濃縮至無乙醇味；采用乙酸乙酯萃取濃縮液3次，每次24h，減壓濃縮乙酸乙酯萃取液得浸膏；

b)以石油醚與乙酸乙酯按1:0～0:1的體積比形成的混合溶液進行梯度洗脫，進一步優(yōu)化于石油醚與乙酸乙酯的體積比為7:3的洗脫液，通過薄層層析檢測，收集石油醚和乙酸乙酯展開體系下，Rf值約0.6，硫酸—乙醇顯紫色的組分，于低于60℃條件下減壓濃縮后析出大量結(jié)晶，結(jié)晶再經(jīng)無水乙醇重結(jié)晶一次即得到澤蘭內(nèi)酯。

澤蘭內(nèi)酯為白色無定型粉末，ESI/MS給出準(zhǔn)分子峰m/z271.1291[M+Na]⁺，287.1031[M+K]⁺結(jié)合碳譜、氫譜確定分子式為C₁₅H₂₀O₃。該化合物的光譜數(shù)據(jù)與文獻(Bing-Nan ZHOU，Nai-Sheng BAI，Long-Ze LIN.Sesquiterpenes lactones from InulaSalsoloides.Pergamon1994，36(3):721-724.)報道基本一致，故確定其為eupatolide，命名為澤蘭內(nèi)酯。

澤蘭內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如下:

HRESI-MS:271.1291[M+Na]⁺,287.1031[M+K]⁺；

[α]²⁰_D(c＝0.09,MeOH):+37.8^°

UV(MeOH):λmax(logε):206(4.2)nm

IRn_max:3430,1724,1715cm^-1；

¹H-NMR(400MHz in CDCl₃)、¹³C-NMR(100MHz in CDCl₃)波譜數(shù)據(jù)見表1所示。

澤蘭內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)鑒定過程

澤蘭內(nèi)酯為無色結(jié)晶，易溶于氯仿。HR-ESI-MS給出其準(zhǔn)分子離子峰271.1291[M+Na]⁺,287.1031[M+K]⁺，(圖4)推出其分子式為C₁₅H₂₀O₃，計算出其不飽和度為6，¹H NMR譜(表1，圖2)顯示有一個甲基信號在δ_H 1.73(s，15-CH₃)，4個烯氫信號6.39(1H，d，J＝4.0Hz，H-13a)，5.58(1H，d，J＝4.0Hz，H-13b)，4.81(1H，dd，J＝12.0，4.4Hz，H-1)，4.86(1H，t，J＝18.4，9.6Hz，H-5)。碳譜(表1，圖3)給出15個碳信號，包括三個烯鍵碳信號δ_C 129.5(C-1)，142.7(C-4)，127.7(C-5)，135.9(C-10)，138.6(C-11)，120.5(C-13)；一個酯基碳信號δ_C170.2(C-12)，以及兩個含氧碳信號δ_C75.0(C-6)，70.2(C-8)。分析該化合物的核磁數(shù)據(jù)可以看出，該化合物母核有15個碳，扣除三個雙鍵、一個羰基的4個不飽和度，還有2個不飽和度，表明該化合物是雙環(huán)化合物，結(jié)合其生源，該化合物可能是雙環(huán)倍半萜類化合物。綜合分析二維核磁數(shù)據(jù)可以推出該化合物的平面結(jié)構(gòu)(圖1)。至此發(fā)現(xiàn)該化合物與前期工作得到的卵南美菊素在碳譜中僅缺少了一個甲基和一個羧基碳的信號，并且考慮到著兩個化合物是同種植物中獲得的衍生物，因此提示該化合物結(jié)構(gòu)可能比卵南美菊素少了一個乙酰氧基基團。此外，NOESY譜中也顯示出了該化合物與卵南美菊素相對構(gòu)型一致的相關(guān)信號。文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，該化合物與文獻報道的結(jié)構(gòu)相同(Chen J,HuangSG,Li FG,et al.Chemicalconstituents in Inula Salsoloides(Turz.)Ostenf.AtaBotamia Sinia.1992；34(1):62-65)(Zhou BN,Bai NS，Lin LZ,et al.Sesquiterpenes lactones from Inula Salsoloides.Phytochemistry.1994；36(3):721-724.)。該化合物確定為澤蘭內(nèi)酯；圖1為化合物澤蘭內(nèi)酯結(jié)構(gòu)式，圖2為化合物澤蘭內(nèi)酯¹H-NMR，圖3為化合物澤蘭內(nèi)酯¹³C-NMR，圖4為化合物澤蘭內(nèi)酯高分辨質(zhì)譜，圖5為澤蘭內(nèi)酯的關(guān)鍵COSY(粗線)和HMBC(箭頭)信號圖。

二、采用MTS比色法驗證抗腫瘤活性

細(xì)胞株處理

人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29，在37℃、5％CO₂及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)于含10％胎牛血清McCoy’s5A培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM/F-12培養(yǎng)基中，細(xì)胞呈對數(shù)增長時進行傳代，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁴個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入190μL，孵育18h至24h進行后續(xù)實驗。

模型制備

將腫瘤細(xì)胞株隨機分組：①正常對照組(control)：以含10％胎牛血清的McCoy’s5A培養(yǎng)基或1640培養(yǎng)基或DMEM/F-12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，終體積補充至200μL(補充液與樣品溶液相同)；②篩選樣品組(sample)：每孔加入檢測樣品10μL，終體積達200μL，化合物終濃度為5μg/mL，樣品與腫瘤細(xì)胞株共同孵育72h進行相關(guān)檢測；③陽性藥組(positive)：使用臨床一線抗腫瘤藥物鹽酸拓?fù)涮婵?TPT，MW：393.91)設(shè)置五個濃度梯度，每孔加入陽性藥10μL，終體積達200μL，終濃度依次為5μM、1μM、0.2μM、0.04μM、0.008μM，陽性藥與腫瘤細(xì)胞株共同孵育72h進行相關(guān)檢測。

活性檢測

模型制備結(jié)束時，每孔加入100μL MTS混合液，繼續(xù)培養(yǎng)4h顯色，于酶標(biāo)儀490nm波長處檢測各孔的光吸收值。

選擇初篩腫瘤生長抑制作用超過50％的樣品進行復(fù)篩(活性再評價)，待篩樣品與細(xì)胞共同孵育的濃度梯度設(shè)定為初篩終濃度的1/10至1/3，設(shè)置3個至5個梯度，其他方法同上，測量吸光值后計算IC₅₀。

計算方法

每組細(xì)胞均以MTS法檢測吸光值，測量后計算樣品對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率。以樣品不同劑量的對數(shù)對腫瘤細(xì)胞生長抑制率作圖，可得到劑量反應(yīng)曲線，從中求出該樣品的半數(shù)抑制劑量IC₅₀。

樣品抑制率(％)＝[(OD_control-OD_blank)-(OD_sample-OD_blank)]/(OD_control-OD_blank)×100％

OD_sample：樣品處理組吸光值；OD_control：正常對照組吸光值；OD_blank：培養(yǎng)板空白孔(無細(xì)胞)吸光值。

實驗結(jié)果

本實驗以體外培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞為研究對象，對澤蘭內(nèi)酯進行了腫瘤細(xì)胞生長抑制活性評價。

1、對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402的生長抑制作用

5μg/mL澤蘭內(nèi)酯可明顯抑制人肝癌細(xì)胞株BEL-7402生長，抑制率為86.14％。對上述樣品設(shè)置劑量梯度進行再評價，澤蘭內(nèi)酯對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402的生長抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，IC₅₀為1.57μg/mL。陽性藥TPT(鹽酸拓?fù)涮婵?的IC₅₀為30.82μg/mL。澤蘭內(nèi)酯對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402的生長抑制作用均顯著高于陽性藥TPT(鹽酸拓?fù)涮婵?。

2、對人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的生長抑制作用

5μg/mL澤蘭內(nèi)酯可明顯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29生長，抑制率為92.72％。對其設(shè)置劑量梯度進行再評價，澤蘭內(nèi)酯對人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的生長抑制作用均呈現(xiàn)劑量依賴性，IC₅₀為2.06μg/mL。陽性藥TPT(鹽酸拓?fù)涮婵?的IC₅₀為13.26μg/mL。澤蘭內(nèi)酯對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402的生長抑制作用均顯著高于陽性藥TPT(鹽酸拓?fù)涮婵?。

活性評價結(jié)論：樣品體外抗腫瘤作用評價見表2所示，從表2可以看出：

1、澤蘭內(nèi)酯對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29兩種細(xì)胞株的生長均有不同程度的抑制作用。陽性藥TPT(鹽酸拓?fù)涮婵?對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29體外生長抑制的IC₅₀是30.82μg/mL、13.26μg/mL。

2、澤蘭內(nèi)酯也呈現(xiàn)良好的體外抗腫瘤作用，其對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29兩種細(xì)胞株的生長抑制IC₅₀是1.57μg/mL、2.06μg/mL。澤蘭內(nèi)酯對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的生長抑制作用明顯優(yōu)于陽性藥TPT(鹽酸拓?fù)涮婵?(IC₅₀為30.82μg/mL和13.26μg/mL)。澤蘭內(nèi)酯對體外腫瘤細(xì)胞具有明顯的抗腫瘤作用。

3、澤蘭內(nèi)酯均具有明顯的抗腫瘤作用，可見：澤蘭內(nèi)酯對體外腫瘤細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤活性，可望作為活性成分用于制備抗腫瘤藥物制劑，具有藥用前景。

綜上所述，本發(fā)明首次提出了澤蘭內(nèi)酯對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29兩種細(xì)胞株的生長均有不同程度的抑制作用；且澤蘭內(nèi)酯對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的生長抑制作用明顯優(yōu)于陽性藥TPT(鹽酸拓?fù)涮婵?；說明澤蘭內(nèi)酯對體外腫瘤細(xì)胞具有明顯的抗腫瘤作用，具有較好的藥用前景。

以上技術(shù)特征構(gòu)成了本發(fā)明的實施例，其具有較強的適應(yīng)性和實施效果，可根據(jù)實際需要增減非必要的技術(shù)特征，來滿足不同情況的需求。表1 澤蘭內(nèi)酯的1H-NMR、13C-NMR波譜數(shù)據(jù)

表2 樣品體外抗腫瘤作用評價