本發明涉及醫藥
技術領域：
，尤其涉及一種干細胞制劑及其在制備治療慢性腎炎的藥物中的應用。
背景技術：
：慢性腎炎：即慢性腎小球腎炎，系指蛋白尿、血尿、高血壓、水腫為基本臨床表現，起病方式各有不同，病情遷延，病變緩慢進展，可有不同程度的腎功能減退，具有腎功能惡化傾向和最終將發展為慢性腎衰竭的一組腎小球病。大部分慢性腎炎的發病機制是免疫介導炎癥。另外，非免疫、非炎癥機制在疾病發展過程中起重要作用，如存在腎單位長期代償處于血流高灌注、高濾過和高跨膜壓的“三高”狀態，久之導致健存腎小球硬化。慢性腎炎可發生于任何年齡，但以青中年為主，男性多見。多數起病緩慢、隱襲。慢性腎炎是一種自身免疫性疾病，其病理損害主要與免疫介導的炎癥反應有關，其結果是導致腎小球硬化，腎小管間質纖維化。對于慢性腎炎的治療，盡管已經闡釋了很多治療方式，仍無法阻止該病的發展。慢性腎炎的治療目前西醫多采用激素療法，但激素對病情的掩蓋性較強，副作用明顯，治標不治本；中醫采用具有解毒、消炎作用的中藥材制成，但中藥治療的效果差強人意。技術實現要素：有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種干細胞制劑及其在制備治療慢性腎炎的藥物中的應用，該制劑能夠有效治療慢性腎炎。本發明提供的干細胞制劑包括臍帶間充質干細胞和生理鹽水，其中臍帶間充質干細胞的密度為1×105cell/mL～5×105cell/mL。一些實施例中，臍帶間充質干細胞的密度為1×105cell/mL。一些實施例中，臍帶間充質干細胞的密度為2×105cell/mL。一些實施例中，臍帶間充質干細胞的密度為5×105cell/mL。本發明制劑中，臍帶間充質干細胞的表面標志物CD29表達量≥95％；CD44表達量≥90％；CD105表達量≥95％；CD34表達量≤5％；CD45表達量≤2％；CD86表達量≤5％；HLA-DR不表達。臍帶間充質干細胞的獲得方法為市場購得或自行制備本發明對此不做限定，其實施皆在本發明的保護范圍之內。干細胞的制備方法包括：步驟1：臍帶以含有200U/m雙抗的PBS溶液沖洗3遍后，剪成2cm長小段，剝去動、靜脈管和外膜后，剪碎成1～2mm2小塊，均勻貼附于10cm培養皿，37℃5％CO2培養箱內倒放1～2h；培養基為X-VIVO15無血清培養基。步驟2：加入含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15無血清培養基，37℃5％CO2培養2～3天后半量換液，繼續培養6～8天，待細胞從組織塊中爬出，棄去組織塊繼續培養；步驟3：待生長至80％融合，倒去培養液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1～2min，加FBS終止消化，400g離心5min收集臍帶間充質細胞。本發明中，干細胞的培養的采用含有EGF的X-VIVO15無血清培養基；其中EGF的濃度為10ng/mL。干細胞的培養方法為，將細胞接種至含有EGF的X-VIVO15無血清培養基37℃，5％CO2培養箱培養至80％融合后繼續傳代。本發明提供的干細胞制劑在制備抑制T細胞表面抗原CD8的表達的藥物中的應用。實驗表明，本發明提供的干細胞制劑能夠將T細胞表面抗原CD8的表達量降低5％以上。本發明提供的干細胞制劑在制備促進IL-4分泌的藥物中的應用。所述IL-4為外周血T淋巴細胞的IL-4。實驗表明，本發明提供的干細胞制劑能夠將外周血T淋巴細胞中IL-4的表達量上調15％以上。本發明提供的干細胞制劑在制備抑制INF-γ分泌的藥物中的應用。所述INF-γ為外周血T淋巴細胞的INF-γ。實驗表明，本發明提供的干細胞制劑能夠將外周血T淋巴細胞中INF-γ的表達量降低12％以上。本發明提供的干細胞制劑在制備降低尿蛋白含量、尿紅細胞數量的藥物中的應用。本發明實驗表明，給予本發明提供的干細胞制劑，38％的慢性腎炎患者的尿蛋白減少，與給予前相比下降50％以上，腎功能正常或基本正常，癥狀、體征有所改善，尿鏡檢紅細胞＜2個/HP。另有49％的慢性腎炎患者的尿蛋白減少，定量值小于0.4g/24h，腎功能正?；蚧菊?，癥狀、體征有所改善，尿鏡檢紅細胞＜2個/HP。說明本發明提供的干細胞制劑具有降低尿蛋白含量、尿紅細胞含量的藥物中的應用。本發明提供的干細胞制劑在制備治療慢性腎炎的藥物中的應用。綜合上述結果，本發明提供的干細胞制劑能夠具有治療慢性腎炎的作用。本發明提供的干細胞制劑可單獨用于改善慢性腎炎，也可添加其他輔料制成不同的藥物劑型用于治療慢性腎炎，本發明對此不做限定。本發明還提供了一種治療慢性腎炎的藥物，其中包括本發明提供的干細胞制劑。本發明還提供了一種治療慢性腎炎的方式，具體為給予本發明提供的干細胞制劑。所述給予的方式為滴注，具體為靜脈滴注。給予的劑量為100mL/次。2天一次連續3次，3個月一個療程。本發明提供的干細胞制劑由生理鹽水重懸臍帶間充質干細胞制成，其通過抑制T細胞表面抗原CD8的表達和INF-γ的分泌，并上調外周血T淋巴細胞的IL-4的分泌，進而降低患者尿蛋白含量、尿紅細胞數量，從而起到治療慢性腎炎的作用，其治療的有效率可達88％，緩解率可達54％。具體實施方式本發明提供了一種干細胞制劑及其在制備治療慢性腎炎的藥物中的應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和范圍內對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。下面結合實施例，進一步闡述本發明：實施例1制備臍帶間充質干細胞臍帶以含有200U/m雙抗的PBS溶液沖洗3遍后，剪成2cm長小段，剝去動、靜脈管和外膜后，剪碎成1-2mm2小塊，均勻貼附于10cm培養皿，37℃5％CO2培養箱內倒放1-2h；培養基為X-VIVO15無血清培養基。加入含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15無血清培養基，37℃5％CO2培養2～3天后半量換液，繼續培養6～8天，待細胞從組織塊中爬出，棄去組織塊繼續培養；待生長至80％融合，倒去培養液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1～2min，加FBS終止消化，400g離心5min收集臍帶間充質細胞。以含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15無血清培養基重懸臍帶間充質細胞，根據計數結果接種2-3皿(接種密度為1-5×105cell/ml)。待細胞生長至80％融合后繼續傳代，至P2或P3代細胞進行細胞和培養上清液的收集。對收集后的細胞進行流式細胞檢測，選擇符合表1標準的干細胞制備干細胞制劑。表1干細胞篩選標準實施例2干細胞制劑的制備收集實施例1中經篩選的P2和P3代干細胞，以生理鹽水重懸至細胞密度為2×106cell/mL。實施例3干細胞制劑的制備收集實施例1中經篩選的P2和P3代干細胞，以生理鹽水重懸至細胞密度為1×106cell/mL。實施例4干細胞制劑的制備收集實施例1中經篩選的P2和P3代干細胞，以生理鹽水重懸至細胞密度為5×106cell/mL。實施例5檢測實施例2～4的干細胞制劑對外周血T淋巴細胞表達炎癥相關抗原CD8的作用，及對外周血T淋巴細胞分泌IL-4和INF-γ的作用實驗方法為：在聚羥基脂肪酸酯(PHA，10g/ml濃度)存在條件下，將外周血T淋巴細胞(PBMC)與本發明制備的干細胞制劑共同培養，培養時間為3天。分組為：陽性對照組：PHA+PBMC；實驗組1：PHA+PBMC+實施例2干細胞制劑；實驗組2：PHA+PBMC+實施例3干細胞制劑；實驗組3：PHA+PBMC+實施例4干細胞制劑；3天后測定收集各組PBMC檢測CD8差異；收集各組上清液檢測IL-4和INF-γ濃度差異；結果如表1：表1細胞檢測結果陽性組實驗組1實驗組2實驗組3CD829.8％24.5％22.3％23.8％IL-40.27ug/ml0.35ug/ml0.32ug/ml0.41ug/mlINF-γ0.18ug/ml0.13ug/ml0.12ug/ml0.15ug/ml實驗表明，本發明提供的干細胞制劑能夠將T細胞表面抗原CD8的表達量降低5％以上。將外周血T淋巴細胞中IL-4的表達量上調15％以上。將外周血T淋巴細胞中INF-γ的表達量降低12％以上。實施例6隨機選取志愿患者200例，診斷結果符合原發性腎小球腎炎。其中男性112例，女性88例，年齡20-55歲，平均年齡33歲，病程1～5年，平均2.2年，血肌酐(SCr)≤177umol/L，并簽訂知情同意書。所有病人隨機分為4組進行治療。對照組：現有專利藥物；實驗組1：給予實施例2干細胞制劑；實驗組2：給予實施例3干細胞制劑；實驗組3：給予實施例4干細胞制劑；實驗組1～3每人每次滴注本發明的干細胞制劑100mL，隔天回輸一次，3次一療程，間隔3個月進行第二個療程。所有病人持續治療跟蹤3年，進行療效評價：緩解：尿蛋白定量＜0.4g/24h，尿鏡檢紅細胞＜2個/HP，腎功能正常、癥狀、體征消失；有效：尿蛋白檢測持續減少比治療前下降50％以上，腎功能正?；蚧菊?，癥狀、體征有所改善。評價結果如表3：表3評價結果分組病例數緩解數有效數緩解率有效率陽性對照5092818％74％實驗組150251850％86％實驗組250271754％88％實驗組350222244％88％結果表明，本發明提供的組合物對慢性腎炎的有效率可達88％，緩解率可達54％。以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3