本發明涉及淡水養殖
技術領域：
，具體而言，涉及一種抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑、制備方法及其應用。
背景技術：
：雜交鱧是由烏鱧(Channaargus)與斑鱧(Channamaculata)人工雜交而成的子一代。雜交鱧在鱧科魚類的養殖過程中占了絕大部分，因其具有良好的雜種優勢，不僅具有肉質細膩、味道鮮美、刺少和出肉率高等特點，深受國內外消費者喜愛，還具有補脾利水、去瘀生新、滋補調養等藥用價值，可作為創傷、手術和滋補調養的食療材料，因此雜交鱧成為珠江三角洲等地區水產養殖鱧科魚類中最主要的養殖品種，但由于大規模、高密度的人工養殖，這種養殖方式會存在導致魚集體爆發各種疾病的隱患。舒伯特氣單胞菌(Aeromonasschubertii)屬氣單胞菌科(Aeromonadaceae)氣單胞菌屬(Aeromanas)，亦被稱為舒氏氣單胞菌，為革蘭氏陰性桿菌，單極鞭毛，運動極為活潑，其廣泛存在于淡水、海水、土壤、魚類和脊椎動物腸道中，具有廣泛的致病性。近年來，關于舒伯特氣單胞菌感染致病的報道很多，給水產養殖業帶來一定的經濟損失，其感染后引起多種炎癥，多為惡性傳染。例如在水產養殖生產中，舒伯特氣單胞菌容易致使雜交鱧患內臟類結節病，內臟白點等疾病，其感染力強，在現代水產養殖高度集約化的生產中很容易引起大規模的爆發，致使魚類大面積死亡，造成嚴重的經濟損失。目前，在實際生產中對于舒伯特氣單胞菌引起的病害大多以抗生素類和化學藥類作為防治藥物，但是，這也會導致該致病菌產生抗藥性和副作用，以至于對其以后的防治增加新的難題，同時也嚴重影響了水產品品質。為更好的發展水產無公害化，降低水產經濟損失，減少化學藥物使用和環境污染，使用綠色藥物防治，是當下水產養殖業的一個新突破。我國擁有豐富的中草藥資源，中草藥以低殘留、對人體健康無害、高效安全等優點符合目前倍受關注的健康養殖的要求。因此，合理地開發利用中草藥資源在水產動物養殖中，不僅對動物的營養和促生長以及提高防病抗病能力具有重大意義，同時也符合水產養殖可持續發展的要求。鑒于此，本發明以舒伯特氣單胞菌為研究對象，篩選出對其有較好抑菌作用且毒副作用較小的的復方中藥制劑，從而為水產動物病害學和舒伯特氣單胞菌引起的魚類細菌性疾病防治實踐提供參考依據。技術實現要素：本發明的第一目的在于提供一種抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑，該中藥制劑以烏梅和木瓜為原料，不僅選材簡單，還兼具殺菌、抑菌功能，能增強魚類對舒伯特氣單胞菌的抵抗能力，降低患病率和死亡率。本發明的第二目的在于提供一種抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑的制備方法，該方法以烏梅和木瓜為原料，采用傳統中藥熬制工藝，操作簡單，原料利用率高，適合規模化生產。本發明的第三目的在于提供一種抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑在治療舒伯特氣單胞菌引起細菌性疾病中的應用，該應用對動物提高防病抗病能力具有重大意義，同時也符合養殖業可持續發展的要求。為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：一種抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑，包括下列原料藥：烏梅和木瓜。進一步地，本發明中，所述一種抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑，所述烏梅和木瓜的質量克數比為(0.5-3):1。同時，本發明中，該抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑的制備方法包括如下步驟：將烏梅和木瓜進行恒溫干燥，隨后粉碎加水浸泡并進行煎煮，然后濾去藥渣將藥液進行蒸餾濃縮，即得到所述抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑。進一步地，所述恒溫干燥的溫度為60-70℃，恒溫干燥的時間為3-7h。進一步地，所述加水浸泡的時間為20-40min。進一步地，所述浸泡過程中原料藥和水的質量比為1/8-1/12。更進一步地，所述制備方法還進一步包括將濃縮的藥液進行加熱殺菌并冷藏備用的過程。更進一步地，所述加熱殺菌的溫度為110-130℃，時間為15-30min。此外，本發明還包括該抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑在治療水產動物中的細菌性疾病的應用。進一步地，所述水產動物中的細菌性疾病為舒伯特氣單胞菌引起的細菌性疾病。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：(1)本發明抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑以中草藥為研究對象，從豐富的中草藥資源中篩選出對水產動物抗病能力、免疫力、抑菌能力等有積極效果的中草藥藥物，且組方科學、配伍合理，可有效抑制舒伯特氣單胞菌感染引起的雜交鱧內臟類結節病、內臟白點等疾病，為水產養殖病害防治和無公害化發展提供間接參考及相關理論依據。(2)本發明抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑采用傳統工藝制備，制備方法簡單可操作，能最大限度保留了原中藥原料的藥效，適合工業化生產和市場推廣。具體實施方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。本發明提供了一種抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑，包括下列原料藥：烏梅和木瓜。本發明參考《中藥方劑研究的正交t值法》中記載的主藥分析、輔藥交互分析、劑量選擇三步法，從多味中藥原料中篩選出具有殺菌、抑菌作用的兩味中藥烏梅和木瓜。其中，烏梅為薔薇科杏屬植物，其葉、果、根均可入藥，主要功能有抑菌、抗腫瘤和抗氧化等功效，用于治療久咳、久瘧、痢疾、便血、鉤蟲病、牛皮癬等癥。此外，有關烏梅提取液的抑菌研究表明，烏梅不僅對大腸桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、綠膿桿菌等有抑制作用，而且還對一些真菌有抑制作用。木瓜為薔薇科植物貼梗海棠的干燥近成熟果實，其味酸性溫，現代醫學研究表明，木瓜中含有廣譜抗菌作用的齊墩果酸，并且對腸道菌和葡萄球菌有明顯抑菌作用。此外還發現，宣木瓜乙醇粗提物和蒸餾水粗提物對細菌有廣譜抗菌作用，既對革蘭氏陰性菌(熒光假單胞菌和大腸桿菌)有抑制作用，也對革蘭氏陽性菌(枯草桿菌、金黃色葡萄球菌和四聯球菌)有抑制作用。本發明以烏梅為君、以木瓜為臣，所制得的復方中草藥不僅便宜易得，而且對舒伯特氣單胞菌有很好的殺菌、抑菌效果。在一種優選的實施方式中，該抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑中，烏梅和木瓜的質量克數比為(0.5-3):1。烏梅和木瓜的質量克數比可以為，但不限制為0.5，1，1.5，2，2.5或3，其中優選烏梅和木瓜的質量克數比為1。本發明的另一方面提供了一種抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑的制備方法，包括如下步驟：將烏梅和木瓜進行恒溫干燥，隨后粉碎加水浸泡并進行煎煮，然后濾去藥渣將藥液進行蒸餾濃縮，即得到所述抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑。在一種優選的實施方式中，將烏梅和木瓜進行恒溫干燥的溫度為60-70℃，恒溫干燥的時間為3-7h。其中溫度可以為，但不限制為：60℃，62℃，64℃，66℃，68℃或70℃；恒溫干燥的時間為，但不限制為3h，4h，5h，6h或7h，其中優選5h。在一種優選的實施方式中，將烏梅和木瓜浸泡的時間為20-40min。其中烏梅和木瓜的浸泡時間可以為，但不限制為20min，25min，30min，35min或40min。在一種優選的實施方式中，浸泡過程中原料藥和水的質量克數比為1/8-1/12。其中，原料藥和水的質量克數比可以為，但不限制為1/8，1/9，1/10，1/11或1/12，其中優選1/10。在一種優選的實施方式中，用電爐煎煮30min，隨后將煎煮完的藥液過濾，重復此過程三次，分別得到三次藥液，并將所得藥液合并即得到藥液。在一種優選的實施方式中，蒸餾濃縮為濃縮至藥液內烏梅、木瓜提取物的濃度為1g/mL。上述制備方法還進一步包括將濃縮的藥液進行加熱殺菌并冷藏備用的過程。在一種優選的實施方式中，所述加熱殺菌是在高壓滅菌鍋中進行，加熱殺菌的溫度為110-130℃，時間為15-30min。所述高壓滅菌鍋，又稱高壓蒸氣滅菌鍋，主要有一個可以密封的桶體、壓力表、排氣閥、安全閥和電熱絲等部件組成。其殺菌原理如下：基于高壓滅菌鍋是一個密閉的容器，利用電熱絲加熱水產生的水蒸氣密集在容器中，隨著水的的煮沸，蒸氣壓力升高，溫度升高，從而達到滅菌的效果。其中，加熱殺菌的溫度可以為，但不限制為110℃，115℃，121℃，125℃或130℃，其中優選殺菌溫度大于121℃。加熱殺菌的時間可以為，但不限制為15min，20min，25min或30min，其中優選殺菌時間大于20min。本發明的第三個方面還包括該抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑在制備用于治療水產動物中細菌性疾病的應用。其中水產動物中的細菌性疾病為舒伯特氣單胞菌引起的細菌性疾病，脊椎動物泛指生活在淡水、海水的脊椎動物，如魚，進一步地，可以為，經濟價值高，高密度養殖容易爆發舒伯特氣單胞菌感染致病的大黃魚、石斑魚、大菱鲆、草魚或雜交鱧。實驗例1一種抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑包括烏梅和木瓜兩種中藥原料，其篩選過程主要包括兩個方面，一是抑殺舒伯特氣單胞菌的中草藥的篩選，二是抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑的篩選。一、抑殺舒伯特氣單胞菌的中草藥篩選試驗研究1、材料與方法1.1、試驗材料和儀器1.1.1、中草藥通過查閱文獻，從抗病效果、實用及資源量等方面出發，本試驗選取了60種報道有抑菌作用的中草藥作為研究對象，所用中草藥均購自重慶北碚萬和大藥房，上述60味中草藥包括五倍子、大黃、大青葉、黃柏、毛冬青、黃岑、魚腥草、金銀花、白鮮皮、馬齒莧穿心蓮、板藍根、連翹、黃芪、厚樸、蒲公英、白芍、地榆、丁香、知母夏枯草、野菊、木瓜、訶子、茵陳蒿、苦參、百部、五味子、檳榔、甘草、敗醬草、田基黃、薄荷、梔子、白頭翁、赤芍、龍膽草、秦皮、吳茱萸、金櫻子、筋骨草、兒茶、石榴皮、七葉一枝花、虎杖、佩蘭、青黛、紫花地丁、馬鞭草、千里光、五加皮、烏梅、威靈仙、馬兜鈴仙鶴草、草果、貫眾、瓜蔞子、瓜蔞皮和黃連。1.1.2、受試菌種菌株：舒伯特氣單胞菌(Aeromonasschubertii)菌株WL-1，由中國水產科學研究所珠江水產研究所惠贈。1.1.3、試驗試劑瓊脂粉、牛肉膏、蛋白胨氯化鈉、氫氧化鈉、酵母浸膏、無水乙醇。1.1.4、試驗儀器DL型萬用電爐；BCD-205F/T冰箱；SB1.T-014電子天平；THZ-82水浴恒溫振蕩器；BJ-150型高速多功能粉碎機；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺；DHP-9082型電熱恒溫培養箱；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器；720060DL型移液槍：容量100-1000μl；720070DL型移液槍，容量20-200μl；玻璃三角涂布棒、一次性注射器、接種環、三角瓶、培養皿(90mm)、燒杯、棉簽、游標卡尺、直尺、漏斗、量筒、石棉網等實驗室常用設備。1.2、抑殺舒伯特氣單胞菌的中草藥篩選試驗研究1.2.1、培養基的制備LB固體培養基：酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g，加蒸餾水1000mL溶解后調節PH至偏堿性，加2％的瓊脂，加熱煮沸至瓊脂完全融化，分裝燒瓶，121℃高壓滅菌20min，滅菌后4℃冰箱保存備用。營養肉湯培養基：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3.0g，氯化鈉5.0g，加1000mL蒸餾水攪拌至完全溶解，調節pH至7.2，分裝燒瓶，121℃高壓滅菌20min，滅菌后4℃冰箱保存備用。1.2.2、培養板的制備把培養皿密封包好后放入滅菌鍋中，121℃高溫滅菌20min。滅菌后在無菌條件下將無菌LB固體培養基趁熱倒入90mm的培養皿中，每個培養皿約加20mL瓊脂，待凝固后倒扣在37℃生化培養箱中培養24h，將無污染的培養皿置于4℃冰箱保存備用。1.2.3、中草藥提取液的制備本試驗中草藥提取液制備采用煎煮的方法。將購置回來的中草藥置于恒溫箱65(±5)℃下干燥5h；用粉碎機將干燥后的中草藥進行粉碎，然后每種中草藥取10g放入潔凈燒杯中，按1:10比例加水浸泡30min，再放置電爐上煎煮30min。用紗布將煎煮完的藥液過濾，重復此過程三次，分別得到三次藥液。將所得藥液合并，蒸餾濃縮至藥液內含原藥1g/mL。最后用高壓滅菌鍋(121℃，20min)滅菌后，置于冰箱4℃保存備用1.2.4、菌懸液的制備試驗菌培養：將菌株活化，用接種針在固體培養基上劃線，再28℃培養24h后，挑取單個菌落，接種到營養肉湯培養基上震蕩培養24h。采用平板計數法將菌液稀釋到合適濃度，菌液濃度為1×108CFU/mL。1.2.5、藥物敏感性試驗藥敏試驗采用瓊脂擴散法，將培養至對數生長期的菌懸液稀釋至濃度約為1×107CFU/mL，使用無菌棉簽蘸取菌液輕輕的均勻涂抹在培養基上，涂抹均勻后，用打孔器(直徑為6.00mm)在平板上均勻打孔，每個平板上打4個孔，挑出孔內瓊脂并用火焰封底，做好標記。每孔加入100μl(1g/mL)藥液，然后將之放入28℃培養箱中培養24h；平板取出后，觀察孔周圍是否有抑菌圈，若有，則用游標卡尺測量抑菌圈直徑。每種藥物做三個重復，同時以無菌水做空白對照。結果判斷標準按《中藥藥理學》介紹的標準：抑菌圈≥20mm，屬于極敏；抑菌圈15～19mm屬于高敏；抑菌圈10～14mm屬于中敏；抑菌圈小于10mm，屬于低敏；沒有抑菌圈，屬于不敏(無抑菌效果)。1.2.6、二次篩選試驗用營養肉湯培養基以二倍稀釋法對提取物進行梯度稀釋，取滅菌有硅膠塞的試管10支，編號，每管先加入無菌肉湯培養基2.0mL，然后于第一管中加入滅菌的受試藥液2.0mL，混勻后取出2.0mL放入第2管中，依次稀釋成8個2倍系列濃度，第9管不加入藥液，作陽性對照，最后加入細菌懸液，使細菌濃度達到106CFU/mL，第10管加受試藥液2.0mL，混勻后取出2.0mL棄去，不加細菌，作為陰性對照。置28℃搖床中震蕩(200r/min)培養24h，然后取出與對照管對比觀察，無混濁現象所對應的藥物濃度就為該中草藥對舒伯特氣單胞菌的最小抑菌濃度(MinimumInhibitoryConcentration，MIC)，每個濃度重復3次。1.3、數據處理采用Excel2003和SPSS13.0軟件對數據進行處理，結果均用平均數±標準差(X±SD)表示。2、結果與分析2.1、藥物敏感性試驗結果表160種藥物抑菌圈直徑及抑菌等級上述表中，“+++”表示極敏，“++”表示高敏，“+”表示中敏或低敏，“－”表示不敏(無抑菌效果)。通過瓊脂擴散法，60種中草藥提取液對舒伯特氣單胞菌的抑菌效果各不相同，見表1。在1g/mL濃度下，60種中草藥中五倍子、大黃、黃柏、黃連、地榆、丁香、木瓜、訶子、五味子、兒茶、烏梅的抑菌效果最顯著，其抑菌圈直徑大于20mm，為極敏藥物；其中威靈仙、千里光、虎杖、石榴皮、黃芩、毛冬青、連翹、厚樸，這8種中草藥的抑菌效果次之，其抑菌圈直徑在15～20mm之間，屬于高敏藥物；魚腥草、薄荷、赤芍、白芍、筋骨草、夏枯草、紫花地丁、檳榔、甘草9種中草藥抑菌效果較差，抑菌圈直徑在10～15mm之間，屬于中敏藥物；仙鶴草、馬兜鈴、茵陳蒿3種中草藥抑菌效果不明顯，抑菌圈直徑小于10mm，屬于低敏藥物；剩余大青葉等29種中草藥無抑菌效果。因此，初步篩選出五倍子、大黃、黃柏、黃連、地榆、丁香、木瓜、訶子、五味子、兒茶、烏梅11味抑菌效果較好的中草藥。2.2、二次篩選試驗結果表2中草藥的最小抑菌濃度利用瓊脂擴散法、通過二次篩選實驗，初步選定了五倍子、烏梅、地榆等11味中草藥，在此基礎上進行第二步篩選—二倍稀釋法。根據表2，11味中草藥最小抑菌濃度結果可知，五倍子和訶子的抑菌效果最好，MIC均為1.95mg/mL；其次為烏梅、地榆、黃連、兒茶和丁香，MIC分別為3.91mg/mL、7.81mg/mL、7.81mg/mL、7.81mg/mL和7.81mg/mL；木瓜、五味子和大黃，MIC分別為15.63mg/mL和31.25mg/mL，抑菌效果較差；最后則為黃柏，MIC為62.5mg/mL。其結果基本與抑菌圈測定結果大致相符。通過抑菌圈直徑和MIC的測定結果分析，最終選定五倍子、地榆、大黃、黃柏、烏梅、木瓜和訶子等11味中草藥進行復方配伍試驗。3、結論本試驗以患病雜交鱧體內分離的舒伯特氣單胞菌為供試菌，采用瓊脂擴散法對60味中草藥進行抑菌中草藥篩選。試驗結果表明，初步篩選出的五倍子、大黃、黃柏、黃連、地榆、丁香、木瓜、訶子、五味子、兒茶、烏梅11味中草藥，均為高敏藥物；其中，烏梅的抑菌效果最佳。采用二倍稀釋法進行二次篩選，測定五倍子、大黃、黃柏、黃連、地榆、丁香、木瓜、訶子、五味子、兒茶、烏梅11味中草藥的MIC值，結果與其抑菌圈直徑大小大致一致，確定選取這11味中草藥進行組方試驗研究。將上述篩選得到的11種中藥進行進一步篩選，以期望進一步得到抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑。二、抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中草藥篩選1、材料與方法1.1、試驗材料1.1.1、中草藥液上述篩選的五倍子、大黃、黃柏、黃連、地榆、丁香、木瓜、訶子、五味子、兒茶、烏梅藥液。1.1.2、受試菌種菌株：舒伯特氣單胞菌(Aeromonasschubertii)菌株WL-1，由中國水產科學研究所珠江水產研究所提供。1.1.3、培養基營養肉湯培養基、LB固體培養基、生理鹽水，按照常規方法配制，121℃高壓滅菌20min，滅菌后4℃冰箱保存備用。1.1.4受試動物受試動物為雜交鱧購自重慶銅梁區少云鎮烏魚基地，選擇體格健康，無病無傷，體表鱗片完整，體重為(80.33±1.94)g。1.2、試驗方法1.2.1、復方中草藥的篩選試驗利用正交t值法和藥物之間的交互作用，對初次篩選出的中草藥進一步進行篩選和復方配比，步驟為主藥的篩選、輔藥的交互作用試驗。1.2.1.1、主藥的篩選試驗設計將五倍子、大黃、黃柏、黃連、地榆、丁香、木瓜、訶子、五味子、兒茶、烏梅11味中草藥各為一個因素，分別命名為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K，每種中草藥均設水平1(用)和水平2(不用)兩個水平(表3)，選用L12(211)正交t值表(表4)進行試驗安排。各組通過瓊脂擴散法測定抑菌圈，以其為試驗指標，每組3個重復，數據越大，抑菌效果越好。表3主藥篩選正交試驗設計因素水平表表4正交t值法L12(211)的組方原則主藥的篩選試驗結果見下頁。表5主藥篩選實驗結果由上表5可知，地榆、丁香、黃連、大黃的M1＜M2，D值為負值，說明不用此藥比用此藥的抑菌作用好。故最佳組合為五倍子、訶子、烏梅、木瓜、五味子、黃柏、兒茶，預期藥效MM＝23.18+2.89/12＝23.42。烏梅的影響最為顯著，應以其作為主藥。兒茶、五味子、黃柏在組方中作用較小，故舍去不用。因此選擇以顯著者烏梅作為主藥，不顯著者五倍子、訶子、木瓜可能為輔藥，4味中草藥作為組方進行下面的輔藥交互作用試驗。1.2.1.2、輔藥的交互作用試驗設計以作用顯著的主因素(烏梅)做基礎，選用L8(27)正交表(表7)著重分析其他因素與基礎因素和彼此間和的交互作用，因素水平表見表6。利用瓊脂擴散法，每組3個重復，以抑菌圈直徑作為試驗指標。表6輔藥交互作用正交試驗設計因素水平表因素基礎因素烏梅五倍子訶子木瓜1水平都用用用用2水平都用不用不用不用表7正交t值法L8(27)的組方原則組別12345671111111121112222312221224122221152112112621122217222112182221212表8輔藥交互作用正交試驗結果由上表分析可知，將主藥分析中抑菌效果顯著者烏梅作為基礎因素，用正交表L8(27)分析可能為輔藥的五倍子、訶子、木瓜與基礎因素烏梅和彼此間和的交互作用試驗結果見表8。五倍子M1－M2＜0，D值為負，負效應顯著，不用為好。木瓜、訶子(AB)間，[12]＝28.88mm＞[22]＝28.70mm＞[11]＝28.06mm＞[21]＝27.43mm，因此烏梅和木瓜間有協同作用，與訶子間有拮抗作用，舍去為好。實施例1一種抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑包括烏梅5g、木瓜10g。然后按照如下方法制備實施例1中的復方中藥制劑：將上述中藥混合物置于恒溫箱65(±5)℃下干燥5h；用粉碎機將干燥后的中草藥進行粉碎，然后放入潔凈燒杯中，按1:10比例加水浸泡30min，再放置電爐上煎煮30min。用紗布將煎煮完的藥液過濾，重復此過程三次，分別得到三次藥液。將所得藥液合并，蒸餾濃縮至藥液內烏梅和木瓜提取物的濃度為1g/mL。最后用高壓滅菌鍋(121℃，20min)滅菌后，置于冰箱4℃保存備用。實施例2一種抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑包括烏梅10、木瓜10g。然后按照如下方法制備實施例2的復方中藥制劑：將上述中藥混合物置于恒溫箱65(±5)℃下干燥5h；用粉碎機將干燥后的中草藥進行粉碎，然后放入潔凈燒杯中，按1:10比例加水浸泡30min，再放置電爐上煎煮30min。用紗布將煎煮完的藥液過濾，重復此過程三次，分別得到三次藥液。將所得藥液合并，蒸餾濃縮至藥液內烏梅和木瓜提取物的濃度為1g/mL。最后用高壓滅菌鍋(121℃，20min)滅菌后，置于冰箱4℃保存備用。實施例3一種抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑包括烏梅15g、木瓜10g。然后按照如下方法制備實施例3的復方中藥制劑：將上述中藥混合物置于恒溫箱65(±5)℃下干燥5h；用粉碎機將干燥后的中草藥進行粉碎，然后放入潔凈燒杯中，按1:10比例加水浸泡30min，再放置電爐上煎煮30min。用紗布將煎煮完的藥液過濾，重復此過程三次，分別得到三次藥液。將所得藥液合并，蒸餾濃縮至藥液內烏梅和木瓜提取物的濃度為1g/mL。最后用高壓滅菌鍋(121℃，20min)滅菌后，置于冰箱4℃保存備用。實施例4一種抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑包括烏梅20g、木瓜10g。然后按照如下方法制備實施例4的復方中藥制劑：將上述中藥混合物置于恒溫箱65(±5)℃下干燥5h；用粉碎機將干燥后的中草藥進行粉碎，然后放入潔凈燒杯中，按1:10比例加水浸泡30min，再放置電爐上煎煮30min。用紗布將煎煮完的藥液過濾，重復此過程三次，分別得到三次藥液。將所得藥液合并，蒸餾濃縮至藥液內烏梅和木瓜提取物的濃度為1g/mL。最后用高壓滅菌鍋(121℃，20min)滅菌后，置于冰箱4℃保存備用。實施例5一種抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑包括烏梅25g，木瓜10g。然后按照如下方法制備實施5的復方中藥制劑：將上述中藥混合物置于恒溫箱65(±5)℃下干燥5h；用粉碎機將干燥后的中草藥進行粉碎，然后放入潔凈燒杯中，按1:10比例加水浸泡30min，再放置電爐上煎煮30min。用紗布將煎煮完的藥液過濾，重復此過程三次，分別得到三次藥液。將所得藥液合并，蒸餾濃縮至藥液內烏梅和木瓜提取物的濃度為1g/mL。最后用高壓滅菌鍋(121℃，20min)滅菌后，置于冰箱4℃保存備用。實施例6一種抑殺舒伯特氣單胞菌的復方中藥制劑包括烏梅30g、木瓜10g。然后按照如下方法制備實施例6的復方中藥制劑：將上述中藥混合物置于恒溫箱65(±5)℃下干燥5h；用粉碎機將干燥后的中草藥進行粉碎，然后放入潔凈燒杯中，按1:10比例加水浸泡30min，再放置電爐上煎煮30min。用紗布將煎煮完的藥液過濾，重復此過程三次，分別得到三次藥液。將所得藥液合并，蒸餾濃縮至藥液內含烏梅和木瓜提取物的濃度為1g/mL。最后用高壓滅菌鍋(121℃，20min)滅菌后，置于冰箱4℃保存備用。實驗例2為表明該復方中藥制劑的安全性，現做如下實驗。1、受試動物：受試動物為雜交鱧購自重慶銅梁區少云鎮烏魚基地，選擇體格健康、無病無傷、體表鱗片完整、體重為(80.33±1.94)g作為實驗備用。2、受試方法：隨機選取雜交鱧140尾，設6個實驗組和1個對照組，每組設一個重復，每個重復10尾魚。每日給實驗組1-6的雜交鱧分別灌喂實施例1-6制得的復方中藥制劑2000mg/kg，每尾每次以0.2mL灌胃給藥，對照組1等量等次以生理鹽水灌喂。受試魚試驗前一天禁食，試驗過程中不投餌，試驗用水為曝氣24h的自來水。詳細觀察7d，并每天記錄雜交鱧的運動狀態及死亡情況。表9魚類急性毒性實驗毒性分級標準魚起始LC50(mg/L)﹤11-100100-10001000-10000﹥10000毒性分級劇毒高毒中等毒性低毒微毒(無毒)通過實驗結果觀察，在受試動物灌喂給藥后觀察的一周中，實驗組1-6無動物死亡，運動狀態比較正常。雜交鱧運動狀態觀察顯示復方中草藥對雜交鱧的運動無明顯影響，由此可知復方中藥組合物對其生長未造成影響，未發現任何毒性反應。在灌胃劑量味2000mg/kg，觀察7天未見死亡，試驗結果表明，復方中藥制劑的LD50≥8×105mg/L,根據上表可知，所獲得的復方中藥制劑急性毒性分級為微毒(無毒)。實驗例3為表明該復方中藥制劑不同配比的抑菌性，現做如下動物敏感性實驗。1、受試菌種菌株：舒伯特氣單胞菌(Aeromonasschubertii)菌株WL-1，由中國水產科學研究所珠江水產研究所惠贈。2、培養基的制備LB固體培養基：酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g，加蒸餾水1000mL溶解后調節PH至偏堿性，加2％的瓊脂，加熱煮沸至瓊脂完全融化，分裝燒瓶，121℃高壓滅菌20min，滅菌后4℃冰箱保存備用。營養肉湯培養基：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3.0g，氯化鈉5.0g，加1000mL蒸餾水攪拌至完全溶解，調節pH至7.2，分裝燒瓶，121℃高壓滅菌20min，滅菌后4℃冰箱保存備用。3、培養板的制備把培養皿密封包好后放入滅菌鍋中，121℃高溫滅菌20min。滅菌后在無菌條件下將無菌LB固體培養基趁熱倒入90mm的培養皿中，每個培養皿約加20mL瓊脂，待凝固后倒扣在37℃生化培養箱中培養24h，將無污染的培養皿置于4℃冰箱保存備用。4、菌懸液的制備試驗菌培養：將菌株活化，用接種針在固體培養基上劃線，再28℃培養24h后，挑取單個菌落，接種到營養肉湯培養基上震蕩培養24h。采用平板計數法將菌液稀釋到合適濃度，菌液濃度為1×108CFU/mL。5、藥物敏感性試驗藥物敏感試驗采用瓊脂擴散法，即將培養至對數生長期的菌懸液稀釋至濃度約為1×107CFU/mL，使用無菌棉簽蘸取菌液輕輕的均勻涂抹在培養基上，涂抹均勻后，用打孔器(直徑為6.00mm)在平板上均勻打孔，每個平板上4個孔，挑出孔內瓊脂并用火焰封底，做好標記。每孔加入100μl(1g/mL)藥液，然后將之放入28℃培養箱中培養24h；平板取出后，觀察孔周圍是否有抑菌圈，若有，則用游標卡尺測量抑菌圈直徑。每種藥物做三個重復，同時以無菌水做空白對照。結果判斷標準按《中藥藥理學》介紹的標準：抑菌圈≥20mm，屬于極敏；抑菌圈15～19mm為高敏；抑菌圈10～14mm屬于中敏；抑菌圈小于10mm，屬于低敏；沒有抑菌圈，屬于不敏(無抑菌效果)。表10原料比例的抑菌性實驗結果通過上述實驗結果分析可知，當烏梅和木瓜的質量份數比為1/2時，該中藥制劑的復方抑菌效果最差，且抑菌圈直徑小于單獨使用烏梅(即組7)的抑菌圈直徑。當烏梅和木瓜的質量份數比為1:1時，該中藥制劑的復方抑菌效果最佳，抑菌圈直徑達到28.51mm，故該比例的復方中藥制劑可用于治療舒伯特氣單胞菌所引起的魚病。實驗例4目前關于中草藥治療水產動物疾病的研究報道相對較多，研究發現中草藥配比和添加劑量是影響患病水生動物存活率的重要因素。在研究魚健康狀況的因素時，通常考慮以下影響因素：(1)超氧化物歧化酶(SOD)活性氧作為環境因子，對生命活動極其重要，但在機體的代謝過程中所產生的氧自由基即活性氧，又對細胞有毒害作用。SOD是生物體內抗氧化防御系統的重要酶之一，在清除生物體內活性氧的過程中起著重要作用。在正常生理狀態下機體活性氧的產生和清除處于動態平衡，活性氧在不斷產生同時又不斷被清除。但在應激狀態下體內活性氧產生增加和抗氧化劑的減少能導致氧化應激，對細胞膜造成氧化損傷，影響細胞功能的正常發揮，甚至導致細胞破裂，血溶或器官發生性損傷。機體本身在正常狀態下清除過剩氧自由基的能力是評價機體健康的重要指標，因此，SOD對評判免疫刺激劑對魚體健康狀況的影響具有重要意義。(2)丙二醛(MDA)含量丙二醛(MDA)是反應體內脂質過氧化水平的敏感指標，是脂質過氧化的最終代謝產物，可以與蛋白質的游離氨基作用，引起蛋白質分子內和分子間交聯，導致細胞損傷。正常生理狀態下，機體內的MDA含量是極低的，其含量的高低可以反映機體細胞受到自由基攻擊至損傷的程度。(3)過氧化氫酶(CAT)CAT是機體清除氧自由基的重要成分，具有重要的生理功能。在細胞內主要與線粒體及過氧體結合，將細胞代謝產生的毒性物質H2O2迅速加以清除，分解為H2O和O2，從而共同保護血紅蛋白、膜蛋白等，還可以減少過氧化脂質生成和對機體的毒害。在健康的魚體體內，其內環境中自由基的產生與消除處于動態平衡中，當CAT活性降低時，魚體內的自由基量過多能破壞一些體內重要的生化過程，導致代謝混亂，正常生理功能失調，體內免疫水平下降，潛在的病原被激活使魚體發病。(4)酸性磷酸酶(ACP)ACP是動物代謝過程中重要的調控酶，在酸性條件下催化磷酸單酯水解生成無機磷酸的水解酶。研究表明，ACP主要參與磷酸酯的代謝，還具有代謝調節、能量轉化、信號傳導等作用，同時作為溶酶體的標志酶，ACP與溶酶體生理功能的正常發揮密切相關，是水產動物賴以生長、生存的重要酶類之一。(5)堿性磷酸酶(AKP)AKP是磷代謝過程中重要的酶類之一，是膜結合酶，幾乎存在于機體各種組織中，不僅能催化磷酸單酯水解，還直接參與磷酸基團的轉移，是動物體內重要的解毒體系；同時AKP作為動物溶酶體酶的重要組成部分，在免疫反應中發揮作用。現從養殖試驗出發，研究該復方中藥制劑對在舒伯特氣單胞菌各組織酶活性的影響，從該復方中藥制劑對雜交鱧超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、過氧化氫酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)五方面進行實驗研究，從而為水產病害學和實踐提供科學依據。1、材料和方法1.1、實驗用魚和中藥材試驗用魚雜交鱧購自重慶銅梁區少云鎮烏魚基地，選擇生長狀況良好，無病無傷，體表鱗片完整，體重為(22.42±0.99)g，體長(15.45±1.02)cm，以其作為試驗魚。烏梅、木瓜購于重慶北碚區萬和大藥房。1.2、實驗材料水缸(規格為3.14×(0.3m)2×0.6m)、玻璃勻漿器、電子天平、分析天平、直尺、離心機、勻漿器、紫外可見分光光度計、37℃恒溫水浴箱、冰箱、離心管、解剖工具、一次性注射器、加熱棒、溫度計；生理鹽水(0.86％)、冰醋酸、考馬斯亮藍(G250)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)試劑盒。1.3、試驗飼料配制以福建大昌生物科技實業公司生產的大昌牌生魚配合飼料為基礎飼料。按上述實施例2的方法制得復方中藥制劑，以5％的投餌率計算，稱取合適的飼料，然后采用單因子濃度梯度法，按飼料總重的0.5％、1％、2％將藥液均勻地噴灑在飼料上，然后置于干燥箱中，在65℃下干燥至飼料水分含量降至10％。以添加量為0％的基礎飼料作為對照組，烘干后自封袋密封備用。試驗飼料組成及餌料營養成分如表9。表11試驗餌料組成及商品餌料營養成分1.4、飼養管理試驗按投喂餌料中添加的中草藥種類和劑量不同分為對照組(C0)、復方組(F0.5、F1、F2)共4組，每個重復30尾。試驗魚放于水箱中暫養馴化14天后開始正式試驗。預實驗期間，各組均投喂基礎飼料。待每缸魚攝食正常后，別用基礎飼料、添加0.5％、1％和2％的復方中藥制劑飼料投喂，試驗不間斷進行60天。試驗期間晝夜用增氧機充氧，必要時用加熱棒進行控溫，控溫水溫在23±1.6℃，并嚴格控制水質。養殖過程中，各組水質一致均為脫氯自來水，晝夜24小時充氣，每2天換水一次，每次先放出1/3的水，然后將水注滿，等待5min，再放掉1/2水，注滿水后，等待5min，最后再放掉所用的水，再將水缸注滿。試驗期間，投餌嚴格按照“四定”原則，每天9:00、17:00左右各投喂1次飼料，投喂量為3～5％。在養殖過程中，每15d抽取一定數量的魚進行稱重，逐漸增加投喂量。1.5、樣品采集和處理在給藥后的第60天進行采樣，每缸隨機取5尾魚，采用尾靜脈采血方法，用一次性無菌注射器抽取非抗凝血，將采集的血液迅速動作輕微地轉移至5mL無菌離心管中，于4℃靜置8h后，3000r/min冷凍離心15min，收集血清并保存于-80℃超低溫冰箱備用。解剖取出魚的全部內臟后，先用生理鹽水潤洗，濾紙拭干后再稱重；分離出全部肝臟和脾臟，用生理鹽水洗凈后，拭干稱重，將肝臟放入自封袋內，標記后放入-20℃冰箱保存備用；在背部取肌肉0.2～0.3g左右，去皮去刺，生理鹽水沖洗后拭干，放入自封袋內封好，標記后放置于-20℃冰箱保存備用。取肌肉、肝臟組織各1g，放入小燒杯內快速剪碎成小組織塊，然后放入5mL離心管中，將離心管放入冰浴中，加入1:10的生理鹽水，利用勻漿器研磨，研磨到基本沒有顆粒狀或成塊狀物質為準，研磨時，使其浸沒在冰水浴中，以避免酶失活。研磨完成后，放入離心機2000r/min離心15min，留上清液并放入-20℃冰箱保存備用。1.6、酶活性的測定用試劑盒測定總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)。所用試劑盒均購自南京建成生物技術研究所，嚴格按照其說明書進行操作，蛋白質的測定采用考馬斯亮藍法。1.7、數據處理采用Excel2003進行數據整理，SPSS13.0進行單因素方差分析，結果用平均值±標準誤(X±SE)表示。2、實驗結果和分析2.1、復方中藥制劑對雜交鱧SOD活性的影響表12不同劑量復方中藥制劑對雜交鱧酶活性的影響復方中藥制劑對雜交鱧SOD活力的影響見上表12，由表12可知，在60天的試驗期內，在肝臟SOD活性對比試驗，中復方組F0.5、F1、F2分別比對照組C0分別提高了11.36％、27.05％和17.27％，與對照組無顯著差異(P＞0.05)。在肌肉SOD活性對比試驗中，復方組F0.5、F1、F2分別相對于對照組C0提高了72.89％、25.15％和107.27％，其中F2組肌肉SOD活力高于對照組C0、C1，且有顯著差異(P＜0.05)；F0.5、F1略高于對照組C0，但差異不顯著(P＞0.05)。在血清SOD活性對比試驗中，復方組F0.5、F1、F2分別相對于對照組C0提高了5.64％、0.28％和7.41％，但差異均不明顯(P＞0.05)。經過上述分析可知，在60天的試驗期內，飼料中添加不同劑量的復方中草藥制劑后，各添加組血清、肝臟和肌肉組織中的SOD活性與對照組相比，均有不同程度的提高。2.2、復方中藥制劑對雜交鱧MDA含量的影響表13復方中藥制劑對雜交鱧各組織MDA的影響復方中藥制劑對雜交鱧MDA含量的影響見上表13，從表13中可知，在60天的試驗期內，在肝臟MDA活性對比試驗中，復方組F0.5、F1、F2分別比對照組C0分別降低了7.84％、27.45％和3.92％。在肌肉MDA活性對比試驗中，復方組F0.5、F1、F2的MDA含量均低于對照組C0，復方組F0.5、F1、F2分別降低了60.34％、23.28％和55.17％，均為差異顯著(P＜0.05)。在血清MDA活性對比試驗中，復方組F0.5、F1、F2的MDA含量均低于對照組C0，分別降低了12.98％、15.88％和5.19％。經過上述分析可知，飼料中添加不同含量的復方中草藥后，雜交鱧的血清、肝臟和肌肉組織中的MDA含量均有不同程度的降低。2.3、復方中藥制劑對雜交鱧CAT活性的影響表14復方中藥制劑對雜交鱧CAT活性的影響從中藥制劑對雜交鱧CAT活性的影響表14可知，在60天的試驗期內，飼料中添加不同劑量的單、復方中草藥后，雜交鱧的血清、肝臟和肌肉組織中的CAT活性均有不同程度的變化。其中在肝臟CAT活性對照試驗中復方中藥制劑F0.5、F1、F2各組CAT活力與對照組C0相比，分別提高了99.60％(P＜0.05)、0.80％(P＞0.05)和86.45％(P＜0.05)，其中F0.5和F2相對于C0均為顯著差異。在肌肉CAT活性對照試驗中，復方中藥制劑F0.5、F1、F2各組CAT活力與對照組C0相比，分別提高了7.01％、7.49％和38.52％。在血清CAT活性對照試驗中，復方中藥制劑F0.5、F1、F2各組CAT活力與對照組C0相比，分別提高了2.38％、22.82％和2.73％。試驗總結：在60天的試驗期內，飼料中添加不同劑量的復方中草藥制劑后，各添加組血清、肝臟和肌肉組織中的CAT活性與對照組相比，均有不同程度的提高。2.4、復方中藥制劑對雜交鱧ACP活性的影響表15復方中藥制劑對雜交鱧ACP活性的影響復方中草藥對雜交鱧ACP活性的影響見上表15，從表中可知，在60天的試驗期內，飼料中添加不同劑量的復方中草藥后，雜交鱧的血清、肝臟和肌肉組織中的ACP活性與對照組相比，沒有太大的變化。只有在肌肉中F2的ACP活力與對照組C0相比，提高了70.17％，差異顯著(P＜0.05)。其他各組未出現差異顯著性情況。2.5、單方和復方中草藥對雜交鱧AKP活性的影響表16中草藥對雜交鱧AKP活性的影響復方中草藥對雜交鱧AKP活力的影響見上表16，由表16可知，在60天的試驗期內，在肝臟AKP活性對比試驗中復方組F0.5、F1、F2分別比對照組C0分別提高了16.08％、10.02％和28.68％，與對照組差異不顯著(P＞0.05)。在肌肉AKP活性對比試驗中，復方組F1、F2分別相對于對照組C0提高了37.91％、51.65％和217.58％，其中F2與對照組差異不顯著(P＞0.05)。在血清SOD活性對比試驗中，復方組F1、F2分別相對于對照組C0提高了6.7％和1.54％，但差異均不明顯(P＞0.05)。本發明以雜交鱧為實驗對象，通過在飼料中添加不同劑量的復方中藥制劑，發現肝臟、肌肉、血清中SOD、CAT、ACP和AKP的活性均有明顯提高，而MDA活性有不同程度地降低。除雜交鱧外，本發明復方中藥制劑還適用于其他脊椎類動物，該試驗數據為復方中草藥對脊椎類動物非特異性免疫功能的影響提供了重要依據。盡管已用具體實施例來說明和描述了本發明，然而應意識到，在不背離本發明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發明范圍內的所有這些變化和修改。當前第1頁1 2 3