本發明涉及納米技術領域，具體為一種納米技術在羊胚胎提取中的應用以及羊胚胎素的質量標準。
背景技術：
自1912年，瑞士科學家卡爾教授首次發現羊胚胎細胞中有一種能使細胞恢復活力的物質(稱之為羊胚胎素)以來。羊胚胎中含有活化細胞、增強生命系統免疫功能、恢復人體精力的多種物質，這些物質對人類抗衰老、治療和預防疾病得到了應用。隨著人類對羊胚胎素用研究深入，羊胚胎素的提取與純化技術，對羊胚胎素在人類應用中起決定性作用。具有高生物活性小分子羊胚胎素能快速被人體吸收利用，且安全、效果明顯，它通過增強人體免疫功能，調節人體內分泌，加速細胞的分裂，修復受細胞，活化衰老細胞，使人體各細胞及組織達到年輕狀態，人體各機能均被激活，達到真正意義上的延緩衰老，治療和預防疾病。羊胚胎素包括細胞中含有蛋白質、核酸、糖類、磷脂類、維生素、酶等。按常規方法提取的羊胚胎素中的大分子物質多，成分復雜，過敏性高，活性低、生物利用率低。
羊胚胎素的生物活性高低和分子的大小能決定羊胚胎素是否可以達到上述效果。目前的提取方法主要以粉碎、生化提取、離心、微濾，整個生產過程中受熱量和化學物質的影響，特別是細胞破碎后沒有對生物活性物質保護，生物活性受到破壞較大，因此提取物中羊胚胎素的活性較低，其次在純化時采用微濾，成分復雜，不易吸收，過敏源多，再提取出來的羊胚胎素無質量標準，不能保證其質量。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種納米技術在羊胚胎提取中的應用以及羊胚胎素的質量標準，以解決上述背景技術中提出的問題。
為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
1.一種從羊胚胎中制備羊胚胎提取液的方法，從羊胚胎的選取及處理開始，經過組織破碎、細胞反復凍融、離心去雜、微濾，獲得羊胚胎提取液，包括下述步驟：
(1)羊胚胎選取與處理：其羊胚胎為孕期6-8周，脫母體后浸泡在生理鹽水中，30min內置-20℃儲藏；
(2)組織破碎：去除羊胚胎腸胃雜質，碎成碎片，絞肉機2次后用4-6℃生理鹽水制成肉漿，再用膠體磨研磨4次；
(3)細胞反復凍融：在-35±2℃和0℃反復凍融三次，每35±2℃時間凍融時間為12小時；
(4)離心去雜：采用冷凍離心機，確保離心室溫度在-8—-10℃；
(5)微濾：離心上清液經濾紙過濾后，再經0.8um、0.2um過濾，得羊胚胎提取液。
作為本發明更進一步的技術方案，步驟(2)中所述生理鹽水與羊胚胎重量比例為15：1。
2.一種從羊胚胎提取液中分離純化得到羊胚胎素溶液的制備方法，通過不同納米遞度過濾，獲得羊胚胎素溶液，包括下述步驟：
(1)納濾：經過微濾后的羊胚胎提取液，在無菌條件下采用不同納米遞度過濾，去掉分子量大于6000道爾頓的物質(高分子物質、細菌、病毒等)和分子量小于100道爾頓物質(無機鹽類等)；
(2)納濾后的處理：納濾后的溶液充氮后密封保存，確保儲藏期因氧化導致生物活性降低，同時回收100道爾頓以下的液體循環利用，減少排放達到環保。
作為本發明更進一步的技術方案，在無菌條件下指的是B級潔凈區內。
作為本發明更進一步的技術方案，不同納米遞度為10—100nm。
3.一種羊胚胎素溶液的質量標準，具體為：
性狀：本品為無色或微黃色液體。
鑒別：取本品，加40％氫氧化鈉溶液0.5ml，搖勻，再加1％硫酸銅溶液1ml,溶液顯紫紅色。
PH值：6.0～7.5；
蛋白質：取本品2ml，加20％磺基水楊酸溶液1ml，混勻，不得發生混濁或沉淀；
多肽含量：不得低于6mg/ml；
高分子物質：不得高于5.0％；
生物活性：不得低于30.0％；
貯藏：充氮密閉，-4℃以下保存；
有效期：24個月。
作為本發明更進一步的技術方案，多肽含量的測定方法為福林酚測定法。
作為本發明更進一步的技術方案，高分子物質的測定方法為高效液相色譜法。
作為本發明更進一步的技術方案，生物活性的測定方法為T細胞活性測定法-脫E受體法。
與現有技術相比，本發明提供了一種羊胚胎提取和純化方法，解決了羊胚胎素中高分子物質多、成分雜、過敏源多、生物活性低的原因。同時本發明建立了羊胚胎素溶液質量標準，解決了羊胚胎提取后無標準檢測的問題。
本發明提供的提取方法，從羊胚胎原料到提取過程，整個過程在低溫(胚胎-20℃儲藏、組織破碎4-6℃、細胞反復凍融在-35±2℃、離心去雜在-8—-10℃)和細胞生理環境(生理鹽水環境下)條件下保證羊胚胎素的生物活性。本發明提供的純化方法，采用不同納米遞度過濾，去除了高分子物質、細菌、病毒、無機鹽類等，選擇性留下100—6000道爾頓高生物活性物質，納濾后的羊胚胎素溶液充入無菌氮氣后密封保存，確保儲藏期不會因氧化生物活性降低，同時回收100道爾頓以下的液體循環利用，減少排放達到環保。
具體實施方式
下面結合具體實施方式對本專利的技術方案作進一步詳細地說明。
步驟一
羊胚胎的選擇和處理：經發明人的反復試驗，原料的選擇與前期處理對產品的生物活性很重要，孕期6-8周羊胚胎，其胚胎生長最快時期，其胚胎各組織細胞中含生物活性物質最高，脫母體后浸泡在生理鹽水中，30min內置-20℃儲藏，對生物活性物質沒有任何影響。
步驟二
組織破碎：先將羊胚胎解凍，解凍后清洗干凈，去除腸胃，剁成碎片，放入絞肉機中絞碎，重復2次，再用4-6℃生理鹽水(純化水加氯化鈉配制成0.9％生理鹽水，再滅菌好備用)，制成肉漿(生理鹽水與羊胚胎重量比例為15：1)。肉漿經膠體磨研磨，重復4次，變成肉糊狀，前兩次膠磨應快(30min/100kg羊胚胎)，后兩次膠磨稍慢(45min/100kg羊胚胎)，這樣膠磨產生的熱量，基本不會對溶液溫度產生影響，不會影響生物活性。反復膠磨使組織破碎。
步驟三
細胞反復凍融：將步驟二中的肉糊裝入5cm厚的容器中，密閉置于冷凍池中，-35±2℃時間12小時后，再解凍至0℃，重復三次。通過反復凍融，細胞破裂，活性物質被凍出。盛裝容器不能過厚，否則反復凍融時中心溫度達到時太長且延長了反復凍融時間。
步驟四
離心去雜：將步驟三的凍融物解凍至4—6℃，攪拌30min，便于活性物質均勻分散溶液中。離心時必須采用冷凍離心機，冷凍離心機設置溫度不得高于-12℃，這樣才能確保離心室工作溫度在-10℃左右，離心時間6min，離心速度4200轉/分鐘，使懸浮大顆粒全部沉淀。這樣離心出來的上清液中不影響微濾，如果離心時間過短或轉速偏小，微濾中濾膜很容易堵塞，微濾時間過長，影響生物活性。
步驟五
微濾：將步驟四中的上清液先經濾紙過濾，再先后經0.8um、0.2um微孔濾芯過濾，過濾過程中一定要注意溶液溫度，控制在4—6℃之間，溫度過高會影響生物活性，過濾過程中也應按孔徑大小先后順序過濾，否則時間過濾較長。
步驟六
分離純化：經過微濾后的提取液，在無菌條件下(B級潔凈區)采用不同納米遞度過濾(10—100nm)，先后去年掉10萬道爾頓、1萬道爾頓、6000道爾頓的高分子物質、細菌、病毒等，再去掉分子量小于100道爾頓物質(無機鹽類等)，最終獲得100—6000道爾頓小分子高活性的羊胚胎素溶液。再將此溶液充無菌氮氣后-4℃密封保存。低溫和充氮能確保儲藏期生物活性降低。同時回收100道爾頓以下的液體，下批提取時可當作部分提取水，循環利用減少排放，達到環保。
本發明實施的質量檢測標準：
檢測標準一
性狀：本品為無色或微黃色液體。
檢測標準二
鑒別：取本品，加40％氫氧化鈉溶液0.5ml，搖勻，再加1％硫酸銅溶液1ml,溶液顯紫紅色。
檢測標準三
PH值：用pH計測量，pH應為6.0～7.5。
蛋白質：取本品2ml，加20％磺基水楊酸溶液1ml，混勻，不得發生混濁或沉淀。
多肽含量(福林酚測定法)：取本品適量，加水制成每1ml中含多肽0.15mg的溶液，作為供試品溶液，精密量取1.0ml，照福林酚測定法(附二)測定，從回歸方程中求出多肽含量。多肽不得低于6mg/ml。
高分子量物質：
(1)色譜條件與系統適用性試驗：用凝膠色譜柱(如TSK GEL 2005SWx1 7.8mm×300mm，5um)；流動相為三氟醋酸-乙腈-水(0.05：10：90)；檢測波長為214nm。理論板數按胰島素峰計算應不得低于3000。
(2)對照品溶液的制備：取胰島素(分子量5800)適量，用流動相制成每1ml中含1mg的溶液，作為對照品溶液。
(3)供試品溶液的制備：取本品，加流動相稀釋成每1ml中含多肽1mg的溶液，作為供試品溶液。
(4)測定法：取對照品溶液和供試品溶液各20ul，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，將先于胰島素峰保留時間的峰視為高分子量物質，按面積歸一化法計算，含高分子量物質的量不得過5.0％。
生物活性：取本品適量，照T細胞活性測定法-脫E受體法測定，供試品管的E玫瑰花結百分率與對照管的E玫瑰花結百分率之差應不低于30.0％。
貯藏：充氮密閉，-4℃以下保存。
有效期：24個月。
質量標準檢測方法：
T細胞活性測定法-脫E受體法
本法系根據轉移因子可使脫E受體后的胸腺T細胞恢復其E受體功能，從而反映轉移因子的生物活性。
試劑：
(1)Hank’s液：將0.3％磷酸二氫鉀溶液，0.76％磷酸氫二鈉溶液，2％氯化鉀溶液及20％氯化鈉溶液依次按20：20：20：40比例混合，加葡萄糖1g，溶解混勻，用水稀釋至1000ml，并用4％碳酸氫鈉溶液調節PH值至7.2～7.3(臨用時配制)。
(2)阿氏液：取氯化鈉0.420g，枸緣酸0.055g，枸緣酸鈉0.766g。葡萄糖2.05g，加水溶解并稀釋至100ml，滅菌。
(3)分離液：為淋巴細胞分離液。
(4)羊血：取綿羊靜脈血5ml，加入5ml阿氏液中，冰箱保存。
(5)固定液：取25％戊二醛溶液，3.5％碳酸氫鈉溶液及Hank’s液依次按1：1：38比例混合。
(6)姬姆薩染色液原液：取姬姆薩染料0.5g，加甘油33ml，55～60℃加熱至姬姆薩染料溶解，冷至室溫，加入33ml甲醇，室溫放置24小時后，用濾紙過濾，濾液即為原液。密封室溫保存。
(7)染色液：取姬姆薩染色液原液2ml，加Hank’s液6ml，搖勻，以每分鐘1500轉離心10分鐘，取上清液待用。
操作法：
(1)脫E受體胸腺T細胞懸液的制備：取新鮮豬胸腺，去脂肪并剪碎，加適量Hank’s液使成細胞懸液，經100目篩過濾，每分鐘1500轉離心3～5分鐘，棄去上清液，加入少量Hank’s液打勻，將此溶液加入已具有1/3濾液量的分離液的離心管中，以每分鐘2005轉離心20分鐘，小心吸出中間層的胸腺細胞，放入另一離心管中，加適量Hank’s液洗滌，搖勻，以每分鐘1500轉離心3～5分鐘，棄去上清液，洗滌一次后，在沉淀物中加入適量Hank’s液，混勻，45℃恒溫水浴保溫30分鐘(每隔5分鐘振搖一次)。以每分鐘1500轉離心3～5分鐘，棄去上清液，再加入適量Hank’s液，混勻后，置45℃恒溫水浴保溫30分鐘，取出后以每分鐘1500轉離心3～5分鐘，棄去上清液，用Hank’s液洗滌三次(操作同前)，最后用Hank’s液適當稀釋并計數，使最終濃度為每1ml中3×106～5×106個細胞。
(2)綿羊紅血球懸液的制備：取適量羊血，用適量Hank’s液洗三次(同前)，棄去上清液，加適量Hank’s液稀釋并計數，使最終濃度為脫E受體胸腺T細胞懸液濃度的8～10倍。
(3)供試品溶液的制備：取供試品，用Hank’s液配制成每1ml中含1mg的溶液。
(4)測定：取小試管6支，其中3支各加Hank’s液0.1ml作對照管，另3支各加供試品溶液0.1ml作測定管，每管中各加脫E受體胸腺T細胞懸液0.2ml，37℃保溫1小時后，加入綿羊紅血球懸液0.2ml，搖勻，以每分鐘500轉離心3分鐘，放入4℃冰箱過夜，次日取出，棄去上清液，每管中各加入固定液一滴，輕輕搖勻，靜置10分鐘，加入染色液2滴并搖勻，靜置15分鐘后開始計數，顯微鏡視野中淡藍色的較大的細胞為淋巴細胞，共數計數板16個大方格上所有淋巴細胞的個數(不少于200個)，統計其中的E玫瑰花結形成的細胞數(結合3個以上綿羊紅細胞的淋巴細胞)，求得結花百分率，取平均值。即為供試品管或對照管的平均值。
樣品活力＝供試品測定管E玫瑰花結百分率－對照管E玫瑰花結百分率。
福林酚測定法
試劑：
(1)堿性銅試液：取氫氧化鉀10g，碳酸鈉50g,加水400ml使溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5g,加水50ml使溶解，另取硫酸銅0.25g，加水30ml使溶解，將兩液混合，作為乙液。臨用前，合并兩液，并加水至500ml。
(2)福林酚試液：取福林酚試劑1ml，加水稀釋至16ml，臨用前配制。
(3)對照品溶液的制備：取牛血清白蛋白對照品1支，精密稱取適量，加水溶解并稀釋成每1ml中含0.3mg的溶液，即得。
(4)供試品溶液的制備：精密量取本品1ml置50ml容量瓶中，用水稀釋至刻度。
標準曲線的制備：
精密量取對照品溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9ml,分別置具塞試管中，各加水至1.0ml,再分別加入堿性銅試液1.0ml，搖勻，各加入福林酚試液4.0ml,立即搖勻，置55℃水浴中準確反應5分鐘，置冷水浴中10分鐘，在650nm的波長處測定吸收度；同時以0號管作為空白，以吸收度為縱坐標，對照品溶液濃度為橫坐標設置標準曲線參數。
精密量取供試品溶液1.0ml,做平行試驗2份，照標準曲線的制備項下的方法，自“加入堿性銅試液”起，依次測定，自標準曲線上查得供試品溶液的濃度，并乘以稀釋倍數，即得。
對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發明內。
此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。