本發明涉及醫用水凝膠材料技術領域，尤其涉及一種可用作創傷敷料支架材料的二氧化硅復合水凝膠的制備方法。

背景技術：

皮膚是人體與外界的物理、化學和生物屏障，皮膚的損傷會破壞這種屏障，引起新陳代謝加劇、體溫下降、水分和蛋白質的過度流失及細菌感染等，嚴重的甚至危及生命。因此有必要在創傷處以適當的敷料加以遮蓋，以保護傷口、降低感染風險、促進創面愈合?；诟稍锃h境有利于創面愈合的傳統理論，紗布、棉球等是較早使用的敷料，雖有一定的吸濕和保護作用，但易粘連傷口，在更換時易造成二次損傷，給患者帶來更多痛苦，其本身也不具有阻止細菌入侵和促進傷口愈合作用。

1962年，倫敦大學的Winter博士論證了濕潤環境對創面愈合的積極作用(參見Winter,G.D.,《自然》1962，193,293-294)，隨后大量的動物及臨床研究也表明濕潤的環境傷口愈合的更快，而且，濕潤的環境也有助于抑制疤痕的形成，因此濕性敷料受到了更多地關注。相繼發展了薄膜型、泡沫型、水凝膠型、水膠體型敷料，每種敷料的特點和適應創傷情況不同。其中水凝膠型敷料具有三維網絡結構，與細胞外基質的結構相似；水分含量高、柔軟、有彈性，與生物液體產生的界面張力低。用作創面敷料時，透水、透氣且能控制水分蒸發，不會造成敷料與創面之間的積液。與創面無粘連，能夠減輕更換敷料時的疼痛(李晶等，《中國組織工程研究》，2013,17，2225-2232)。此外，水凝膠還具有藥物釋放載體的功能，可根據需要將具有消炎作用的藥物分子或促進傷口愈合的活性因子包埋在水凝膠內，從而達到消炎抑菌和促進創面愈合的目的(王剛等，《中國藥房》，2011，22,1217-1220)。因此，水凝膠敷料成為最受人們重視的創傷敷料之一。

作為創傷敷料，水凝膠設計需要考慮的兩個重要原則是機械性能和生物功 能性。而現今高分子水凝膠最大的缺點是相對較低的機械強度，因此在保持含水量的前提下提高凝膠的機械強度成為當前研究重點。可以通過交聯、結晶、聚合物互穿網絡或與其它材料復合等方法加以改善，其中，有機-無機復合水凝膠無論是在力學性能還是在生物功能上均具有顯著優勢。盡管水凝膠敷料能夠與創面有較好的貼合，但由于無粘性，與創面之間難以形成封閉環境，還是存在細菌侵入的風險。因此，采用抗菌材料形成水凝膠或在水凝膠中添加抗菌活性成分，也是水凝膠敷料設計應該重視的一個問題。近些年來，一些陽離子型肽分子的抗菌活性逐漸被人們所認識(Chen C.等,《生物大分子》，2010,11,402-411)，該類生物分子無毒無刺激性，且不易產生耐藥性，適用于包括耐藥性細菌感染在內的所有創面感染。而且，將抗菌肽采用二氧化硅薄層覆蓋之后，在保持其抗菌活性的同時能夠提高其對熱及生物酶的穩定性(Eby D.M.等，《生物大分子》，2008,9,2487-2494)，這為新型水凝膠敷料的設計提供了靈感。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的制備方法，可作為醫用敷料三維支架材料使用，具有良好且可調控的機械性能，同時能夠負載多種藥物分子或生物活性物質，達到消炎抑菌和促進傷口愈合的功效。

本發明提供了一種短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

1)將兩親性短肽分子溶于水中，超聲分散，調節至指定pH值，在一定溫度下放置使其組裝，得到兩親性短肽自組裝體；

2)將二氧化硅前驅體加入到所述兩親性短肽組裝體溶液中，振蕩使其分散均勻，恒溫放置使其礦化得到短肽/二氧化硅水凝膠；

3)將上述短肽/二氧化硅水凝膠與一定濃度的透明質酸溶液按一定比例混合，使短肽/二氧化硅水凝膠充分吸附透明質酸，得到短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠；

可選的，兩親性短肽的疏水部分由3-10個甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸或異亮 氨酸組成，親水部分由1-3個賴氨酸、精氨酸或組氨酸構成，疏水部分和親水部分通過肽鍵連接；

優選的，兩親性短肽溶解于水后，將pH值調節至3-7的范圍，組裝溫度范圍為15-35℃；

優選的，兩親性短肽在水中能形成穩定的一維組裝體；

可選的，二氧化硅前驅體為正硅酸四甲酯、正硅酸四乙酯、甲基三乙氧基硅烷中的一種或兩種；

優選的，凝膠化反應中二氧化硅前驅體的濃度為5-200mM；短肽組裝體的濃度為0.5-12mM；

優選的，凝膠化反應的溫度為20-50℃；

優選的，透明質酸溶液的濃度為0.01-2wt％，短肽/二氧化硅水凝膠與透明質酸溶液的混合體積比為2:1-10:1；

本發明的另一方面提供了如上述技術方案中任一項所述的一種短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的制備方法所制備得到的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠；

本發明的再一方面提供了如上述技術方案所述的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠作為三維支架材料在醫用敷料中的應用。

本發明提供了一種短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的制備方法，可作為醫用敷料的三維支架材料在創傷修復中應用。與已有的技術相比，本發明具有以下優勢：(1)機械性能的改善：通過二氧化硅層將短肽分子自組裝形成的纖維保護起來，纖維之間主要通過Si-O-Si化學鍵連接形成交聯網絡，這樣一種由一維材料構建的有機/無機復合三維網絡可以大大改善水凝膠的機械強度，且可以通過反應物組成和制備工藝的變化在較大范圍對其強度進行調控；(2)良好的生物學功能：凝膠由陽離子型肽分子、二氧化硅和透明質酸復合而成，在改善凝膠機械強度的同時，提高了其抑菌和保濕能力，促進創傷愈合；(3)兼具藥物負載和釋放功能：凝膠中二氧化硅表面含有大量羥基，便于一些功能分子包括藥物分子、抗菌生物分子或生物活性因子等的負載和緩釋；(4)綠色、簡便的合成工藝：該發明通過仿生礦化與溶膠凝膠相結合的方法制備復合水凝膠， 具有節能環保、工藝簡單、經濟高效的特點。

附圖說明

圖1A為本發明實施例所制備得到的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的數碼照片；

圖1B為本發明實施例所制備得到的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的掃描電子顯微鏡照片；

圖2為本發明實施例所制備得到的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的流變曲線；

圖3為本發明實施例所制備得到的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的保水性曲線；

圖4為本發明實施例所制備得到的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的細胞毒性；

圖5A為本發明實施例所制備得到的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠對于模型藥物分子的負載曲線；

圖5B為本發明實施例所制備得到的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠對于模型藥物分子的釋放曲線。

具體實施方式

下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，以下實例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明。應當指出的是，所描述的僅僅是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明的構思前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發明的保護范圍。

本發明實施例提供了一種短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的制備方法，包括：

S1：將兩親性短肽分子溶于水中，超聲分散，調節至指定pH值，在一定溫度下放置使其組裝，得到兩親性短肽自組裝體；

本步驟中，利用兩親性短肽分子間的非共價相互作用構建一維短肽自組裝 體。具體的，將稱量的短肽粉末溶解于超純水中，超聲助其分散，靜置使其組裝，在下一步使用前要保證其充分組裝，可以利用圓二色光譜和紅外光譜分析其二級結構，利用原子力顯微鏡或透射電子顯微鏡觀察其組裝情況。

S2：將二氧化硅前驅體加入到所述兩親性短肽組裝體溶液中，振蕩使其分散均勻，恒溫放置使其礦化得到短肽/二氧化硅水凝膠。

本步驟中為克服普通的兩親性陽離子短肽水凝膠機械強度差，對熱及生物酶穩定性較差的問題，通過仿生礦化得到由二氧化硅包覆兩親性陽離子短肽的一維納米結構，并進一步交聯形成水凝膠。具體的，取一定量的二氧化硅前驅體分散到所述兩親性短肽組裝體溶液中，并不斷震蕩使其混合均勻，然后置于一定溫度下使其反應。礦化進行的程度可以通過²⁹Si固體核磁中Si-O-Si化學位移的出現與否以及相對強度來決定，也可以通過紅外光譜中1020-1200cm^-1的紅外吸收來判斷。更加直觀的，在TEM中的襯度、纖維直徑以及附帶的能譜儀也能幫助判斷礦化進行的程度。

S3：將上述短肽/二氧化硅水凝膠與一定濃度的透明質酸溶液按一定比例混合，使短肽/二氧化硅水凝膠充分吸附透明質酸，得到短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠。

本步驟中，加入透明質酸的目的是進一步提高復合凝膠的保水性以及生物功能性。在二氧化硅水凝膠中，二氧化硅表面分布著大量羥基，具有較好的保濕性能，而透明質酸由于表面分布著眾多的羥基和羧基，也具有優異的保濕性能，且透明質酸具有優異的生物活性，能促進細胞在其表面的附著和生長，具有促進創傷愈合的作用。只是由于其本身的水溶性而不適合單獨作為敷料來進行使用。在本發明中，通過透明質酸與短肽/二氧化硅水凝膠的復合在增強凝膠機械性能的同時進一步提高其保濕能力和促進創傷修復功能。

在本發明的一實施例中，所述的兩親性短肽疏水部分由3-10個甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸或異亮氨酸組成，親水部分由1-3個賴氨酸、精氨酸或組氨酸構成，疏水部分和親水部分通過酰胺鍵連接。兩親性短肽通過分子間非共價相互作用在水中形成組裝體，親水的賴氨酸、精氨酸或組氨酸在非堿性溶液中容易質子化而使組裝體表面帶有正電荷，通過親疏水單元組成的變化可以調控其組裝體 形態和帶電性質，以及作為模板誘導二氧化硅形成的能力。

在本發明的一實施例中，將兩親性短肽溶解于水后，將pH值調節至3-7的范圍，組裝溫度范圍為15-35℃。在本實施例中，兩親性短肽的組裝依賴于分子間的弱相互作用，包括氫鍵、靜電、疏水相互作用等，因此環境對于組裝結果具有一定影響。可以理解的是可將pH值調節到3,4,5,6,7不等或上述范圍內的其它任何一點均可，本領域技術人員可根據實際情況調節。

在本發明的一實施例中，所選用的二氧化硅前驅體為正硅酸四甲酯、正硅酸四乙酯、甲基三乙氧基硅烷中的一種或兩種。在本實施例中由于不同的二氧化硅前驅體具有不同的水解速率，因此通過一種或者多種前驅體間的調節，可以控制礦化反應速率，再結合其它條件的控制，制備出不同結構和性質的水凝膠。

在本發明的一實施例中，所選用的凝膠化反應中二氧化硅前驅體的濃度為5-200mM；短肽組裝體的濃度為0.5-12mM。不同的短肽和二氧化硅前驅體濃度影響二氧化硅生成的速率、二氧化硅層的厚度及形成凝膠的強度。在本實施例中，為了形成穩定的復合水凝膠，按上述濃度加入二氧化硅的前驅體和肽溶液?？梢岳斫獾氖牵谏鲜龇秶鷥人渲频那膀岓w溶液均可制備得到水凝膠，因此本領域技術人員可根據需要在上述范圍內進行調節，例如二氧化硅前驅體濃度為5mM、10mM、40mM、60mM、100mM、200mM或之間的任一值，短肽濃度為0.5mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、12mM或之間的任一值。

在本發明的一實施例中，所選用的凝膠化反應的溫度為20-50℃。是因為在該溫度下前驅體的水解縮聚速率相對較穩定，便于控制且在礦化過程中形成穩定的結構，同時在該溫度下不會對短肽的生物活性造成比較大的影響?？梢岳斫獾氖?，提高反應溫度可以適當的縮短凝膠化的周期，在上述溫度范圍的任意溫度，均可用以制備水凝膠。

在本發明的一實施例中，所選用的透明質酸溶液的濃度為0.01-2wt％，短肽溶液與透明質酸溶液體積比為2:1-10:1。在本實例中，透明質酸的加入能大大改善凝膠的保水性以及生物活性?？梢岳斫獾氖?，由上述范圍內體積比所制備得 到的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠在強度、保水性能、細胞毒性等方面均符合要求。優選的，短肽/二氧化硅水凝膠與透明質酸溶液的體積比可以為2:1、4:1、6:1、10:1等?？梢岳斫獾氖牵屉?二氧化硅水凝膠與透明質酸溶液的體積比并不局限于上述所列舉的，只要符合上述范圍條件均可。

本發明的另一實施例提供了一種如上述實施例中任一項所述的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的制備方法所制備得到的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠。由本發明實施例制備得到的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠具有以下特點：(1)機械性能的改善：通過二氧化硅層將短肽分子自組裝形成的纖維保護起來，纖維之間主要通過Si-O-Si化學鍵連接形成交聯網絡，這樣一種由一維材料構建的有機/無機復合三維網絡可以大大改善水凝膠的機械強度，且可以通過反應物組成和制備工藝的變化在較大范圍對其強度進行調控；(2)良好的生物學功能：凝膠由陽離子型短肽分子、二氧化硅和透明質酸復合而成，在改善水凝膠機械強度的同時，提高了其抑菌和保濕能力，促進創傷愈合；(3)兼具藥物負載和釋放功能：水凝膠中二氧化硅表面含有大量羥基，便于一些功能分子包括藥物分子、抗菌生物分子或生物活性因子等的負載和緩釋；(4)綠色、簡便的合成工藝：該發明通過仿生礦化與溶膠凝膠相結合的方法制備復合水凝膠，具有節能環保、工藝簡單、經濟高效的特點。

本發明的再一實施例提供了一種如上述實施例中任一項所述的一種短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠作為三維支架材料在醫用敷料中的應用。由本發明實施例制備得到的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠具有良好且可調控的機械性能、抗菌性質及良好的生物相容性以及與功能分子復合的能力，因此可作為醫用敷料的三維支架材料在創傷修復中應用，有望大大提高創面的愈合速度，減輕患者痛苦。

為了更清楚詳細地介紹本發明實施例所提供的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的制備方法，以下將結合具體實施例進行說明。

實施例1

首先將兩親性短肽I₅K溶解于水中，超聲分散，配成濃度為1mM的溶液，并將pH值調節到6使其在20℃組裝；向組裝好的兩親性短肽溶液中加入正硅 酸四甲酯(最終濃度50mM)，振蕩均勻后在20℃反應得到短肽/二氧化硅水凝膠；將所得到的水凝膠與0.5wt％透明質酸溶液混合，最終得到短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠1。

實施例2

首先將兩親性短肽A₆K溶解于水中，超聲分散，配成濃度為4mM的溶液，并將pH值調節到5使其在30℃組裝；向組裝好的兩親性短肽溶液中加入正硅酸四甲酯和三甲氧基硅烷的混合溶液(摩爾比為9:1，總摩爾濃度100mM)，振蕩均勻后使其在30℃反應得到短肽/二氧化硅水凝膠；將所得到的水凝膠與2wt％透明質酸溶液混合，最終得到短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠2。

實施例3

首先將兩親性短肽I₃K溶解于水中，超聲分散，配成濃度為10mM的溶液，并將pH值調節到7使其在25℃組裝；向組裝好的兩親性短肽溶液中加入正硅酸四乙酯(摩爾濃度50mM)，振蕩均勻后使其在25℃反應得到短肽/二氧化硅水凝膠；將所得到的水凝膠與1wt％透明質酸溶液混合，最終得到短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠3。

由上述實施例1-3所制備得到的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠在外觀、三維結構、保水性能和細胞毒性方面比較相似，只是在凝膠強度不同。以下將以實施例3得到的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠3為例進行具體描述。

實施例4

短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的形態及結構表征

通過普通的數碼相機獲得短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的照片，如圖1A所示，所得凝膠質地均勻且無色透明，一方面說明組成凝膠的單元較小，另一方面說明其與水有很好的結合能力。

短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的微觀結構通過掃描電子顯微鏡獲得。所用儀器：日立公司所生產的S-4800冷場發射掃描電子顯微鏡，采用加速電壓5kV。

本實施例結合場發射掃描電子顯微鏡觀察短肽/二氧化硅/透明質酸復合水 凝膠的微觀結構。具體的，首先對凝膠進行預處理，分別用40％、60％、80％、100％的乙醇水溶液進行浸泡，逐步的把凝膠中的水替換成乙醇，通過超臨界干燥在不破壞凝膠空間結構的前提下除去溶劑獲得干凝膠。對樣品噴金1-2min增加導電性，然后放入樣品室，找到樣品并調到適當放大倍率進行掃描拍照。

由圖1B中可以看出，三維凝膠是由一維的納米纖維結構堆積而成。一維納米纖維的直徑在10nm左右，表面較為光滑，反映了二氧化硅是以分子的形式逐步沉積在短肽組裝體表面的。這種無機材料包覆有機組裝體形成的一維結構在強度提高的同時保留了有機組裝體的彈性，因此，由這些一維復合纖維間交聯形成的水凝膠具有良好的機械性能。

實施例5

短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的機械強度測定

采用哈克MARSIII型旋轉流變儀，選用35^。/2的錐板型轉子，測試溫度為25℃。首先采用應力掃描模式在較低頻率下測定儲能模量(G')、耗能模量(G")隨應力的變化情況，選擇合適的線性粘彈區，即G'、G"不隨應力變化而變化的區域，該應力值即為頻率掃描時選定的值。然后采用頻率掃描模式，測試頻率從0.01-10Hz下G'與G"的變化情況，其中G'的值即可以認為是凝膠材料的機械強度。

由圖2中可以看出，G':G">10符合凝膠G':G"的理論值,同時G'的值可以達到100000左右，說明通過該手段制備的水凝膠具有較高的機械強度。另外，通過改變反應物的組成及合成工藝，G'值可在較大范圍內進行調控。

實施例6

短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的保水性能測試

作為醫用敷料，其保水能力對其應用性質有重要影響。本實施例對短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的保水性能進行了測試。具體的，將樣品置于37℃、45％濕度下的恒溫箱中，每12h測試一次凝膠的質量，通過凝膠在一定時間內質量減少的速率來判斷樣品的保水能力。

從圖3可以看出，相比純水，短肽/二氧化硅水凝膠具有一定的保水效果。在復合透明質酸之后，其保水能力進一步提高。純水樣品在60小時的失水率接 近100％，而短肽/二氧化硅/透明質酸在96小時的時候仍能保留30％左右的水分，說明其具有良好的保水能力，能夠滿足作為醫用敷料支架使用的要求。

實施例7

短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的細胞毒性測試

按照實施例3中的反應物組成和工藝條件在96孔聚苯乙烯細胞培養板中成膠，2天后用70％的乙醇水溶液浸泡凝膠樣品，每12h更換一次液體，2天后于超凈臺紫外燈下滅菌半小時后分別用無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)和達爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養基置換數次，然后接種細胞并進行細胞毒性實驗。培養使用DMEM高糖培養基(培養基中含有10％的胎牛血清)培養小鼠的成纖維干細胞(NIH-3T3)，在37℃、5％的二氧化碳氛圍下培養一天后，加入少量噻唑藍(MTT)溶液(濃度為0.5mg/mL)，作用4h后吸棄培養基并加入一定量二甲基亞砜(DMSO)待甲臜完全溶解后于酶標儀中讀取490nm處的吸光度值。通過轉換即可得到細胞在材料中的生長情況。其結果如圖4所示，可以看出，無論是短肽/二氧化硅水凝膠，還是短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠，其細胞存活率均在90％以上，符合醫學上的使用標準。

實施例8

短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的藥物吸附及釋放性質

本實施例中使用的是日本島津公司生產的UV2450型紫外可見分光光度計，設置掃描范圍200-800nm，狹縫寬度1nm，測量速度為中速，測量步長為1nm，取1mL的樣品加入到光程為1cm的比色皿中進行掃描。

本發明中所制備的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠具有藥物負載和緩釋的功能，本實施例通過對不同模型藥物的吸附實驗對其藥物負載能力進行了表征。具體的，將制備好的水凝膠取出，分別浸泡在電正性的中性紅、電中性的羅丹明B和電負性的溴酚藍PBS緩沖溶液中(pH 7.4)，每隔一段時間取樣，并利用紫外分光光度計測試緩沖液中模型藥物分子的含量，且每次測試樣液體回收，通過朗博比爾定律即可計算出凝膠對不同模型藥物分子的吸附量。如圖5A所示，發現短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠對不同電荷的模型藥物均具有一定的吸附能力，且吸附量隨帶電性不同而有一定的差異。

類似的，本實施例對吸附有模型藥物分子的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠的釋放能力進行了驗證。具體的，將吸附模型藥物分子達到飽和的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠樣品，用超純水清洗2-3次，然后加入到5mL的PBS緩沖液，每隔一段時間取出1mL釋放液測試，然后補充1mL的新鮮PBS緩沖液。其累計釋放結果如圖5B所示，可以看出，短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠能夠將吸附的模型藥物分子逐漸釋放出來，且對不同電荷的模型藥物釋放性能也有一定的差異。

綜合以上實施例，通過兩親性短肽的自組裝、仿生礦化以及溶膠凝膠法構筑的短肽/二氧化硅/透明質酸復合水凝膠，具有良好的機械性能、優異的保水性能、較低的毒性和對藥物分子的負載與緩釋能力，適合作為醫用敷料的三維支架材料在創傷修復中進行應用。