本發明涉及屬于生物醫藥領域，具體涉及一種治療腦部損傷類疾病的神經干細胞注射液和制備方法及其使用方法。
背景技術：
：小兒腦癱通常指出生前到出生后一個月內由各種原因引起的非進行性腦損傷或腦發育異常所導致的中樞性運動障礙。臨床上以姿勢與肌張力異常、肌無力、不自主運動和共濟失調等為特征，常伴有感覺、認知、交流、行為等障礙和繼發性骨骼肌肉異常，并可有癲癇發作，該病目前無理想的治療手段，致殘率高，給患者本人及家庭造成的精神負擔和經濟負擔重。根據衛生部發布的數據計算，我國每年新生兒1600萬人，據不同統計，小兒腦癱發病率在千分之二到千分之五左右，即每年3-8萬人；而由于以往人口出生率高、醫療條件落后導致發病率高、治愈率低等原因，有報道稱我國已有累積小兒腦癱患者500萬人。因此該病危害十分嚴重。小兒腦癱目前常用的治療方式有物理治療、作業治療、家庭訓練、矯形器等。常用的藥物有腦神經營養藥、肌肉松弛劑等，然而藥物治療只有在必要時才使用，它不能替代功能性訓練。注射用鼠神經生長因子是被SFDA批準的一種生物制劑，提取自小鼠的頜下腺，與人的同源性達90％，采用肌肉注射的方式給藥，據報道對小兒腦癱引起的肌張力、運動發育、姿勢異常、反射異常等癥狀有一定改善效果。目前所有的治療小兒腦癱的藥物大多為提供營養，緩解癥狀，不能達到治療的目的。也就是說，目前市場上并沒有特異性治療小兒腦癱的有效藥物。在臨床上通常采取藥物和運動康復相結合的辦法。最近CFDA批準的一種注射用鼠神經生長因子生物制劑用于小兒腦癱的治療，該藥物來源于小鼠的額下腺，與人的同源性達90％，采用肌肉注射方式給藥，據報道對小兒腦癱引起的肌張力，運動發育，姿勢異常，反射異常等癥狀有一定改善效果。腦損傷主要還包括腦中風和創傷性腦損傷，國內外已有大量臨床前實驗研究表明神經干細胞(NSC)對于腦中風和創傷性腦損傷有一定的治療效果。并且有部分臨床試驗證明NSC移植能夠治療腦損傷。神經干細胞(NSC)是一群較原始的、能自我更新并具有多種分化潛能的細胞,可分化成神經元、少突膠質細胞和星形細胞。在生理條件下,體內的NSC通常保持靜息狀態；神經損傷后,內源性NSC可因微環境的改變而被激活、遷移和分化,以替代損傷的細胞和重建神經環路；遺傳修飾后,外源性NSC移植顯示了很大的治療潛力,為腦損傷的治療提供了新的手段。技術實現要素：本發明的目的在于克服上述現有技術存在的不足，一種治療腦部損傷類疾病的神經干細胞注射液和制備方法及其使用方法。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：本發明涉及一種治療腦部損傷類疾病的神經干細胞注射液的制備方法，所述方法包括如下步驟：S1：原代細胞培養：將原代神經干細胞用無血清培養基對細胞懸液進行培養擴增；其中，原代神經干細胞的來源為哺乳動物、靈長類動物或嚙齒類動物的神經干細胞中的一種或幾種；所述原代神經干細胞為手術分離廢棄胎腦組織的皮層組織，然后消化酶將組織消化離心獲得原代神經干細胞懸液；原代神經干細胞的來源方法包括IPSC誘導、提取胚胎干細胞、提取人類視網膜色素上皮細胞或提取神經組織器官以外的其他器官或組織干細胞。優選的，原代神經干細胞的來源為醫療廢棄的人源胎腦皮層組織的神經干細胞。這種來源為完全100％人源，是一種單一的干細胞產品，用自主研發的無血清培養基和培養工藝，在體外培養到P3代，干細胞純度可達95％以上，神經干細胞活性在90％以上。優選的，所述原代神經干細胞為手術分離廢棄胎腦組織的皮層組織，細胞消化計數后，采用無血清完全培養基進行重懸，并調整密度為1x105個/ml，然后接種至超低吸附培養瓶中，放入35℃5％CO2中環境中進行培養。其中，無血清培養基是由DMEM/F12，B27，N2，以及神經營養因子BFGF,EGF,LIF組成，無任何動物源血清成分。S2：神經干細胞純化及擴大培養：將擴增滿的原代神經干細胞進行消化、傳代，直至傳到第5代,并鑒定細胞純度達95％以上后，作為種子細胞；P5到P8代都可作為種子細胞，種子細胞可以凍存，便于保存。所述擴增滿為至細胞直徑超過300μm，然后進行消化傳代至P1代神經干細胞；培養方法為連續培養10-14天，期間每24小時進行觀察，確認細胞生長狀態正常，每隔48-72小時進行換液；懸浮培養和貼壁培養的神經干細胞在顯微鏡下的形態見圖1。P1代神經干細胞消化后接種至超低吸附培養瓶中，放入35℃5％CO2的環境中進行培養至傳代，重復消化、接種、培養的過程直至傳代到P5代神經干細胞；所述培養方法為每間隔48-72小時進行換液，連續培養10-14天。將P5代神經干細胞進行細胞特性和異源物質檢測，細胞特性鑒定包括流式鑒定神經干細胞表面標記物SOX2和NESTIN,檢測其純度達95％以上，見圖2。熒光免疫的方法鑒定神經干細胞特性和純度為95％以上，并具有多種分化潛能，能夠分化為神經元，星型膠質細胞和少突膠質細胞。異源物質主要是微生物的檢測，包括無菌檢測，支原體和內毒素檢測，其結果陰性為合格，檢測合格后將細胞凍存作為種子細胞。S3：神經干細胞工作細胞庫的建立：將步驟S2中的種子細胞，計數并無血清培養基懸浮培養，待培養瓶細胞融合到80％—90％，將細胞消化傳代，如此反復直至細胞傳代P9代；S4：神經干細胞注射液的制備：將步驟S3中的P9代細胞加生理鹽水定容或負載于微載體，制成臨床用神經干細胞注射液。優選的，步驟S3的懸浮培養的方法包括以下步驟：具體方法參見申請號為201110173821.1的專利。(a)將神經干細胞接種在包含bFGF和EGF的DMEM/F12或DMEM培養基中培養；(b)2、3或4天后在培養基中添加5-20％體積的營養補充液并繼續培養，其中所述營養補充液是包含1×B27添加劑，1×N2添加劑，1.0-3.0mMol/L的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mMol/L的丙酮酸鈉，0.5-1.5mMol/L的NAC，50-150ng/ml的bFGF，50-150ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的LIF的DMEM/F12或DMEM培養基；(c)監測培養基中形成的神經球直徑，當60％以上、優選70％以上神經球直徑高于閾值時，分離直徑高于所述閾值的神經球，消化后收獲，其中所述閾值為200-500μm，例如為250μm、300μm、350μm、400μm或450μm；(d)未挑中的直徑小于所述閾值的剩余細胞保留在原培養基中，將培養基移除1/2-1/4體積，然后添加與移除體積相同體積的(a)中所述的包含bFGF和EGF的培養基繼續培養；(e)在(a)接種神經干細胞10、11、12、13、14或15天后通過合并(c)中收獲的細胞和(d)繼續培養所得的細胞而收獲細胞。優選的，步驟S4中，所述微載體包括脂質體、微膠囊或微球載體。上述的制備方法制成的治療腦部損傷類疾病的神經干細胞注射液。上述的神經干細胞注射液中包含大于1×106個神經干細胞。上述的治療腦部損傷類疾病的神經干細胞注射液的使用方法，將所述治療腦部損傷類疾病的神經干細胞注射液植入患者體內；所述植入方法包括定點注射，靜脈回輸、鞘內注射、鼻腔粘膜吸附或肌肉注射。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：1、本發明的神經干細胞注射液可來源自認廢棄的胚胎組織，完全100％人源，是一種單一的干細胞產品，用自主研發的無血清培養基和培養工藝，在體外培養到P3代，干細胞純度可達95％以上，神經干細胞活性在90％以上。2、該發明的神經干細胞在體外可連續傳代到第32代并保持良好的干性和分化潛能。對數期細胞倍增時間最快可達16-24小時，活率95％以上。3、體外擴增能力強，增值倍數(每傳代一次)可最高達8-10倍。自主開發的凍存復蘇技術，細胞凍存后復蘇率可達90％以上，便于神經干細胞制劑的制備和儲存。4、體外分化為神經元和少突膠質細胞能力較強。在無誘導分化下，此神經干細胞分化為神經元的比例為75％-80％(遠高于其他同類產品，大部分神經干細胞自發分化神經元的比例在20％左右)，分化為少突膠質細胞的比例為4％以上(其他神經干細胞自發分化為少突膠質細胞較少，1％以下)。5、該發明的神經干細胞可以來源于IPS,胚胎干細胞，不同來源間充質干細胞轉化得到的神經干細胞，具有大腦皮層來源的神經干細胞。6、哺乳動物來源的神經干細胞注射液7、該注射液用于治療小兒腦癱，腦卒中，急慢性腦損傷8、鼻腔粘膜吸附的給藥方式和紋狀體定點給藥治療腦損傷和小兒腦癱9、體外免疫學反應測試顯示，此神經干細胞對外周淋巴細胞沒有明顯的刺激作用，具有較低的免疫原性。10、藥效學實驗表明此神經干細胞注射液鼻腔或腦內給予可改善腦損傷大鼠的運動平衡能力和腦損傷面積。移植的神經干細胞可在腦內存活35天以上，并分化為神經元。所有實驗動物未出現免疫反應和意外死亡，顯示了較好的安全性。附圖說明圖1為懸浮培養的神經干細胞球和正在分裂增殖的單個神經干細胞；圖2為流式檢測鑒定神經干細胞純度為95％以上；圖3為鼻腔給予神經干細胞后第42天腦組織的切片的CV染色圖，比例尺為2mm；圖4為腦梗死面積百分比；圖5為hNSC能夠改善HI損傷后大鼠的感覺，學習，記憶和認知能力。圖(A)為HI造模、hNSCs給藥以及各種行為測試的時間安排；圖(B-C)為sham+saline(n＝23),sham+hNSCs(n＝24),HI+saline(n＝17)andHI+hNSCs(n＝17)各組大鼠的翻正反射(B)和步態分析(C)的表現；圖(D)為各組大鼠的走網試驗的表現(N＝12/組)；圖(E-H)為SCT的表現；圖6為Morris水迷宮的表現，左圖為訓練時間，右圖為目標象限所花費的時間；圖7hNSCs能夠調節NF-κB信號傳導，并降低IL-1β的表達。(A，C，E，G)為對應的westernblot條帶。(B，D，F，H)為各條帶表達的相對強度；圖8為行為學觀察圖；圖A體重(BWT)、圖B平衡木實驗(BBT)、圖C身體抬高搖擺實驗(EBST)、圖DBederson評分實驗數據分別用GraphPad5.0作圖；圖9腦梗死面積結果。具體實施方式下面結合實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干調整和改進。這些都屬于本發明的保護范圍。實施例1：制得原代神經干細胞1、從胚胎干細胞(ESCs)誘導獲得原代神經干細胞使用細胞刮挑取ESCs細胞克隆，輕柔吹散，然后使用神經干細胞誘導液重懸，轉移至超低吸附培養皿中進行懸浮培養3天左右，收集形成的細胞球，輕柔吹散，再用神經干細胞誘導液進行重懸，超低吸附培養皿中再次懸浮培養3天，收集形成的細胞球；將提前一天使用Laminin包被的培養皿用不含Ca、Mg的DPBS洗滌2次，將收集的細胞球用神經干細胞完全培養基進行重懸，接種于包被好的培養皿中進行貼壁培養，每2-3天進行換液，直至形成明顯的神經樣集落，然后使用細胞刮收集形成的集落，并使用accutase將其消化成為單個細胞，用神經干細胞完全培養基進行重懸，懸浮培養，使其形成神經干細胞球，獲得的神經干細胞球可以消化進行傳代，也可以進行液氮凍存。2、從誘導多能干細胞(iPSCs)誘導獲得原代神經干細胞挑取iPSCs細胞克隆，將細胞輕柔吹散并使用不含bFGF和EGF的完全培養基進行重懸，轉移至超低吸附培養皿中進行懸浮培養7天左右，每2-3天進行半量換液，然后離心收集形成的細胞球。將提前一天使用Laminin包被的培養皿用不含Ca、Mg的DPBS洗滌2次，將收集的細胞球用含有并接種于包被好的培養皿中進行貼壁培養，每2-3天進行換液，直至形成明顯的神經樣集落，然后使用細胞刮收集形成的集落，并使用accutase將其消化成為單個細胞，用神經干細胞完全培養基進行重懸，懸浮培養，使其形成神經干細胞球，獲得的神經干細胞球可以消化進行傳代，也可以進行液氮凍存。3、人源廢棄胚胎組織獲得原代神經干細胞1)胚胎組織獲取將完整的胚胎/廢棄胎兒置于100mm無菌培養皿的hibernationmedium緩沖溶液中，用緩沖液反復沖洗。在解剖鏡下，一手持眼科鑷，另一手持眼科剪，剝離頭部皮膚和骨骼，打開顱腔，暴露腦組織,用精細手術鑷撕去腦組織周圍血管膜。用精細手術鑷夾斷腦皮層的邊緣，分離腦皮層，放入35mm無菌培養皿的緩沖溶液中。再用精細手術鑷將腦皮層分割成約1mm大小的組織塊。將取材得到的人胚胎/胎兒腦皮層和緩沖溶液用無菌一次性3ml滴管轉移進入一個或多個15/50ml離心管，靜置5分鐘，使組織塊充分沉淀到管底，盡量吸棄上清。然后用無菌注射器和0.22um濾膜進行無菌過濾，直接濾入離心管中，每個15ml離心管中需5ml消化液，之后進行輕微晃動。將離心管放入35℃二氧化碳培養箱消化，每5分鐘手動振蕩一次，消化30分鐘后，離心300g，5分鐘，20℃。最后用無菌一次性3ml滴管吸棄上清至約50ul處，用1ml槍頭吸取950ul緩沖溶液加入離心管，輕柔吹吸10－15次，以致形成單細胞懸液。2)接種配制的神經干細胞培養液20ml并加入低吸附T75培養瓶中。根據計數得到的懸液細胞密度和200個/ul的最終細胞接種密度，計算需接種的細胞懸液的體積。用無菌一次性吸管混勻細胞懸液，用合適量程的移液槍在液面下再吹打，取出計算體積的單細胞懸液，迅速加入低吸附T75培養瓶中，并輕輕從不同方向晃動容器，使細胞在培養液中均勻分布。將接種后的T75培養瓶迅速放入二氧化碳培養箱中，培養溫度為35℃，二氧化碳濃度為5％。4)原代細胞培養原代細胞接種培養后，根據細胞生長情況及培養液外觀，按照《神經干細胞培養加液標準操作程序》每過2-3天，從二氧化碳培養箱中取出T75培養瓶，放入生物安全柜中。用2ml的無菌移液管，取出已配置好的神經干細胞培養營養補充液2ml，迅速加入低吸附T75培養瓶中，并輕輕從不同方向晃動，使細胞均勻分布。將加好補液的低吸附T75培養瓶迅速放回二氧化碳培養箱中，培養溫度為35℃，二氧化碳濃度為5％。5)細胞收獲神經干細胞培養至7-10天，觀察細胞生長狀態，用無菌吸管將低吸附T75培養瓶中的神經球和培養液吸入50ml離心管中，100g，4℃，離心10min，使神經球充分沉淀到管底，盡量吸去上清,將吸取的上清液放入無菌容器中，得到原代神經干細胞。實施例2：P1-P5代神經干細胞的制備1、原代神經干細胞傳代與培養將已配好的10ml無菌神經消化液用無菌注射器注入裝有原代神經干細胞球的離心管中。將離心管口用parafilm膜密封，靜置3分鐘。加入準備好的除菌神經組織消化液，放入35℃的二氧化碳培養箱中作用30分鐘(每10分鐘手動震蕩一次5秒)。低溫離心機4℃，300g，離心10分鐘。用無菌一次性吸管吸棄上清，用大功率移液器和移液管加入1·-5mLDMEM/F12沖洗，上下吹打2-3次，使組織分離。低溫離心機4℃，300g，離心10-20分鐘。重新加入1-5mLhibernationmedium洗滌，共洗滌三次。用無菌一次性吸管吸棄上清。加入1-5mLDMEM，使細胞沉淀懸浮均勻，注意不要產生氣泡使細胞沉淀懸浮均勻，用于后續計數操作。1.1細胞計數按照《細胞密度測定標準操作程序》對單細胞懸液進行計數。1.2傳代與培養根據計數得到的懸液細胞密度，計算需接種的細胞懸液的體積。將三個低吸附T75培養瓶中加入10-30ml的神經干細胞培養液。用無菌一次性吸管混勻細胞懸液，用合適量程的移液槍在液面下再吹打，取出計算體積的單細胞懸液(根據計數得到的懸液細胞密度和50-500個/ul的最終細胞接種密度)，迅速加入低吸附T75培養瓶中，并輕輕從不同方向晃動，使細胞在培養液中均勻分布。將接種后的低吸附T75培養瓶迅速放入二氧化碳培養箱中，培養溫度為35℃，二氧化碳濃度為5％。2、細胞的收獲與凍存P2細胞接種培養后，根據細胞生長情況及培養液外觀，按照《神經干細胞培養加液標準操作程序》每過2-3天，從二氧化碳培養箱中取出T75培養瓶，放入生物安全柜中。用2ml的無菌移液管，取出已配置好的神經干細胞培養營養補充液2ml，迅速加入低吸附T75培養瓶中，并輕輕從不同方向晃動，使細胞均勻分布。將加好補液的低吸附T75培養瓶迅速放回二氧化碳培養箱中，培養溫度為35℃，二氧化碳濃度為5％。得到P2代細胞。2.1消化收獲用無菌吸管將低吸附T75培養瓶中的神經球和培養液吸入50ml離心管中，100g，4℃，離心10min，使神經球充分沉淀到管底，盡量吸去上清,將吸取的上清液放入無菌容器中做好標記存放于4℃冰箱中儲存備用。2.2洗滌將已配好的5-50ml無菌神經消化液用無菌注射器注入裝有P2神經球的離心管中。將離心管口用parafilm膜密封，靜置3分鐘。加入準備好的除菌神經組織消化液，放入35℃的二氧化碳培養箱中作用10-50分鐘(每10分鐘手動震蕩一次5秒)。低溫離心機4℃，300g，離心10分鐘。用無菌一次性吸管吸棄上清，用大功率移液器和移液管加入5mLDMEM/F12沖洗，上下吹打2-3次，使組織分離。低溫離心機4℃，300g，離心5-30分鐘。重新加入1-10mLhibernationmedium洗滌，共洗滌三次。2.3過濾和細胞計數用無菌一次性吸管吸棄上清。加入2mLDMEM，使細胞沉淀懸浮均勻，按照《細胞密度測定標準操作程序》對單細胞懸液進行計數。2.4P2代到P5代細胞培養將消化后的P2代細胞按1×105個/ml的密度接種到T75培養瓶中，培養過程和消化過程與P1代細胞相同，待細胞生長到80％以上的時候進行消化，計數和傳代，以此類推，直至獲得P5代細胞的獲得。2.4細胞凍存分裝鑒定細胞純度達95％以上后，用無菌吸管將低吸附T75培養瓶中的神經球和培養液吸入50ml離心管中，100g，4℃，離心10min，使神經球充分沉淀到管底，盡量吸去上清,將吸取的上清液放入無菌容器中做好標記存放于4℃冰箱中儲存備用2.5程序性降溫使用程序降溫儀進行程序降溫：將需凍存的細胞放置于程序性降溫儀中按照標準凍存程序將至-80以下℃。2.6細胞入庫凍存結束后，將凍存盒取出轉移到液氮罐中貯存。實施例3P6-P9代神經干細胞的制備1、細胞的復蘇從液氮罐中取出凍存的細胞，放入電熱恒溫水槽中的復蘇架上(水溫保持在40左右)，快速晃動復溫。由固態變成液態時，復蘇即完成。1.1細胞的洗滌將離心管口用parafilm膜密封，靜置3分鐘。加入準備好的除菌神經組織消化液，放入35℃的二氧化碳培養箱中作用5-60分鐘(每10分鐘手動震蕩一次5秒)。低溫離心機4℃，300g，離心10分鐘。1.2取樣計數和洗滌用無菌一次性吸管吸棄上清，用大功率移液器和移液管加入1-10mLDMEM/F12沖洗，上下吹打2-3次，使組織分離。低溫離心機4℃，300g，離心10分鐘。重新加入1-10mLhibernationmedium洗滌，共洗滌三次。用無菌一次性吸管吸棄上清。1.3傳代與培養將1:3接種于低吸附T75培養瓶中加入5-50ml的神經干細胞培養液。用無菌一次性吸管混勻細胞懸液，用合適量程的移液槍在液面下再吹打，取出計算體積的單細胞懸液(根據計數得到的懸液細胞密度和10-500個/ul的最終細胞接種密度)，迅速加入低吸附T75培養瓶中，并輕輕從不同方向晃動，使細胞在培養液中均勻分布。將接種后的低吸附T75培養瓶迅速放入二氧化碳培養箱中，培養溫度為35℃，二氧化碳濃度為5％。2、種子細胞的傳代P5細胞接種培養后，根據細胞生長情況及培養液外觀，每過2-3天，從二氧化碳培養箱中取出T75培養瓶，放入生物安全柜中。用2ml的無菌移液管，取出已配置好的神經干細胞培養營養補充液1-5ml，迅速加入低吸附T75培養瓶中，并輕輕從不同方向晃動，使細胞均勻分布。將加好補液的低吸附T75培養瓶迅速放回二氧化碳培養箱中，培養溫度為35℃，二氧化碳濃度為5％。2.1消化神經干細胞培養至7-10天，觀察細胞生長狀態，達到平臺期(細胞經連續2日觀察，增值緩慢或停滯)進行傳代操作。按照《神經球消化標準操作程序》進行。其中6瓶T75用于1:3繼續傳代培養，其余按照《神經干細胞凍存標準操作程序》凍存。2.2細胞計數將細胞吹打成單個神經干細胞，取10ul在細胞自動計數儀上計數。2.3傳代與培養將消化后的單個神經干細胞，按著0.1-10*105個/ML的濃度接種繼續培養，在T75瓶中混勻培養，放入二氧化碳培養箱中,待培養瓶細胞融合到80％—90％，將細胞消化傳代，如此反復直至細胞傳代P9代。實施例4:P6-P9代神經干細胞注射液的制備將凍存的P5-P8神經干細胞按著實施例3的方法進行復蘇，計數后接種，在T75培養瓶中培養，根據細胞生長情況及培養液外觀，每過2-3天，從二氧化碳培養箱中取出T75培養瓶，放入生物安全柜中。用2ml的無菌移液管，取出已配置好的神經干細胞培養營養補充液1-5ml，迅速加入低吸附T75培養瓶中，并輕輕從不同方向晃動，使細胞均勻分布。將加好補液的低吸附T75培養瓶迅速放回二氧化碳培養箱中，培養溫度為35℃，二氧化碳濃度為5％。待神經干細胞培養10-14天，觀察細胞生長情況，如細胞融合達到85％以上，即可消化細胞，用無菌吸管將低吸附T75培養瓶中的神經球和培養液吸入50ml離心管中，100g，4℃，離心10min，使神經球充分沉淀到管底，盡量吸去上清,將吸取的上清液放入無菌容器中做好標記存放于4℃冰箱中儲存備用。需要時取出裝有神經干細胞的離心管，加入50ml生理鹽水，細胞混勻后離心，4℃，離心10min。離心后取上清，再次重復以上步驟，共計洗滌2次，然后加入1ml生理鹽水進行細胞計數，最后用生理鹽水定容成1×106個細胞/ml的神經干細胞注射液。此注射液可用于動物實驗和臨床實驗治療腦部損傷類疾病。實施例5：小兒腦癱動物模型研究1、實驗動物動物：SPF級出生后7天的SD大鼠(13-19g，雌雄各半)2、造模(HI)乙醚麻醉，動物固定并暴露左側頸總動脈，用電凝器進行橫斷，待其恢復1.5小時，然后在7.8％O2/92.2％N2的低氧箱中進行缺氧2小時(HI)。3、干細胞治療HI造模后24小時鼻腔給藥，細胞數共3x105/6ul，左右各3ul，兩次間隔時間5min。4、實驗分組正常對照組1(正常組)——給予生理鹽水正常對照組2——ANGE-S001HI模型對照組(模型組)——給予生理鹽水HI模型給藥組(ANGE-S001組)——ANGE-S001給藥ANGE-S001配制過程：將鮮活的P9代神經干細胞3x105溶于6ul生理鹽水中。5、療效檢測和機理探索(1)鼻腔給予神經干細胞注射液3h后，PKH-26(紅)標記的hNSC(3×105細胞/動物)在SD大鼠頭部的在體生物發光，SD大鼠頭部的在體生物發光成像明顯；腦中總的熒光強度明顯強于生理鹽水給藥組；神經干細胞在腦內主要分布在嗅球，皮質，胼胝體和海馬區域。(2)hNSCs對腦損傷的長期影響。見圖3。切片中腦損傷的面積和損傷對側的腦面積均進行了計算，見圖4?？梢奾NSCs給予后能顯著減少HI造成的組織損傷(模型組大鼠5只，神經干細胞組大鼠6只)。。神經干細胞給予后能明顯減少HI引起的腦梗死面積。(3)hNSC能夠改善HI損傷后大鼠的感覺，學習，記憶和認知能力。見圖5。由圖(B)可見在給藥后第3天，神經干細胞能顯著降低翻正實驗所需的時間。由圖(C)可見在給藥后第5天，神經干細胞能顯著降低步態分析的時間。需要注意的是HI+hNSCs組的老鼠和假手術組在交流和好奇心上表現出一致的偏好，而HI+生理鹽水組剛好相反。和HI+saline組大鼠不同，HI+的hNSCs組大鼠與假手術組大鼠表現出相似的nose-point(圖G)和ceter-point(圖H)指數。(4)在獲得性試驗中，HI+saline組大鼠的潛伏期明顯比HI+hNSCs組和假手術組大鼠長。在保留試驗中，HI+saline組大鼠和sham+saline組和HI+hNSCs組大鼠相比，在目標象限所花費的時間和跨越平臺的頻率都顯著降低，見圖6。(5)鼻腔給藥后第3天采用westernblot對IL-1β，磷酸化IκBα，和NF-κBp65的表達，見圖7。如圖7所示，HI損傷增加了細胞內IL-1β，磷酸化IκBα和NF-κBP65的表達，而hNSCs能逆轉這一過程。對于細胞核NF-κB，hNSCs能顯著的增強其表達。實施例6：腦損傷MCAO動物模型研究1.實驗動物動物:成年SD大鼠(220-250，雌雄各半)，共40只2.造模(MCAO)術前禁食不禁水12h。動物用10％戊巴比妥鈉(32mg/kg)腹腔注射麻醉。參考改進的ZeaLonga方法造模，缺血達到2h后小心抽出栓線，即形成再灌注。假手術對照只是不插入尼龍魚線，其余步驟同手術組。在手術后保持體溫在(37±0.5)℃。模型制作成功標準：參照Bederson確立的5級評分法，對大鼠的神經功能缺損進行評分。在MCAO大鼠造模2h后，對大鼠的神經功能進行評分，評分在1-3級者定為造模成功小鼠，0級和4級者棄去。3、神經干細胞治療MCAO造模后24小時鼻腔給藥，NSC雙側鼻腔給藥，每側3ul，給藥后保持姿勢5min，間隔15min。實驗分組組別數量(只)劑量(細胞/體積)注射方式1正常組6生理鹽水/6ul雙側，造模后1,3,7天2模型組5生理鹽水/6ul雙側，造模后1,3,7天3人源NSC71*106個/6ul雙側，造模后1,3,7天4鼠源NSC101*106個/6ul雙側，造模后1,3,7天5.行為學觀察造模后第1d、3d、5d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d分別進行Bederson評分，EBST實驗、平衡木實驗，每次同步記錄體重數據。見圖8。Sham組與MCAO+NS、MCAO+hNSC.、MCAO+rNSC.組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；MCAO+NS組與MCAO+hNSC.組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；MCAO+NS組與MCAO+rNSC.組比較：無差異；MCAO+hNSC.組與MCAO+rNSC.組比較：^P＜0.05，^^P＜0.01。6.腦梗死面積結果由圖9可見，腦組織切片結果，神經干細胞組能顯著修復腦損傷引起腦梗死。當前第1頁1 2 3