本發明屬于間充質干細胞的培養基領域，特別涉及一種大規模制備人臍帶間充質干細胞因子用誘導分泌培養基。
背景技術：
間充質干細胞來源于發育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細胞。因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。間充質干細胞最早在骨髓中發現，隨后還發現存在于人體發生、發育過程的許多種組織中。目前,我們能夠從骨髓、脂肪、臍帶、滑膜、骨骼等組織中分離和制備間充質干細胞，其中研究最早的是骨髓來源的間充質干細胞。但骨髓組織取材不易，難以大規模生產。當前研究表明，臍帶來源的間充質干細胞不但能夠成為骨髓間充質干細胞的理想替代物，而且具有更大的應用潛能。
間充質干細胞已用于治療十余種難治性疾病的治療研究，除了用來促進恢復造血，與造血干細胞共移植提高白血病和難治性貧血等以外，還用于心腦血管疾病，肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、腦和脊髓神經損傷、老年癡呆及紅斑狼瘡和硬皮病等自身免疫性疾病的治療研究，已經取得的部分臨床試驗結果令人鼓舞。間充質干細胞作用機理尚不完全明確，一般認為主要通過以下機制：1、旁分泌作用(分泌細胞營養因子、細胞生長因子、抗凋亡因子等)。2、代替或修復死亡或受損的細胞。3、細胞直接接觸，調控細胞的功能。當前，越來越多的研究表明，間充質干細胞的旁分泌效應在其發揮治療效果中其主要作用。間充質干細胞通過分泌各類細胞因子對鄰近細胞產生作用，從而發揮其功效。研究表明，間充質干細胞可分泌多種細胞因子，如VEGF(血管內皮生長因子)、bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)、NGF(神經生長因子)、HGF(肝細胞生長因子)、IGF-1(胰島素樣生長因子1)、BDNF(腦源性神經營養因子)、GDNF(膠質源性神經營養因子)、IL-6(白細胞介素6)、IL-11(白細胞介素11)等。間充質干細胞分泌活性因子具有改善炎性環境、調節機體免疫狀態、抑制細胞凋亡、促進細胞增殖、促進血管再生、促進神經干細胞遷移和分化、促進軸突生長及突觸連接形成、促進髓鞘形成的功能，通過腦白質損傷的動物模型證實可以抑制宿主細胞及移植細胞凋亡、改善模型鼠的神經功能，通過心梗動物模型證實可以促進心功能恢復，通過皮膚損傷實驗證實可以促進傷口愈合。
目前對干細胞的研究集中于干細胞的增殖和誘導分化，對于利用干細胞生產分泌因子的研究較少。培養間充質干細胞收集培養液或細胞裂解液，存在培養規模較小，誘導細胞因子分泌過程不夠高效，分離純化過程不具規模化、分泌的活性因子得不到充分利用問題。CN104099294A公開了一種基于干細胞分泌生物因子的培養基及其制備和使用方法，收集干細胞培養擴增過程中更換的廢棄培養液，將其進行凍融、低溫分離、超濾和濃縮，得到富含豐富生物活性因子的溶液，按照一定的比例添加到基礎培養基中。
技術實現要素：
針對上述問題，本發明提出了一種大規模制備人臍帶間充質干細胞因子用誘導分泌培養基，具體如下：
一種大規模制備人臍帶間充質干細胞因子用誘導分泌培養基，所述誘導分泌培養基主要由DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸溶解于磷酸鹽緩沖液而成，DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸在誘導分泌培養基中的濃度分別為400-600ml/L、1-3mmol/L、10-20μmol/L、10-20g/L、10-100μmol/L。
優選的，DMEM、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸在誘導分泌培養基中的濃度分別為500ml/L、2mmol/L、15μmol/L、15g/L、50μmol/L。
優選的，所述誘導分泌培養基還包括誘導增強劑，所述誘導增強劑在誘導分泌培養基中濃度為1-2g/L，所述誘導增強劑包括10-20重量份的三磷酸腺苷、10-20重量份的三磷酸鳥苷、10-50重量份環磷酸鳥苷和5-20重量份的NaNO3。
進一步優選的，所述誘導增強劑在誘導分泌培養基中濃度為1.5g/L。
更進一步優選的，所述誘導增強劑包括15重量份的三磷酸腺苷、15重量份的三磷酸鳥苷、20重量份環磷酸鳥苷和10重量份的NaNO3。
優選的，所述誘導分泌培養基還包括分泌增強劑，所述分泌增強劑在誘導分泌培養基中濃度為0.1-1g/L，所述分泌增強劑包括10-20重量份的甘油、10-20重量份的亞麻酸、10-50重量份二十二碳六烯酸和1-10重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
更進一步優選的，所述分泌增強劑在誘導分泌培養基中濃度為0.5g/L。
更進一步優選的，所述分泌增強劑包括15重量份的甘油、15重量份的亞麻酸、20重量份二十二碳六烯酸和5重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
本發明還公開了制備大規模制備人臍帶間充質干細胞因子用誘導分泌培養基的方法，包括以下步驟：
a取配置培養基目標體積四分之一的磷酸鹽緩沖液，充分攪拌；
b依次加入DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸，充分攪拌；
c用磷酸鹽緩沖液定容至目標體積。
本發明還公開了另一種大規模制備人臍帶間充質干細胞因子用誘導分泌培養基的方法，包括以下步驟：
a取配置培養基目標體積四分之一的磷酸鹽緩沖液，充分攪拌；
b1依次加入DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸，充分攪拌；
b2依次加入三磷酸腺苷、三磷酸鳥苷、環磷酸鳥苷、NaNO3和甘油，充分攪拌；
b3加入脂肪醇聚氧乙烯醚充分攪拌，依次加入亞麻酸和二十二碳六烯酸，充分攪拌；
c用磷酸鹽緩沖液定容至目標體積。
本發明中，所述DMEM為高糖型液體培養基，購自Thermo Fisher Scientific，貨號：11995-065，所述磷酸鹽緩沖液為1倍磷酸鹽緩沖液，pH為7.4。
本發明的一種實施方式公開了大規模制備人臍帶間充質干細胞因子用誘導分泌培養基，適用于大規模培養的人臍帶間充質干細胞，可以高效的誘導分泌活性因子；本發明的一種實施方式公開了大規模制備人臍帶間充質干細胞因子用誘導分泌培養基的制備方法。
具體實施方式
實施例1
大規模制備人臍帶間充質干細胞因子用誘導分泌培養基，主要由DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸溶解于磷酸鹽緩沖液而成，DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸在誘導分泌培養基中的濃度分別為400ml/L、1mmol/L、10μmol/L、10g/L、10μmol/L。
實施例2
大規模制備人臍帶間充質干細胞因子用誘導分泌培養基，主要由DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸溶解于磷酸鹽緩沖液而成，DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸在誘導分泌培養基中的濃度分別為600ml/L、3mmol/L、20μmol/L、20g/L、100μmol/L。
實施例3
大規模制備人臍帶間充質干細胞因子用誘導分泌培養基，主要由DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸溶解于磷酸鹽緩沖液而成，DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸在誘導分泌培養基中的濃度分別為500ml/L、2mmol/L、15μmol/L、15g/L、50μmol/L。
實施例4
與實施例3的不同之處在于，所述誘導分泌培養基還包括誘導增強劑，所述誘導增強劑在誘導分泌培養基中濃度為1g/L，所述誘導增強劑包括10重量份的三磷酸腺苷、10重量份的三磷酸鳥苷、10重量份環磷酸鳥苷和5重量份的NaNO3。
實施例5
與實施例3的不同之處在于，所述誘導分泌培養基還包括誘導增強劑，所述誘導增強劑在誘導分泌培養基中濃度為2g/L，所述誘導增強劑包括20重量份的三磷酸腺苷、20重量份的三磷酸鳥苷、50重量份環磷酸鳥苷和20重量份的NaNO3。
實施例6
與實施例3的不同之處在于，所述誘導分泌培養基還包括誘導增強劑，所述誘導增強劑在誘導分泌培養基中濃度為1.5g/L，所述誘導增強劑包括15重量份的三磷酸腺苷、15重量份的三磷酸鳥苷、20重量份環磷酸鳥苷和10重量份的NaNO3。
實施例7
與實施例6的不同之處在于，所述誘導分泌培養基還包括分泌增強劑，所述分泌增強劑在誘導分泌培養基中濃度為0.1g/L，所述分泌增強劑包括10重量份的甘油、10重量份的亞麻酸、10重量份二十二碳六烯酸和1重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
實施例8
與實施例6的不同之處在于，所述誘導分泌培養基還包括分泌增強劑，所述分泌增強劑在誘導分泌培養基中濃度為1g/L，所述分泌增強劑包括20重量份的甘油、20重量份的亞麻酸、50重量份二十二碳六烯酸和10重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
實施例9
與實施例6的不同之處在于，所述誘導分泌培養基還包括分泌增強劑，所述分泌增強劑在誘導分泌培養基中濃度為0.5g/L，所述分泌增強劑包括15重量份的甘油、15重量份的亞麻酸、20重量份二十二碳六烯酸和5重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
實施例10
制備大規模制備人臍帶間充質干細胞因子用誘導分泌培養基的方法，包括以下步驟：
a取配置培養基目標體積四分之一的磷酸鹽緩沖液，充分攪拌；
b依次加入DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸，充分攪拌；
c用磷酸鹽緩沖液定容至目標體積。
實施例11
制備大規模制備人臍帶間充質干細胞因子用誘導分泌培養基的方法，，包括以下步驟：
a取配置培養基目標體積四分之一的磷酸鹽緩沖液，充分攪拌；
b1依次加入DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸，充分攪拌；
b2依次加入三磷酸腺苷、三磷酸鳥苷、環磷酸鳥苷、NaNO3和甘油，充分攪拌；
b3加入脂肪醇聚氧乙烯醚充分攪拌，依次加入亞麻酸和二十二碳六烯酸，充分攪拌；
c用磷酸鹽緩沖液定容至目標體積。
對照例1
大規模制備人臍帶間充質干細胞因子用誘導分泌培養基，大規模制備人臍帶間充質干細胞因子用誘導分泌培養基，主要由DMEM、D-葡萄糖和L-抗壞血酸溶解于磷酸鹽緩沖液而成，DMEM、D-葡萄糖和L-抗壞血酸在誘導分泌培養基中的濃度分別為100ml/L、10g/L、50μmol/L。
對照例2
大規模制備人臍帶間充質干細胞因子用誘導分泌培養基，主要由DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和D-葡萄糖溶解于磷酸鹽緩沖液而成，DMEM、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸和D-葡萄糖在誘導分泌培養基中的濃度分別為800ml/L、10μmol/L、20g/L。
對照例3
與實施例4的不同之處在于，誘導增強劑在誘導分泌培養基中的濃度為1g/L，所述誘導增強劑包括10重量份的三磷酸腺苷、10重量份的三磷酸鳥苷。
對照例4
與實施例4的不同之處在于，誘導增強劑在誘導分泌培養基中的濃度為5g/L，所述誘導增強劑包括10重量份環磷酸鳥苷和5重量份的NaNO3。
對照例5
與實施例7的不同之處在于，所述分泌增強劑在誘導分泌培養基中濃度為0.1g/L，所述分泌增強劑包括20重量份的甘油、20重量份的亞麻酸。
對照例6
與實施例7的不同之處在于，所述分泌增強劑在誘導分泌培養基中濃度為1g/L，所述分泌增強劑包括50重量份二十二碳六烯酸和10重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
實驗例誘導分泌培養基對于人臍帶間充質干細胞分泌活性因子的影響
取人臍帶間充質干細胞的4代細胞，消化計數后，按2×104/ml密度接種與市售的間充質干細胞無血清培養基MSCSFMGIBCOA10332-01，于三氣培養箱37℃、5％CO2、20％O2培養。培養72h，細胞長至80％融合，此時棄掉無血清培養基。按無血清培養基一半體積添加誘導分泌培養基，調整培養參數為37℃、5％CO2、5％O2。24h后調整培養參數為37℃、5％CO2、20％O2。48h后取出一半誘導分泌培養基用于制備細胞因子，同時補加等量誘導分泌培養基放回三氣培養箱繼續培養，調整培養參數為37℃、5％CO2、5％O2。72h后取出全部誘導分泌培養基，用于制備細胞因子。通過無菌泵將培養液泵至中空纖維膜微濾過濾器中的0.1μm空纖維微濾膜，循環過濾，以除去死細胞及碎片，濾液用無菌泵泵至流超濾膜包(截留分子量5kD)，循環過濾至原體積1/50。用磷酸鹽緩沖液補至原體積繼續超濾。循環過濾至原體積1/50后，用生理鹽水補至原體積繼續超濾，體積濃縮為原體積1/50后，移至生物安全柜，在生物安全柜中將純化濃縮液收集至合適離心管，稀釋至合適濃度后，取樣，ELISA法測定VEGF(血管內皮生長因子)、BDNF(腦源性神經營養因子)、GDNF(膠質源性神經營養因子)、bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)的濃度，試劑盒購自Thermo Fisher Scientific。
活性因子的濃度為檢測結果按照稀釋濃度折算后的濃度。使用的誘導分泌培養基為實施例1-9和對照例1-6的培養基，每個培養基重復三次，活性因子濃度取平均值。
表1誘導分泌培養基對于人臍帶間充質干細胞分泌活性因子的影響
從表1可以看出，活性因子VEGF(血管內皮生長因子)、BDNF(腦源性神經營養因子)、GDNF(膠質源性神經營養因子)、bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)的濃度，實施例1-3顯著高于(P<0.05)對照例1-2，說明DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸合適濃度配置成的培養基在大規模制備人臍帶間充質干細胞因子中能夠有效誘導分泌生長因子；實施例4-6顯著高于(P<0.05)對照例3-4說明，誘導增強劑三磷酸腺苷、三磷酸鳥苷、環磷酸鳥苷和NaNO3能夠促進誘導分析活性因子；實施例7-9顯著高于(P<0.05)對照例5-6說明，分泌增強劑甘油、亞麻酸、二十二碳六烯酸和脂肪醇聚氧乙烯醚能夠進一步促進誘導分析活性因子。
以上僅為本發明的實施例而已。對于本領域的技術人員來說，很容易根據上述披露的精神對這些實施例作出多種更改和變化。這些更改和變化均包含在本申請權利要求書限定的范圍之內。