本發明涉及醫藥制備技術領域，具體指利拉魯肽在制備治療腎臟纖維化藥物中的應用。

背景技術：

近年來，終末期腎臟病在全球的發病率逐年升高，其預后差、年限長、花費高等特點已成為全球范圍內嚴重危害人類健康、加重經濟負擔的公共衛生問題。終末期腎臟病是各種腎臟疾病引起的腎臟功能不可逆衰退的終末階段，而腎纖維化則是各種腎臟疾病進展為終末期腎臟病的共同途徑，是決定腎功能惡化的關鍵因素之一。因此有效的抑制腎纖維化的發生發展將減少終末期腎臟病的發病率。腎纖維化以大量細胞外基質沉積、腎小管上皮細胞丟失、炎性細胞浸潤及成纖維細胞聚集為特點。目前臨床上使用的治療腎臟纖維化的藥物并沒有取得良好的療效，因此尋找和開發新型抗腎纖維化藥物是很有必要的。

利拉魯肽是一種長效胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物，目前廣泛用于治療2型糖尿病。利拉魯肽能夠以葡萄糖濃度依賴的模式刺激胰島素的分泌從而改善2型糖尿病患者的血糖控制，其作用持續時間長達24小時。利拉魯肽的活性由其與GLP-1受體間特定的相互作用介導。研究表明，GLP-1受體在腎臟、心臟、肺等多種器官組織中也有表達。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供利拉魯肽在制備治療腎臟纖維化藥物中的應用，為腎纖維化的治療提供一種新的藥品。

本發明通過構建小鼠腎纖維化模型，研究利拉魯肽對腎臟纖維化的作用，同時在細胞及分子層面上探討利拉魯肽對腎小管上皮細胞上皮-間質轉化的影響及可能的作用機制。

為實現上述目的，本發明通過利拉魯肽處理單側輸尿管結扎小鼠，小鼠腎臟的HE、Masson及天狼星紅染色結果顯示，UUO小鼠給予利拉魯肽處理后，相比于UUO對照組，腎小管萎縮、凋亡及炎性細胞浸潤和膠原沉積明顯減少。Western blot、RT-PCR和免疫組化分析結果顯示，α-SMA、col-1α、FN在利拉魯肽處理的UUO小鼠中的表達相比UUO對照組明顯下調。本發明的結果證明了，對于經典的腎纖維化模型UUO小鼠，利拉魯肽可以改善其腎臟纖維化狀態，利拉魯肽可以用于制備腎臟纖維化治療藥物。

本發明所述利拉魯肽在制備治療藥物時的給藥途徑為皮下注射。

本發明的有益效果：提供了一種新的腎纖維化藥物——利拉魯肽，利拉魯肽能明顯改善單側輸尿管結扎導致的小鼠腎臟纖維化的發生發展，這種改善作用可能是通過減弱TGF-β/Smad、ERK1/2信號通路的活化從而抑制腎小管上皮細胞發生上皮-間質轉化來實現。

附圖說明

圖1為8周齡C57小鼠行單側輸尿管結扎術和假手術后分別給予利拉魯肽或生理鹽水處理后的腎臟標本的HE、Masson染色分析結果；其中圖1-A為HE染色結果對比圖片；圖1-B為標本損傷評分對比柱狀圖；圖1-C為Masson染色結果對比圖片；圖1-D為標本中膠原纖維所占面積百分比對比柱狀圖。

圖2為8周齡C57小鼠行單側輸尿管結扎術和假手術后分別給予利拉魯肽或生理鹽水處理后的腎臟標本的免疫組化及Western blot分析結果；其中圖2-A為α-SMA免疫組化結果對比圖片；圖2-B為α-SMA免疫組化表達面積對比柱狀圖；圖2-C為E-Cadherin免疫組化結果對比圖片；圖2-D為E-Cadherin免疫組化表達面積對比柱狀圖；圖2-E為Western blot結果中E-Cadherin、α-SMA表達量對比圖片；圖2-F為α-SMA表達量對比柱狀圖；圖2-G為E-Cadherin表達量對比柱狀圖。

圖3為8周齡C57小鼠行單側輸尿管結扎術和假手術后分別給予利拉魯肽或生理鹽水處理后的腎臟標本的天狼星紅染色和RT-PCR結果分析；其中圖3-A為天狼星紅染色結果對比圖片；圖3-B為染色區域百分比對比柱狀圖；圖3-C、3-D分別為纖維粘連蛋白和Col1α1表達量對比柱狀圖。

圖4為8周齡C57小鼠行單側輸尿管結扎術和假手術后分別給予利拉魯肽或生理鹽水處理后的腎臟標本的RT-PCR結果分析。

圖5為8周齡C57小鼠行單側輸尿管結扎術和假手術后分別給予利拉魯肽或生理鹽水處理后的腎臟標本的磷酸化結果分析；圖5-A為ERK1/2和Smad3磷酸化程度對比圖片；圖5-B、5-C分別為ERK1/2、Smad3的磷酸化程度對比柱狀圖。

圖6為大鼠腎小管上皮細胞系NRK-52E經TGF-β1刺激后的免疫熒光、Western blot和RT-PCR結果分析；圖6-A為TGF-β1刺激72小時后的α-SMA及E-Cadherin的免疫熒光對比圖片；圖6-B為TGF-β1刺激后的α-SMA、E-Cadherin表達量電泳圖；圖6-C、6-D、6-E、6-F、6-G分別為TGF-β1刺激72小時后的α-SMA、E-Cadherin、TGF-β1R、Col1α1和Col3α1的表達量對比柱狀圖。

圖7為大鼠腎小管上皮細胞系NRK-52E經TGF-β1刺激后的Western blot結果分析。圖7-A為經TGF-β1刺激1小時后，ERK1/2和Smad3的磷酸化程度對比圖片；圖7-B、7-C分別為ERK1/2和Smad3的磷酸化程度對比柱狀圖。

圖8為大鼠腎小管上皮細胞系NRK-52E分別在PDTC和利拉魯肽條件下，經TGF-β1刺激所產生的Col1α1的表達量對比柱狀圖。

圖9為大鼠腎小管上皮細胞系NRK-52E分別在PDTC和利拉魯肽條件下，經TGF-β1刺激所產生的Col3α1的表達量對比柱狀圖。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步的詳細說明，以下實施例是對本發明的解釋，而本發明并不局限于以下實施例。

以下實驗將通過研究利拉魯肽對單側輸尿管結扎(UUO)小鼠腎纖維化程度的影響，以證明利拉魯肽可作為治療腎臟纖維化的藥物。

實驗構思：通過單側結扎小鼠輸尿管建立腎纖維化模型，同時給予連續7天(2次/天)皮下注射利拉魯肽治療，以觀察利拉魯肽對腎纖維化小鼠的影響。我們的實驗設計共分四組，假手術組、利拉魯肽組、UUO組、UUO后給予利拉魯肽處理組。實驗選用8周齡的雄性C57小鼠，隨機分配入組后進行單側輸尿管結扎術和假手術，術后每天給予利拉魯肽或生理鹽水皮下注射，術后第7天處死小鼠，取腎臟標本進行組織病理學、分子生物學等檢測。

實驗步驟如下：

1、小鼠實驗

1)動物模型構建

實驗所用到的小鼠為SPF級C57小鼠，雄性，8周齡，均購于北京華阜康公司，飼養于華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院器官移植研究所動物實驗中心屏障環境中，受華中科技大學同濟醫學院動物中心倫理委員會監管。實驗小鼠每兩只喂養于塑料籠中，給予標準飲食和正常飲水，室溫控制在20～25℃，相對濕度50～60％，12小時光照循環。

C57小鼠6周齡進入屏障環境后使其適應2周，于小鼠8周齡時開始實驗處理。32只小鼠隨機分配入假手術加生理鹽水(Veh)組(n＝6)，假手術加利拉魯肽(Lira)組(n＝6)，單側輸尿管結扎(UUO)組(n＝10)和單側輸尿管結扎加利拉魯肽干預(UUO+Lira)組(n+10)。

2)單側輸尿管結扎術

各組實驗小鼠用1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(8ml/1kg)后腹部向上固定于無菌手術臺上，待小鼠呼吸心跳平穩后行單側輸尿管結扎術。采取腹部正中切口，切口處先予以脫毛處理，并用75％酒精消毒。UUO及UUO+Lira組小鼠開腹后用無菌棉簽撥開腸道暴露出左側腎臟及輸尿管，游離左側輸尿管，在輸尿管中上1/3處用5-0絲線結扎兩道并從中離斷。之后還原腸道，并行雙層連續縫合關閉腹腔。Veh及Lira組小鼠不結扎輸尿管，其余操作與UUO組相同。整個手術過程遵循無菌操作原則，手術器械均高壓蒸汽消毒滅菌，小鼠術后肌肉注射青霉素20U/(kg)抗感染。

3)藥物干預及結果處置

藥物干預時間為7天，Lira及UUO+Lira組小鼠皮下注射利拉魯肽(300μg/kg，bid)，Veh及UUO組小鼠皮下注射等體積生理鹽水。

術后第7天，處死各組小鼠，取左側腎臟，剔除腎包膜，將腎臟縱切分為兩半，一半置于4％中性甲醛固定，隨后針對各組樣本分別給予HE、Masson、天狼星紅和免疫組化(檢測α-SMA、E-Cadherin)染色；另一半置于-80℃，后期行Western blot(檢測α-SMA、E-Cadherin、p-ERK1/2、ERK1/2、p-Smad3、Smad3)和RT-PCR(檢測TGF-β1R、FN、Col1α1)。結果見附圖1～6。

其中，圖1-A和1-B：HE染色及相應的損傷評分表明，UUO對照組的腎臟損傷評分明顯高于假手術組；經利拉魯肽處理后的UUO小鼠，與UUO對照組相比較，其損傷評分明顯降低。圖中，****代表<0.0001，##代表<0.01。

圖1-C和1-D：Masson染色及相應的膠原纖維所占面積百分比分析表明，UUO對照組的腎臟膠原纖維所占面積百分比明顯高于假手術組；經利拉魯肽處理后的UUO小鼠，與UUO對照組相比較，其膠原纖維所占面積百分比明顯降低。圖中，**代表<0.01，##代表<0.01。

圖2-A、2-B、2-C、2-D：免疫組化結果分析表明，UUO對照組與假手術組相比，其α-SMA的表達量顯著升高，而E-Cadherin的表達顯著降低；此外，UUO小鼠經利拉魯肽處理后，相較UUO對照組，其α-SMA的表達量明顯下降，而E-Cadherin的表達明顯升高。圖中，***代表<0.001，##代表<0.01，#代表<0.05。

圖2-E、2-F、2-G：Western blot結果分析表明，UUO對照組與假手術組相比，其α-SMA的表達量顯著升高，而E-Cadherin的表達顯著降低；UUO小鼠經利拉魯肽處理后，相較UUO對照組，其α-SMA的表達量明顯下降，而E-Cadherin的表達明顯升高。圖中，***代表<0.001，**代表<0.01，###代表<0.001，#代表<0.05。

圖3-A、3-B：天狼星紅染色結果分析表明，UUO對照組的腎臟膠原蛋白表達量顯高于假手術組；經利拉魯肽處理后的UUO小鼠，與UUO對照組相比較，其膠原蛋白表達量明顯降低。圖中，**代表<0.01，#代表<0.05。

圖3-C、3-D：RT-PCR結果分析表明，纖維連接蛋白(FN)和1型膠原蛋白(Col1α1)在UUO對照組中的表達顯著高于假手術組；UUO小鼠經利拉魯肽處理后，其FN和Col1α1的表達量相比UUO對照組明顯降低。圖中，***代表<0.001，##代表<0.01。

圖4：TGF-β1在UUO對照組中的表達顯著高于假手術組；UUO小鼠經利拉魯肽處理后，其TGF-β1表達量相比UUO對照組明顯降低。***代表<0.001，###代表<0.001。

圖5-A、5-B、5-C：UUO對照組中ERK1/2的磷酸化程度顯著高于假手術組；UUO小鼠經利拉魯肽處理后，其ERK1/2磷酸化程度相比UUO對照組明顯降低。UUO對照組中Smad3的磷酸化程度顯著高于假手術組；UUO小鼠經利拉魯肽處理后，其Smad3的磷酸化程度相比UUO對照組明顯降低。**代表<0.01，***代表<0.001，#代表<0.05，##代表<0.01。

2、細胞實驗

大鼠腎小管上皮細胞系(NRK-52E)置于含10％胎牛血清、100單位/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的DMEM培養液中，于37℃、5％CO₂培養箱中孵育，細胞傳代用0.25％胰蛋白酶消化細胞。隔天換液，至細胞貼壁生長至亞融合狀態(達到底面積的75％～80％)傳代，分組，用無血清培養基平衡12小時，然后分組分別給予刺激；

刺激(Ⅰ)TGF-β1刺激72小時后進行免疫熒光、RT-PCR以及α-SMA、E-Cadherin的Western blot檢測；

刺激(Ⅱ)TGF-β1刺激1小時后進行p-ERK1/2、ERK1/2、p-Smad3、Smad3的Western blot檢測)。

分組類型：①正常對照組；②TGF-β1(10ng/ml)陽性對照組；③TGF-β1(10ng/ml)+利拉魯肽(100nM)。所有試驗均重復3次。

免疫熒光雙染、Western blot檢測NRK-52E細胞α-SMA、E-Cadherin表達；Western blot檢測NRK-52E細胞p-ERK1/2、ERK1/2、p-Smad3、Smad3表達強度；RT-PCR檢測NRK-52E細胞TGF-β1R、Col1α1、Col3α1表達強度，結果見：

圖6-A、6-B、6-C、6-D：經TGF-β1刺激72小時后，α-SMA的表達量與TGF-β1未刺激組相比較明顯升高，而利拉魯肽處理能夠減弱TGF-β1刺激引起的α-SMA表達量升高；經TGF-β1刺激72小時后，E-Cadherin的表達量與TGF-β1未刺激組相比較明顯降低，而利拉魯肽處理能夠改善TGF-β1刺激引起的E-Cadherin表達量降低。圖中，**代表<0.01，***代表<0.001，#代表<0.05，##代表<0.01。

圖6-E、6-F、6-G：經TGF-β1刺激72小時后，TGF-β1R、Col1α1和Col3α1的表達量與TGF-β1未刺激組相比較明顯升高；而利拉魯肽處理后能降低TGF-β1刺激引起的TGF-β1R、Col1α1和Col3α1表達量的升高。圖中，*代表<0.05，**代表<0.01，#代表<0.05，##代表<0.01，###代表<0.001。

圖7，經TGF-β1刺激1小時后，ERK1/2和Smad3的磷酸化程度與TGF-β1未刺激組相比較明顯升高，而利拉魯肽處理能夠減弱TGF-β1刺激引起的ERK1/2和Smad3的磷酸化程度升高。****代表<0.0001，##代表<0.01，####代表<0.0001。

3、與NF-κB活化抑制劑的對比細胞實驗

大鼠腎小管上皮細胞系(NRK-52E)置于含10％胎牛血清、100單位/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的DMEM培養液中，于37℃、5％CO₂培養箱中孵育，細胞傳代用0.25％胰蛋白酶消化細胞。隔天換液，至細胞貼壁生長至亞融合狀態(達到底面積的75％～80％)傳代，分組，用無血清培養基平衡12小時，然后分組分別給予刺激；

然后再以TGF-β1刺激72小時后進行RT-PCR檢測Col1α1、Col3α1表達強度；

分組類型：①正常對照組；②TGF-β1(10ng/ml)陽性對照組；③TGF-β1(10ng/ml)+PDTC(100nM)；④TGF-β1(10ng/ml)+利拉魯肽(100nM)。所有試驗均重復3次。

(注：PDTC的全稱為Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate或Pyrrolidinedithiocarbamic acid,ammonium salt，是一種可以通透細胞膜的NF-κB活化(NF-κB activation)抑制劑，可以在多種細胞中抑制NF-κB的激活。)

實驗結果見圖8和圖9，圖8顯示，經TGF-β1刺激72小時后，Col1α1的表達量與TGF-β1未刺激組相比較明顯升高；PDTC雖能減少TGF-β1刺激引起的Col1α1表達量升高，但這種減少效果沒有統計學差異；而利拉魯肽處理后能降低TGF-β1刺激引起的Col1α1表達量的升高，且與PCTC組有統計學差異。**代表<0.01，#代表<0.05，&代表<0.05。

圖9顯示，經TGF-β1刺激72小時后，Col3α1的表達量與TGF-β1未刺激組相比較明顯升高；PDTC能減少TGF-β1刺激引起的Col3α1表達量升高；而利拉魯肽處理后同樣能降低TGF-β1刺激引起的Col3α1表達量的升高，且減弱效果相比PCTC組有統計學差異。*代表<0.05，#代表<0.05，&代表<0.05。

結論：相同濃度的利拉魯肽改善TGF-β1刺激引起的NRK-52E發生纖維化轉變的效果好于相同濃度的PDTC。

綜合上述動物實驗及細胞實驗數據，說明利拉魯肽能明顯改善單側輸尿管結扎導致的小鼠腎臟纖維化的發生發展，這種改善作用可能是通過減弱TGF-β/Smad、ERK1/2信號通路的活化從而抑制腎小管上皮細胞發生上皮-間質轉化來實現。