本發明屬于生物醫學領域，特別是涉及一種用于皮膚損傷修復的細胞制劑的制備方法。
背景技術：
皮膚是人體最大的器官，具有保護體內各組織器官免受物理、化學、病原微生物侵襲的能力，是人體內、外環境之間的屏障和分界；臨床上常見的大面積燒傷、創傷、腫瘤切除手術等均可以破壞皮膚的完整性，導致皮膚及其軟組織缺損。臨床上治療皮膚軟組織缺損創面，往往需要取自體皮膚移植或進行局部皮瓣轉移手術進行修復；大面積皮膚缺損的患者，由于其自身皮源嚴重不足，創面的治療十分困難，因此，尋找促進創面愈合的新方法已成為整形外科醫生追逐的熱點。
與胚胎干細胞相比，成體干細胞多來自于自體的成熟組織，在臨床應用方面不存在倫理學問題，而且，由成體干細胞誘導所得的細胞、組織不存在配型及免疫排斥反應等相關問題，可成為細胞療法理想的種子細胞。脂肪干細胞是研究較為透徹的成體干細胞，它在體內外均有較強的增殖及自我更新能力，在特殊誘導培養條件下或體內特定環境中表現出其跨越胚層界限的分化能力。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種用于皮膚損傷修復的細胞制劑的制備方法，通過以明膠水凝膠作為支架材料搭載脂肪干細胞，并加入富血小板血漿支撐細胞制劑，有效修復皮膚損傷。
本發明是通過以下技術方案實現的：
一種用于皮膚損傷修復的細胞制劑的制備方法，該方法包括如下步驟：
S1、取脂肪組織清洗并剪碎，進行消化處理；
S2、取消化后的脂肪組織離心得到脂肪干細胞；
S3、將分離的脂肪干細胞加入培養基中重懸后進行分離培養；
S4、脂肪干細胞原代培養7-9d后進行體外擴增培養；
S5、制備明膠水凝膠，并將體外擴增的脂肪干細胞接種于水凝膠中；
S6、取新鮮血液離心后得到富血小板血漿，加入包埋干細胞的水凝膠和生理鹽水制備細胞制劑。
進一步地，S1中所述消化處理的步驟為：將剪碎后的脂肪組織加入至消化液中，置于37℃恒溫水浴箱中消化40-60min，消化結束后加入與消化液等體積的高糖DMEM終止消化。
進一步地，所述消化液為0.25％的胰蛋白酶液和0.1％的膠原酶液以體積比1：1混合，所述高糖DMEM中含有體積分數為10％的胎牛血清。
進一步地，S3中所述分離培養的步驟為：將S2中離心后的脂肪干細胞加入培養基中重懸，以2x106個/L的密度接種于培養瓶中，置于37℃，5％CO2，飽和濕度培養箱中培養，24h后第一次換液，之后每2d換液一次。
進一步地，所述培養基為高糖DMEM培養基，其中含有體積分數為10％的胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素。
進一步地，S4中所述體外擴增培養的步驟為：S3中干細胞培養7-9d后，接種于新的培養瓶中進行體外擴增培養培養，擴增比例為1：3。
進一步地，S5中所述制備明膠水凝膠的步驟為：稱取明膠粉末溶解于磷酸緩沖溶液中配置成5％-6％的明膠溶液，將明膠溶液滴入六孔培養板中，每孔2mL，置于恒溫培養箱中凝固1-2h。
進一步地，S5中所述接種步驟為：取S4中體外擴增培養的脂肪干細胞以1x106個/mL接種于明膠水凝膠中，置于恒溫培養箱中培養68-72h，得到包埋干細胞的水凝膠。
進一步地，S6中所述制備細胞制劑的具體步驟為：將富血小板血漿與生理鹽水混合后加入S5中得到的包埋干細胞的水凝膠配制成細胞制劑，其中，所述包埋干細胞的水凝膠濃度為2x106個/mL，富血小板血漿的體積分數為10％。
本發明具有以下有益效果：
本發明通過對脂肪干細胞體外擴增培養，并將培養后的干細胞接種于水凝膠支架材料上，同時加入富血小板血漿制備細胞制劑，明膠水凝膠作為一種理想的細胞傳遞介質，可以直接將細胞注射到病變組織，同時富血小板血漿可釋放多種生長因子，有效促進創面愈合。
當然，實施本發明的任一產品并不一定需要同時達到以上所述的所有優點。
具體實施方式
本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發明保護的范圍。
本發明為一種用于皮膚損傷修復的細胞制劑的制備方法，該方法具體步驟如下：
實施例1
S1、取脂肪組織用磷酸緩沖溶液清洗后進行消化處理；
具體的，取脂肪組織用磷酸緩沖溶液清洗2次，剪碎至體積為0.1cm3；
將剪碎后的脂肪組織加入至消化液中，置于37℃恒溫水浴箱中消化40min，所述消化液為0.25％的胰蛋白酶液和0.1％的膠原酶液以體積比1：1混合，消化結束后加入與消化液等體積的高糖DMEM終止消化，所述高糖DMEM中含有體積分數為10％的胎牛血清；
S2、取消化后的脂肪組織離心得到脂肪干細胞；
具體的，將S1中消化后的脂肪組織碎片以1000r/min離心10min，取下層沉淀得到脂肪干細胞；
較優的，將離心后的脂肪干細胞加入紅細胞裂解液中靜置10min去除殘留的紅細胞，1000r/min離心10min取下層沉淀；
S3、將分離的脂肪干細胞加入培養基重懸后進行分離培養；
具體的，將S2中離心后的脂肪干細胞加入培養基中重懸，以2x106L-1的密度接種于培養瓶中，置于37℃，5％CO2，飽和濕度培養箱中培養，24h后第一次換液，之后每2d換液一次；
所述培養基為高糖DMEM培養基，其中含有體積分數為10％的胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素；
S4、脂肪干細胞原代培養7d后進行體外擴增培養；
具體的，S3中干細胞培養7d后，接種于新的培養瓶中進行體外擴增培養培養，擴增比例為1：3；
較優的，原代培養后的干細胞加入0.25％胰酶液進行消化處理，所述0.25％胰酶液中含有0.1％的EDTA；
S5、制備明膠水凝膠，并將體外擴增的脂肪干細胞接種于水凝膠中；
具體的，稱取明膠粉末溶解于磷酸緩沖溶液中配置成5％的明膠溶液，將明膠溶液滴入六孔培養板中，每孔2mL，置于37℃，5％CO2濃度的恒溫培養箱中凝固1h；
取S4中體外擴增培養的脂肪干細胞以1x106個/mL接種于明膠水凝膠中，置于37℃，5％CO2濃度的恒溫培養箱中培養68h，得到包埋干細胞的水凝膠；
S6、取新鮮血液離心后得到富血小板血漿，加入包埋干細胞的水凝膠和生理鹽水制備細胞制劑；
具體的，取人體新鮮血液加入檸檬酸鈉0.1mol/L，將該血液置于低溫離心機中以1500r/min離心10min，收集上層液即為富血小板血漿；
較優的，于富血小板血漿中加入質量分數為10％的凝血酶，置于20℃水浴中震蕩5min；
將所述富血小板血漿與生理鹽水混合后加入S5中得到的包埋干細胞的水凝膠配制成細胞制劑，其中，所述包埋干細胞的水凝膠濃度為2x106個/mL，富血小板血漿的體積分數為10％。
實施例2
S1、取脂肪組織用磷酸緩沖溶液清洗后進行消化處理；
具體的，取脂肪組織用磷酸緩沖溶液清洗3次，剪碎至體積為0.15cm3；
將剪碎后的脂肪組織加入至消化液中，置于37℃恒溫水浴箱中消化60min，所述消化液為0.25％的胰蛋白酶液和0.1％的膠原酶液以體積比1：1混合，消化結束后加入與消化液等體積的高糖DMEM終止消化，所述高糖DMEM中含有體積分數為10％的胎牛血清；
S2、取消化后的脂肪組織離心得到脂肪干細胞；
具體的，將S1中消化后的脂肪組織碎片以1500r/min離心10min，取下層沉淀得到脂肪干細胞；
較優的，將離心后的脂肪干細胞加入紅細胞裂解液中靜置15min去除殘留的紅細胞，1500r/min離心10min取下層沉淀；
S3、將分離的脂肪干細胞加入培養基重懸后進行分離培養；
具體的，將S2中離心后的脂肪干細胞加入培養基中重懸，以2x106L-1的密度接種于培養瓶中，置于37℃，5％CO2，飽和濕度培養箱中培養，24h后第一次換液，之后每2d換液一次；
所述培養基為高糖DMEM培養基，其中含有體積分數為10％的胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素；
S4、脂肪干細胞原代培養9d后進行體外擴增培養；
具體的，S3中干細胞培養9d后，接種于新的培養瓶中進行體外擴增培養培養，擴增比例為1：3；
較優的，原代培養后的干細胞加入0.25％胰酶液進行消化處理，所述0.25％胰酶液中含有0.1％的EDTA；
S5、制備明膠水凝膠，并將體外擴增的脂肪干細胞接種于水凝膠中；
具體的，稱取明膠粉末溶解于磷酸緩沖溶液中配置成6％的明膠溶液，將明膠溶液滴入六孔培養板中，每孔2mL，置于37℃，5％CO2濃度的恒溫培養箱中凝固2h；
取S4中體外擴增培養的脂肪干細胞以1x106個/mL接種于明膠水凝膠中，置于37℃，5％CO2濃度的恒溫培養箱中培養72h，得到包埋干細胞的水凝膠；
S6、取新鮮血液離心后得到富血小板血漿，加入包埋干細胞的水凝膠和生理鹽水制備細胞制劑；
具體的，取人體新鮮血液加入檸檬酸鈉0.1mol/L，將該血液置于低溫離心機中以1500r/min離心10min，收集上層液即為富血小板血漿；
較優的，于富血小板血漿中加入質量分數為10％的凝血酶，置于20℃水浴中震蕩10min；
將所述富血小板血漿與生理鹽水混合后加入S5中得到的包埋干細胞的水凝膠配制成細胞制劑，其中，所述包埋干細胞的水凝膠濃度為2x106個/mL，富血小板血漿的體積分數為10％。
實施例3
S1、取脂肪組織用磷酸緩沖溶液清洗后進行消化處理；
具體的，取脂肪組織用磷酸緩沖溶液清洗3次，剪碎至體積為0.12cm3；
將剪碎后的脂肪組織加入至消化液中，置于37℃恒溫水浴箱中消化50min，所述消化液為0.25％的胰蛋白酶液和0.1％的膠原酶液以體積比1：1混合，消化結束后加入與消化液等體積的高糖DMEM終止消化，所述高糖DMEM中含有體積分數為10％的胎牛血清；
S2、取消化后的脂肪組織離心得到脂肪干細胞；
具體的，將S1中消化后的脂肪組織碎片以1200r/min離心10min，取下層沉淀得到脂肪干細胞；
較優的，將離心后的脂肪干細胞加入紅細胞裂解液中靜置12min去除殘留的紅細胞，1300r/min離心10min取下層沉淀；
S3、將分離的脂肪干細胞加入培養基重懸后進行分離培養；
具體的，將S2中離心后的脂肪干細胞加入培養基中重懸，以2x106L-1的密度接種于培養瓶中，置于37℃，5％CO2，飽和濕度培養箱中培養，24h后第一次換液，之后每2d換液一次；
所述培養基為高糖DMEM培養基，其中含有體積分數為10％的胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素；
S4、脂肪干細胞原代培養8d后進行體外擴增培養；
具體的，S3中干細胞培養8d后，接種于新的培養瓶中進行體外擴增培養，擴增比例為1：3；
較優的，原代培養后的干細胞加入0.25％胰酶液進行消化處理，所述0.25％胰酶液中含有0.1％的EDTA；
S5、制備明膠水凝膠，并將體外擴增的脂肪干細胞接種于水凝膠中；
具體的，稱取明膠粉末溶解于磷酸緩沖溶液中配置成5.5％的明膠溶液，將明膠溶液滴入六孔培養板中，每孔2mL，置于37℃，5％CO2濃度的恒溫培養箱中凝固1.5h；
取S4中體外擴增培養的脂肪干細胞以1x106個/mL接種于明膠水凝膠中，置于37℃，5％CO2濃度的恒溫培養箱中培養70h，得到包埋干細胞的水凝膠；
S6、取新鮮血液離心后得到富血小板血漿，加入包埋干細胞的水凝膠和生理鹽水制備細胞制劑；
具體的，取人體新鮮血液加入檸檬酸鈉0.1mol/L，將該血液置于低溫離心機中以1500r/min離心10min，收集上層液即為富血小板血漿；
較優的，于富血小板血漿中加入質量分數為10％的凝血酶，置于20℃水浴中震蕩7min；
將所述富血小板血漿與生理鹽水混合后加入S5中得到的包埋干細胞的水凝膠配制成細胞制劑，其中，所述包埋干細胞的水凝膠濃度為2x106個/mL，富血小板血漿的體積分數為10％。
以上內容僅僅是對本發明所作的舉例和說明，所屬本技術領域的技術人員對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離發明或者超越本權利要求書所定義的范圍，均應屬于本發明的保護范圍。