本發明屬于肉桂多酚提取技術領域，尤其涉及一種基于纖維素酶輔助提取肉桂多酚的方法。

背景技術：

肉桂為樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥樹皮，是我國衛生部公布的藥食兼用植物材料，既在民間作為食用香料廣泛使用，又在中醫臨床上作為藥品使用。其味辛甘、大熱，有補火助陽、引火歸源、散寒止痛等功效。其所含化學成分有揮發油、酚類、有機酸、鞣質、多糖、甙、甾體、內脂、香豆精等?，F代藥理試驗表明，肉桂多酚可增強胰島素生物活性，具有降血糖及抗氧化等作用。纖維素酶是一組能夠降解纖維素的酶的總稱，可破壞細胞壁的致密結構，加速藥材有效成分的溶出，因此纖維素酶在不少中草藥有效成分的提取分離中都得到了應用。但目前尚未看到纖維素酶應用于肉桂多酚提取的相關報道。有文獻報導了一種肉桂多酚的提取方法：Joseph等最早采用水煮法從肉桂中提取多酚。還有文獻報導了一種肉桂多酚的提取方法：平華,張貴軍等重復水煮法工藝,用正交法設計改良工藝條件,得到提取溫度為60℃,加水量為12倍,提取時間為60min的結論。還有文獻報導了一種肉桂多酚的提取方法：秦瑩等采用乙醇-水混合溶劑體系提取,經多次實驗得出乙醇與水的比例為10:90時提取效果最好的結論。還有文獻報導了一種肉桂多酚的提取方法：Anderson等采用混合溶劑提取,后用LH-20葡萄糖凝膠柱分離,再通過液相制備柱的形式對肉桂多酚進行了提取、分離和鑒別。上述方法都存在不同程度的局限性。其中水提法簡單無毒成本低易操作，是近年來常用的方法，但是其產率低是其最大的缺點，不適合大批量的生產，有必要開發一種更加簡單易行且提取率增加的方法。

綜上所述，現有的提取肉桂多酚的方法存在產率低，不適合大批量的生產。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種基于纖維素酶輔助提取肉桂多酚的方法，旨在解決現有的提取肉桂多酚的方法存在產率低，不適合大批量的生產的問題。

本發明是這樣實現的，一種基于纖維素酶輔助提取肉桂多酚的方法，所述基于纖維素酶輔助提取肉桂多酚的方法加入占干燥肉桂粉總質量0.15％的纖維素酶酶解后加蒸餾水煎煮。

進一步，所述基于纖維素酶輔助提取肉桂多酚的方法，其特征在于，所述加入纖維素酶之前：

稱取干燥肉桂粉，料液比1：25，pH5.2。

進一步，所述加蒸餾水煎煮后濾液合并后濃縮，得浸膏。

進一步，所述基于纖維素酶輔助提取肉桂多酚的方法提取溫度100℃，提取時間60min。

進一步，于30℃條件下酶解60min后加蒸餾水煎煮。

本發明的另一目的在于提供一種利用所述基于纖維素酶輔助提取肉桂多酚的方法的肉桂多酚提取方法。

本發明提供的基于纖維素酶輔助提取肉桂多酚的方法，用正交試驗法對纖維素酶解法輔助提取肉桂多酚的工藝進行了優化，為研究開發肉桂提供科學依據。通過單因素及正交試驗，對纖維素酶輔助提取肉桂多酚的工藝進行研究；確定肉桂多酚的最佳提取工藝參數為溫度100℃、提取時間60min，料液比1:25、pH5.2，肉桂多酚的得率為3.23％，總多酚含量為35.2％，結果表明肉桂多酚有較強的抗氧化活性(IC50為41.02μg/mL)，濃度為200μg/mL時對羥自由基有最大清除率97.1％。

附圖說明

圖1是本發明實施例提供的基于纖維素酶輔助提取肉桂多酚的方法流程圖。

圖2是本發明實施例提供的提取溫度對得率的影響示意圖。

圖3是本發明實施例提供的提取時間對得率的影響示意圖。

圖4是本發明實施例提供的pH值對得率的影響示意圖。

圖5是本發明實施例提供的料液比對得率的影響示意圖。

圖6是本發明實施例提供的肉桂多酚和VC的還原能力測定示意圖。

圖7是本發明實施例提供的肉桂多酚對羥自由基的清除作用示意圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

下面結合附圖對本發明的應用原理作詳細的描述。

如圖1所示，本發明實施例提供的基于纖維素酶輔助提取肉桂多酚的方法包括以下步驟：

S101：稱取干燥肉桂粉，料液比1：25，pH5.2；

S102：加0.15％纖維素酶于30℃條件下酶解60min后加蒸餾水煎煮，提取溫度100℃，提取時間60min，濾液合并后濃縮，得其浸膏。

下面結合試驗對本發明的應用原理作詳細的描述。

l材料與方法

1.1材料、試劑與設備

肉桂：產地廣西，經宜春學院陳武教授鑒定為樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥樹皮，洗凈、干燥、粉碎備用。

纖維素酶：北京雙旋微生物培養基制品廠生產，活性1200IU/g；沒食子酸對照品：中國藥品生物制品檢定所；Folin-Ciocalteus phenol reagent：Sigma公司；碳酸鈉：分析純，天津市大茂化學試劑廠。

紫外分光光度計：美國尤尼克公司，UV-2000；數顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市環宇科學儀器廠，HH-6；電熱恒溫干燥箱：上海精密儀器儀表有限公司，DHG-9023A；旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠，RE-3000；電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司，BSA223S；離心機：上海安亭科學儀器廠，TGL-16。

1.2方法

1.2.1多酚標準曲線的制作

精密稱取沒食子酸10mg，置100mL量瓶中，加入超純水制成0.1mg/ml的溶液，作為對照品溶液。分別精確吸取1mL對照品溶液或樣品溶液，加1mL1mol/L的Folin-ciocalteu顯色劑，然后加入1mol/L Na₂CO₃溶液3mL，混勻，室溫靜置15min，反應液用蒸餾水定容至10mL，于725nm處測定其吸光度值。用1mL蒸餾水代替對照品溶液，同法操作作為空白溶液。其線性回歸方程為：Y＝7.0457X--0.0433(R²＝0.9959)。

1.2.2肉桂多酚的制備

精密稱取干燥肉桂粉，加0.15％纖維素酶于30℃、pH4.5條件下酶解60min后加蒸餾水煎煮，濾液合并后濃縮，得其浸膏，按繪制標準曲線的方法操作，測定總多酚含量并計算總多酚得率。

1.2.3單因素試驗及正交實驗

在肉桂多酚的提取過程中，以提取溫度、提取時間、料液比、pH值為主要因素進行單因素試驗及正交實驗。

1.2.4肉桂多酚抗氧化活性研究

1.2.4.1還原能力的測定

吸取不同質量濃度的肉桂多酚水溶液lmL，依次加入0.2mol/L的PBS溶液(pH6.6)2.5mL、1％的K₃[Fe(CN)₆]溶液l mL，混勻后50℃水浴保溫20min，流水冷卻，加入l0％的TCA溶液5mL，混勻后靜置10min，加入0.1％的FeC1₃溶液0.5mL最后加蒸餾水2.5mL，混勻靜置l0min，在波長700nm處測吸光度，以蒸餾水作為空白。用相同質量濃度的VC溶液為對照。

1.2.4.2對羥自由基清除率的測定

吸取不同質量濃度的肉桂多酚溶液2mL，加入2mL 6mmol/L FeSO₄、2mL6mmol/L水楊酸-乙醇溶液和2mL 6mmol/L H₂O₂溶液，37℃恒溫反應30min，然后在波長510nm處測定吸光度，并按相同方法測定未加入肉桂多酚的溶液吸光度A₀，未加入H₂O₂的溶液的吸光度A_x0，均以蒸餾水為參比溶液。

OH清除率(％)＝[A₀-(A_x-A_x0)]/A₀×100％

2結果與分析

2.1提取溫度的影響

選擇料液比為1：10，提取時間1小時，自然pH的條件下，提取溫度對肉桂總多酚得率的影響見圖2。

由圖2可見，隨著提取溫度的升高，肉桂總多酚得率不斷增高。當提取溫度達到100℃時得率最高。所以，提取溫度100℃為好。

2.2提取時間的影響

選擇料液比為1：10，提取溫度100℃，自然pH的條件下，提取時間對肉桂總多酚得率的影響見圖3。

由圖3可見，隨著肉桂總多酚提取時間的延長，肉桂總多酚的得率出現上升，60min達到最高，此后緩慢下降。因此最佳提取時間為60min。

2.3pH值的影響

在提取溫度100℃，提取時間60min，料液比1：10時，不同pH的條件對肉桂總多酚得率的影響見圖4。

由圖4可見，隨著pH值的升高肉桂總多酚得率緩慢上升，pH5.0時達到最高，此后迅速下降，pH7.0時得率幾乎只有最高值的一半。因此，弱酸性環境有利于肉桂多酚的提取，最佳提取pH為5.0。

2.4料液比的影響

在提取溫度100℃，提取時間60min，pH5.0的條件下不同料液比對肉桂總多酚得率的影響見圖5。

由圖5可見，隨著溶劑量的增加，提取效果不斷增高，當料液比為1：50時，肉桂總多酚得率最高，但當料液比超過1：16時，肉桂總多酚得率增加較小，綜合考慮成本因素選擇1：16作為提取的最佳料液比。

2.5正交試驗設計

根據單因素試驗結果，選取提取溫度、提取時間、料液比、pH值為考察因素，各取3個水平，選用L₉(3⁴)正交表進行試驗。以肉桂總多酚得率為指標，正交試驗水平因素見表1，試驗結果見表2。

表1正交試驗因素水平表

表2 L₉(3⁴)正交試驗設計及結果

由表2可知，4個因素對總多酚得率的影響主次順序為：C>D>A>B即：料液比>pH值>提取溫度>提取時間；最佳工藝參數為C₃D₂A₃B₂，即：料液比為1：25，pH5.0，提取溫度100℃，提取時間60min。經驗證試驗表明：加水量為肉桂粉的25倍，pH5.2，提取溫度100℃，提取時間60min平均進行3組，測得肉桂總多酚的平均得率為3.23％，其RSD為0.51％，總多酚含量為35.2％，優選條件的重現性良好。

2.6方差分析

由表3方差分析結果表明：由F比可知各因素對試驗結果影響的程度是料液比>pH值>溫度>提取時間，即影響最大的是料液比，其次是pH值，然后是提取溫度、提取時間，這與上面結果分析一致。

表3方差分析

2.7肉桂多酚抗氧化活性測定

2.7.1肉桂多酚的還原能力

還原能力是抗氧化性強弱的重要指標，因此可通過對還原能力的測定了解肉桂多酚抗氧化活性的大小。

由圖6可知，肉桂多酚和VC的還原能力均隨濃度的增大而增強，在相同質量濃度的條件下，肉桂多酚的還原力強于VC，說明肉桂多酚有較強的還原能力，其IC₅₀(A_700nm為0.5時的樣品質量濃度)為41.02μg/mL。

2.7.2對羥自由基的清除

由圖7可知。肉桂多酚對羥自由基具有明顯的清除作用，在多酚質量濃度為25μg/mL～200μg/mL時，清除率隨質量濃度的增加而增大，在200μg/mL時有最大清除率97.1％，說明肉桂多酚是一種有效的羥自由基清除劑。

3結論

經上述研究表明：纖維素酶輔助提取肉桂多酚工藝合理可行、操作簡便、成本較低、效果較好，總多酚得率較高。料液比、pH值、提取溫度、提取時間4個因素對總多酚得率有較大影響。料液比是影響提取率的主要因素，pH值是居中因素，提取溫度、提取時間是次要因素，經單因素試驗和正交試驗對提取工藝的優化，肉桂多酚最佳提取工藝條件為為料液比1：25，pH5.2，提取溫度100℃，提取時間60min。肉桂總多酚得率為3.23％，總多酚含量為35.2％。

抗氧化試驗表明，肉桂多酚的還原能力隨濃度的增大而增強，在相同的質量濃度條件下，肉桂多酚的還原力要強于VC；肉桂多酚對羥自由基的最大清除率為96.3％，具有良好的清除作用，并有明顯的量效關系。因此，肉桂多酚有望開發成為一種優良的天然抗氧化劑。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。