本發明屬于生物技術領域，具體涉及二甲雙胍聯合成體干細胞在制備治療心肌梗死藥物中的應用。

背景技術：

心肌梗死(Myocardial infarction，MI)是一種嚴重的心臟疾病，威脅著全人類的健康。心肌梗死的主要發病機制在于心肌細胞的急性和慢性損失，并最終導致心力衰竭。多種類型的干細胞包括骨髓和脂肪組織來源的干細胞已經在臨床試驗中應用于治療心肌梗死，但是治療效果并不十分顯著。其重要原因是移植后的干細胞存活率低下，在宿主心肌梗死區域高炎癥因子和自由基的環境下，無論使用哪種干細胞類型進行移植，其心肌組織保護和修復作用的發揮均受限于移植細胞的存活。研究表明提高PHDP2，Akt，Bcl-2，SDF-1，CR-1等促存活基因的表達可以提高移植細胞的存活，然而通過改造這些基因的方法仍處于動物實驗階段，離應用于臨床實踐仍有很長距離。

目前應用于臨床試驗的干細胞類型主要是成體干細胞，如未分選的骨髓細胞、骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞和心肌內源性干細胞。近期研究表明胚胎干細胞或者是誘導多能干細胞及其衍生細胞在治療心肌梗死的動物實驗中發揮了顯著的療效，但是這兩類細胞因具有成瘤風險而尚未進入臨床試驗。心肌球源性干細胞(Cardiosphere-derived cell，CDC)是心肌內源性干細胞的一種，無論是在動物模型還是臨床病人中，均起到心梗后保護和修復的作用，而且臨床試驗表明冠脈內自體CDC注射可以減少心梗面積，增加存活心肌的數量，并且在治療1年后可以顯著改善心梗區域的心功能，并且沒有產生嚴重的副作用。CDC治療心肌梗死的研究已進入II期臨床試驗，初步結果提示該細胞類型對心肌梗死的治療效果優于骨髓間充質干細胞等細胞類型。但是，CDC移植后存活率較低，很大程度上限制其治療心肌梗死的療效。

技術實現要素：

有鑒于此，為增加成體干細胞在心肌惡劣移植環境中的存活，提高成體干細胞修復心肌的能力及治療心肌梗死的療效，本發明的目的在于提供二甲雙胍(Metformin，MET)聯合成體干細胞在制備治療心肌梗死藥物中的應用。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

二甲雙胍聯合成體干細胞在制備治療心肌梗死藥物中的應用。

進一步，所述成體干細胞為心肌球源性干細胞、心肌前體干細胞、骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞、未分選的骨髓細胞或骨髓單個核細胞中的一種。

進一步，所述心肌梗死為急性心肌梗死、無痛性心肌梗死、非ST段抬高心肌梗死、右室心肌梗死或心房心肌梗死中的一種。

本發明的有益效果在于：本發明提供了二甲雙胍聯合成體干細胞在制備治療心肌梗死藥物中的應用，以二甲雙胍聯合成體干細胞制備的藥物用于治療心肌梗死，可有效增加成體干細胞在心肌惡劣移植環境中的存活，提高成體干細胞修復心肌的能力及治療心肌梗死的療效。

附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖進行說明：

圖1為Sham、MI+PBS、MI+MET、MI+CDC、MI+MET+CDC各組小鼠心肌梗死術后的M型超聲圖像、左室射血分數圖及短軸收縮率圖；

圖2為MI+PBS、MI+MET、MI+CDC、MI+MET+CDC各組小鼠心肌梗死術后的Masson染色顯示纖維化圖及心梗面積圖；

圖3為MET顯著提高CDC心肌內注射的存活率圖；

圖4為二甲雙胍增加過氧化氫處理后的心肌球源性干細胞的AMPK和eNOS的磷酸化水平的western blot圖。

其中，圖1中，A為各組小鼠心肌梗死術后M型超聲圖像，B為各組小鼠心肌梗死術后的左室射血分數圖，C為各組小鼠心肌梗死術后的左室短軸收縮率圖；圖2中，A1為各組小鼠心肌梗死術后心肌梗死面積圖，A2為各組小鼠心肌梗死術后心肌梗死面積統計圖，B1為各組小鼠心肌梗死術后梗死區纖維化圖，B2為各組小鼠心肌梗死術后梗死區纖維化統計圖，C1為各組小鼠心肌梗死術后梗死邊緣區纖維化圖，C2為各組小鼠心肌梗死術后梗死邊緣區纖維化統計圖；圖3中，A為MI+CDC、MI+MET+CDC兩組小鼠心肌梗死術后的免疫熒光染色圖，B為MI+CDC、MI+MET+CDC兩組小鼠心肌梗死術后的消化計數圖，C為MI+CDC、MI+MET+CDC兩組小鼠心肌梗死術后CDC存活率統計圖；圖4中，A1為各組小鼠心肌球源性干細胞的AMPK western blot圖，圖A2為各組小鼠心肌球源性干細胞的AMPK磷酸化水平的統計圖，B1為各組小鼠心肌球源性干細胞的eNOS western blot圖，B2為各組小鼠心肌球源性干細胞的eNOS磷酸化水平的統計圖。

具體實施方式

下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。

實施例1

心肌球源性干細胞(Cardiosphere-derived cell，CDC)的提取、培養及鑒定

用GFP標記16周齡C57小鼠(C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb)，取小鼠離體心臟，將小鼠心臟剪碎成小于1mm³的組織塊，使用0.05％的胰酶消化，然后將組織接種于預先使用纖連蛋白孵育的60mm小皿中，之后加入1mlCEM(80％IMDM，20％血清，1％雙抗)，7天后使用胰酶消化孵育出的CDC。

將上述CDC細胞以1000r/min離心3min，棄去上清培養基，PBS清洗兩次，加入CD29、CD105、CD90、CD45、CD34、CD31抗體，以及FITC和PE同型抗體4℃孵育30min，之后PBS清洗2次，使用C6流式細胞儀進行鑒定，上樣量為10000。鑒定結果為CD29、CD105、CD90陽性，CD45、CD34、CD31陰性。

實施例2

二甲雙胍(Metformin，MET)聯合CDC使用可改善小鼠心肌梗死術后心功能

將小鼠隨機分為四組：MI+PBS，MI+MET，MI+CDC和MI+MET+CDC。心肌梗死術前6小時腹膜內注射二甲雙胍125mg/kg。異氟烷進行誘導麻醉后，固定小鼠于加熱毯上，縱行切開頸部皮膚、肌肉，暴露氣管，進行氣管插管，調整呼吸機頻率為100次/分，潮氣量為20ml。于小鼠第四肋間橫行切開皮膚、肌肉，暴露肋骨，剪開肋間肌，撐開器暴露心臟，撕開心包膜，使用7-0絲線于左心耳下2-3mm結扎冠狀動脈，見心臟顏色變白，表明結扎成功，實驗組于心肌梗死邊緣分8個點注射CDC，關胸，消毒切口。假手術組(Sham)為僅進行開關胸，不結扎冠脈。二甲雙胍術后注射劑量為125mg/kg/day。術后7天，將小鼠隨機編號，遵守雙盲原則，超聲儀(GE vivid 7)測定小鼠的心臟結構和心功能，具體為：異氟烷誘導麻醉后，固定小鼠于泡沫板上，超聲探頭檢測小鼠胸骨旁長軸觀心臟影像，模式為M型，使用Teicholz公式計算左室射血分數，每個數據重復三次，以平均值作為統計數據。實驗結果如圖1所示，由各組M型超聲圖像(如圖1A)可知，二甲雙胍聯合使用CDC可以顯著改善小鼠心梗術后的左室射血分數(如圖1B所示)及短軸收縮率(如圖1C所示)。

實施例3

二甲雙胍促進CDC的存活并減少梗死面積

提取實施例2中各組小鼠心肌細胞于顯微鏡下計數具有綠色熒光的CDC，具體如下：取各組小鼠離體心臟，置于4℃的PBS中，移至顯微鏡下；用眼科鑷除去主動脈周圍的脂肪和其他組織，迅速將主動脈掛于針頭上，用線頭打結固定，針頭的位置不能超過主動脈根部；用容量為1ml的注射器吸入1號液(140mM NaCl、10mM Glucose、4mM KCl、1mM MgCl₂.6H₂O、10mM Hepes、10mM牛磺酸、10mM BDM)將心臟內的血液沖出；取下針頭，掛于灌注器上，除去灌注器內氣泡，以1號液灌注2min，然后換2號液(50ml 1號液、50mg膠原酶、6mg胰蛋白酶、0.5M CaCl₂ 2uL)沖洗消化10min，至心臟組織變軟塌陷，流速加快為約每秒1滴，心臟顏色由紅變淺，停止消化；將心臟剪下于60mm皿中，加2ml 2號液，將心臟剪碎至幾大塊，用吸管吹散；50目濾器過濾懸液，除去未被消化的心臟組織，并向濾液中加入10ml 3號液(50ml 1號液、250mg BSA、0.5M CaCl₂ 12.5uL)，以終止消化；將混合液體移入無菌離心管中，在1000r/min下離心5min，棄上清，在無菌離心管中加入4號液(50ml 1號液、250mg BSA、0.5M CaCl₂、25uL)，重懸細胞，收集心肌細胞，在顯微鏡下觀察具有綠色熒光的CDC。

免疫熒光染色計數CDC，具體如下：以體積分數為4％的多聚甲醛固定心臟組織，石蠟包埋固定，切片機切片，二甲苯脫蠟，EDTA-檸檬酸鈉修復30min，滴加免疫熒光封閉液，20℃下封閉1h，PBS洗片三次，再滴加兔來源anti-GFP(1:50，3ul)，小鼠來源Anti-α-actinin(1:100，3ul)于4℃孵育12h，PBS再洗片三次，滴加FITC標記山羊抗兔抗體(1:200，3ul)，Cy3標記山羊抗小鼠抗體(1:200，3ul)37℃在孵育1h，PBS再洗片三次后滴加DAPI染液，最后使用甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡下計數具有綠色熒光的CDC。

Masson染色：石蠟切片機切片，脫蠟后用Weigert蘇木精液染核5min，充分水洗后用Masson麗春紅酸性復紅液染色5min，以體積分數為2％的冰醋酸水溶液浸洗30s，體積分數為1％的磷鉬酸水溶液分化3min，用苯胺藍或光綠液染5min，以體積分數為0.2％的冰醋酸水溶液浸洗30s，質量分數為95％的酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。

結果：二甲雙胍聯合心肌球源性干細胞移植可以顯著減少心肌梗死面積(如圖2A1、A2所示)，以及梗死區纖維化(如圖2B1、B2所示)和梗死邊緣區纖維化(如圖2C1、C2所示)。通過免疫熒光(如圖3A所示)和消化計數(如圖3B所示)的方式證明應用二甲雙胍顯著提高心肌球源性干細胞在的存活率(如圖3C所示)。

實施例4

Western blot驗證二甲雙胍促進CDC存活的分子機制

實驗分組為Control、H₂O₂、MET+H₂O₂、AICAR+H₂O₂、MET+CC+H₂O₂、AICAR+CC+H₂O₂。配制SDS-PAGE凝膠，上樣量為100ug總蛋白，濃縮膠部分50-80v使樣品濃縮成一條窄帶，到分離膠可選擇100-120v，直至溴酚藍到達底部停止電泳。取下膠板，半干法轉膜，5-10％脫脂牛奶封閉，室溫、搖床約1h，用TBST漂洗一次約5min；用5％脫脂牛奶或5％BSA的TBST稀釋一抗4℃過夜或室溫1h孵育；用TBST緩沖液漂洗，3-4次，每次10min，用含1％BSA的TBST，1:5000-1：20000稀釋二抗，搖床室溫孵育1h，掃膜。

結果：通過Western blot證明二甲雙胍可以增加過氧化氫處理后的心肌球源性干細胞的AMPK(如圖4A1、A2所示)和eNOS(如圖4B1、B2所示)的磷酸化水平。

最后說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的范圍。