本發明涉及干細胞制劑技術領域，特別涉及一種干細胞制劑及其制備方法和應用。
背景技術：
關節軟骨是一種黏彈性物質，不同活動部位表現不同的負荷-承載特性。關節軟骨的這一重要特性及其減少關節表面摩擦的作用是軟骨超微結構組成和化學構成的基本功能體現，關節軟骨由稀疏的細胞排列而成，無血管、淋巴和神經供應。關節軟骨在關節活動中起重要作用，其結構非常精細、科學，以適應不同的功能需要。創傷或運動損傷常導致關節軟骨的急性損傷，引起關節疼痛、腫脹及功能障礙，嚴重影響患者的生活質量。軟骨損傷后沒有或很少有自我修復能力。因此軟骨修復成為骨科領域重要問題。
微骨折手術，即在病變部位選擇幾個點，鉆孔至軟骨下骨，使缺損部位與軟骨下骨髓相通，讓具有分化潛能的骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可以滲出進入缺損區，骨髓中的血和再生能力很強的干細胞混雜在一起覆蓋在缺損的軟骨表面進行軟骨修復。軟骨早期磨損可以進行軟骨再生術。全層軟骨和軟骨下骨損傷有一定的修復能力，將部分軟骨損傷鉆孔至軟骨下骨可誘導修復，修復組織起源于松質骨中具有成骨能力的間充質干細胞，修復組織為類透明軟骨。但微骨折手術的方法需進行手術在病變部位打孔，病人承受很大的痛苦，并具有一定風險，而且骨髓中的MSCs量很少，生成修復性的纖維軟骨組織所需的時間較長。
隨著生物技術的發展，干細胞在治療各種疾病模型中的研究愈來愈多，由于它具有自我更新并可分化成多種類型的細胞，有著廣泛的應用前景，因此也被作為治療關節軟骨損傷的主要研究對象。但直接通過干細胞注射治療關節軟骨損傷存在細胞存活率偏低、細胞增殖困難的缺點。因此，急需提供一種可有效治療關節軟骨損傷的藥物制劑。
技術實現要素：
有鑒于此，本發明提供了一種干細胞制劑及其制備方法和應用。該干細胞制劑中干細胞增殖活性好，可有效治療關節軟骨損傷。
為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
本發明提供了一種干細胞制劑，包括脂肪間充質干細胞、富血小板血漿及透明質酸水溶液。
脂肪間充質干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的間充質干細胞。研究發現ADSCs細胞能夠在體外穩定增殖且衰亡率低，同時它具有取材容易、少量組織即可獲取大量干細胞，適宜大規模培養，對機體損傷小等優點，而且其來源廣泛，體內儲備量大，適宜自體移植，逐漸成為近年來新的研究熱點之一。
富血小板血漿(PRP)是指利用自身的血液，提取出的富含高濃度血小板和各種自身生長因子的血漿。PRP在促創面愈合、激活組織原位干細胞活性起到積極的效果，經PRP預處理的MSCs移植到機體后存活率提高，且其促血管新生等生物作用增強。
透明質酸是關節滑液的主要成分，可以保護關節軟骨，防止或延緩進一步退變，清除致痛物質，有明顯減輕疼痛的作用，可用于治療關節炎和加速傷口愈合。
本發明將脂肪間充質干細胞與PRP、透明質酸或其鹽組合使用后，對關節軟骨損傷具有很好的修復作用，效果顯著好于微骨折手術，且脂肪間充質干細胞取材方便、增殖活性好、純度高、能在短時間內得到數量較多的MSCs，該干細胞制劑可減輕病人的治療痛苦及風險，加強了療效，縮短了治療時間。
作為優選，該干細胞制劑中各組分的用量為：
脂肪間充質干細胞： (1～10)×106個；
富血小板血漿： 1～10mL；
透明質酸水溶液： 1～10mL。
在本發明提供的實施例中，干細胞制劑中各組分的用量為：
脂肪間充質干細胞： (1～3)×106個；
富血小板血漿： 2mL；
透明質酸水溶液： 2mL。
作為優選，透明質酸水溶液的質量百分濃度為0.0008～0.0012g/mL。
在本發明中，透明質酸也可以為透明質酸鹽，如透明質酸鈉，同樣能夠實現本發明。在本發明提供的實施例中，透明質酸鹽為透明質酸鈉。
在本發明提供的實施例中，脂肪間充質干細胞為第2代脂肪間充質干細胞。
在本發明提供的實施例中，干細胞制劑的劑型為注射劑。
本發明還提供了該干細胞制劑在制備軟骨修復藥物中的應用。
在本發明提供的實施例中，軟骨為關節軟骨。
本發明還提供了該干細胞制劑的制備方法，包括：采用PRP重懸脂肪間充質干細胞，然后與透明質酸水溶液混勻，得到所述干細胞制劑。
在本發明提供的實施例中，脂肪間充質干細胞的制備方法為：將脂肪組織用生理鹽水沖洗，去除殘留的血細胞和組織碎片。向組織中加入等體積的0.1％Ⅰ型膠原酶，放入37℃氣浴振蕩器中消化30min。然后以1500r/min，離心10min后棄掉上層脂肪組織及下層懸液得到ADSCs。將其重懸，密度調整到1×105/mL，然后接種在培養面積為25cm2的細胞培養瓶中。當ADSCs融合度達80％左右，收集細胞使用、傳代或凍存。
在本發明提供的實施例中，富血小板血漿的制備方法為：靜脈抽取全血；第一次離心，1600r/min，離心10min，血液將被分層血漿和紅細胞2層，丟棄紅細胞層；第二次離心，5000r/min，離心5min，離心后吸棄部分血漿，用余下的制劑最終體積的二分之一體積的血漿重懸沉淀，制備成PRP。
本發明提供了一種干細胞制劑及其制備方法和應用。該干細胞制劑包括脂肪間充質干細胞、富血小板血漿及透明質酸水溶液。本發明至少具有如下優勢之一：
1、本發明將脂肪間充質干細胞與PRP、透明質酸或其鹽組合使用后，對關節軟骨損傷具有很好的修復作用，效果顯著好于微骨折手術；
2、脂肪間充質干細胞取材方便：抽脂手術操作簡單，痛楚少，只需抽取少量脂肪組織就能培養出大量的脂肪干細胞，且只抽取一次脂肪，就可以分多次制備制劑；脂肪間充質干細胞增殖活性好、純度高、能在短時間內得到數量較多的MSCs，生成修復性的纖維軟骨組織的療效更好；
3、本發明干細胞制劑使用操作簡單，可減輕病人的治療痛苦及風險，加強療效，縮短治療時間。
附圖說明
圖1示P2代脂肪間充質干細胞的形態，其中，1-1示P2代細胞放大40倍的形態，1-2示P2代細胞放大100倍的形態。
具體實施方式
本發明公開了一種干細胞制劑及其制備方法和應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
本發明提供了一種干細胞制劑，其制備方法包括：
1)ADSCs培養
將吸脂來源的脂肪組織用生理鹽水沖洗，去除殘留的血細胞和組織碎片。向組織中加入等體積的0.1％Ⅰ型膠原酶，放入37℃氣浴振蕩器中消化30min。然后以1500r/min，離心10min后棄掉上層脂肪組織及下層懸液得到ADSCs。將其重懸，密度調整到1×105/mL，然后接種在培養面積為25cm2的細胞培養瓶中。當ADSCs融合度達80％左右，收集細胞使用、傳代或凍存。
2)制備PRP
清潔消毒后，靜脈抽取全血10～20ml。第一次離心，1600r/min，離心10min，血液將被分層血漿和紅細胞2層，丟棄紅細胞層；第二次離心，5000r/min，離心5min，離心后吸棄部分血漿，用余下的制劑最終體積的二分之一體積的血漿重懸沉淀，制備成PRP。
3)取1)中培養好的ADSCs(1～3)×106個，用2)制備好的2ml PRP重懸干細胞。
4)取透明質酸鈉溶液，與含干細胞的PRP等體積混勻，制備成最終成品制劑，制劑中透明質酸鈉溶液與PRP體積比為1:1，干細胞不占體積。
5)向關節腔內注射制劑。
本發明提供的干細胞制劑及其制備方法和應用中所用試驗動物、試劑或儀器均可由市場購得。在本發明提供的實施例中，透明質酸鈉溶液的質量百分濃度為0.001g/mL。完全培養基為含有10％FBS的DMEM-F12培養基。
下面結合實施例，進一步闡述本發明：
實施例1
(1)ADSCs培養
提前2-3周，將吸脂來源的兔脂肪組織約10ml用生理鹽水沖洗，去除殘留的血細胞和組織碎片。向組織中加入等體積的0.1％Ⅰ型膠原酶，放入37℃氣浴振蕩器中消化30min。然后以1500r/min，離心10min后棄掉上層脂肪組織及下層懸液得到ADSCs。將其重懸，密度調整到1×105/mL，然后接種在培養面積為25cm2的細胞培養瓶中。待細胞生長至匯合度達80％，用PBS洗2遍后，往細胞中加入0.015ml/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化2min，用10倍于消化液的完全培養基終止酶解，取樣計數，200g離心5min，去上清，根據計數結果，用完全培養基重懸細胞沉淀至細胞密度為5×104cell/mL，接種培養。當ADSCs融合度達80％左右，收集細胞使用、傳代或凍存。P2代ADSCs細胞形態圖片見圖1。
由圖1可見，倒置顯微鏡下觀察傳代細胞，增殖能力較強，生長速度較快，形態、大小均一，呈放射狀至梭形整齊排列生長。凍存前，細胞折光性強，呈長梭形，無雜細胞，背景清晰，細胞純度較高。
(2)制備PRP
清潔消毒后，靜脈抽取全血20ml。第一次離心，1600r/min，離心10min，血液將被分層血漿和紅細胞2層，丟棄紅細胞層；第二次離心，5000r/min，離心5min，離心后吸棄部分血漿，用余下的2ml左右血漿重懸沉淀，制備成PRP。
(3)干細胞制劑的制備
取(1)中培養好的P2代ADSCs細胞1×106個，用2mL PRP重懸ADSCs。
取2mL透明質酸鈉溶液，與含ADSCs的PRP等體積混勻，制備成最終成品制劑。
(4)功效鑒定
1)建立兔子軟骨損傷模型
無菌環境下將兔的后腿膝關節內側縱行全層切開，全長2cm，直達關節腔，手搖鉆在股骨髁間前側鉆一直徑厚度達軟骨全層的圓形孔洞，造成全層膝關節軟骨損傷動物模型，切口間斷全層縫合四五針。術后各實驗動物均肌注慶大霉素4×104U/d至術后第3天以預防可能出現的術后感染。實驗動物均放回籠子正常飼養，不予制動措施。隨機取9只兔子分為3組，每組3只。
2)試驗分組
對比例1組：采用關節鏡，在軟骨損傷部位的軟骨下板打孔制造微骨折，當看到骨髓血從孔中散發出來時，說明打孔深度已達到要求。取2ml透明質酸鈉溶液與2ml PRP充分混勻后，注射到已進行微骨折手術的兔子的關節腔內。(微骨折手術+PRP+透明質酸鈉)
對比例2組：取2ml透明質酸鈉溶液與2ml PRP充分混勻后，注射到兔子的關節腔內。(PRP+透明質酸鈉)
對比例3組：取P2代ADSCs細胞1×106個，用4mL PRP重懸ADSCs。
對比例4組：取P2代ADSCs細胞1×106個，用4mL透明質酸鈉溶液重懸ADSCs。
實施例1組：將本實施例1制備成的最終成品制劑注射到兔子的關節腔內。(ADSCs+PRP+透明質酸鈉)
3)試驗結果
動物一般狀況觀察：9只兔子術后均能正常活動、進食及飲水，未出現膝關節紅腫、流膿等感染表現，未出現其他疾病情況。
軟骨修復大體形態觀察結果：術后3個月，分別處死各組實驗兔，對膝關節軟骨進行大體形態觀察。具體如下：
實施例1軟骨損傷區域不明顯，全部由軟骨樣組織覆蓋，新生組織與周圍正常軟骨組織無明顯界限，表面光滑；
對比例1關節軟骨損傷區域較明顯，邊緣增生，形態規則，中央部不平整，可見新生組織覆蓋，覆蓋組織呈白色，與損傷邊緣邊界不清，軟骨退變較嚴重。
對比例2軟骨損傷區域明顯，邊緣無增生，形態極不規則，裂隙明顯，未見或極少見新生組織覆蓋，軟骨退變嚴重。
對比例3關節軟骨損傷區域不太明顯，可見新生組織覆蓋，覆蓋組織呈白色，與損傷邊緣邊界模糊。
對比例4關節軟骨損傷區域不太明顯，可見新生組織覆蓋，覆蓋組織呈白色，與損傷邊緣邊界模糊。
實施例2
(1)ADSCs培養
提前2-3周，將吸脂來源的兔脂肪組織約10ml用生理鹽水沖洗，去除殘留的血細胞和組織碎片。向組織中加入等體積的0.1％Ⅰ型膠原酶，放入37℃氣浴振蕩器中消化30min。然后以1500r/min，離心10min后棄掉上層脂肪組織及下層懸液得到ADSCs。將其重懸，密度調整到1×105/mL，然后接種在培養面積為25cm2的細胞培養瓶中。待細胞生長至匯合度達80％，用PBS洗2遍后，往細胞中加入0.015ml/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化2min，用10倍于消化液的完全培養基終止酶解，取樣計數，200g離心5min，去上清，根據計數結果，用完全培養基重懸細胞沉淀至細胞密度為5×104cell/mL，接種培養。當ADSCs融合度達80％左右，收集細胞使用、傳代或凍存。
(2)制備PRP
清潔消毒后，靜脈抽取全血20ml。第一次離心，1600r/min，離心10min，血液將被分層血漿和紅細胞2層，丟棄紅細胞層；第二次離心，5000r/min，離心5min，離心后吸棄部分血漿，用余下的2ml左右血漿重懸沉淀，制備成PRP。
(3)干細胞制劑的制備
取(1)中培養好的P2代ADSCs細胞2×106個，用2mL PRP重懸ADSCs。
取2mL透明質酸鈉溶液，與含ADSCs的PRP等體積混勻，制備成最終成品制劑。
(4)功效鑒定
1)建立兔子軟骨損傷模型
無菌環境下將兔的右側后腿膝關節內側縱行全層切開，全長2cm，直達關節腔，手搖鉆在股骨髁間前側鉆一直徑厚度達軟骨全層的圓形孔洞，造成全層膝關節軟骨損傷動物模型，切口間斷全層縫合四五針。術后各實驗動物均肌注慶大霉素4×104U/d至術后第3天以預防可能出現的術后感染。實驗動物均放回籠子正常飼養，不予制動措施。隨機取3只兔子。
2)試驗結果
動物一般狀況觀察：兔子術后均能正常活動、進食及飲水，未出現膝關節紅腫、流膿等感染表現，未出現其他疾病情況。
軟骨修復大體形態觀察結果：術后3個月，處死實驗兔，對膝關節軟骨進行大體形態觀察。實施例2軟骨損傷區域不明顯，全部由軟骨樣組織覆蓋，新生組織與周圍正常軟骨組織無明顯界限，表面光滑，與實施例1效果對比沒有明顯差異。
實施例3
(1)ADSCs培養
提前2-3周，將吸脂來源的兔脂肪組織約10ml用生理鹽水沖洗，去除殘留的血細胞和組織碎片。向組織中加入等體積的0.1％Ⅰ型膠原酶，放入37℃氣浴振蕩器中消化30min。然后以1500r/min，離心10min后棄掉上層脂肪組織及下層懸液得到ADSCs。將其重懸，密度調整到1×105/mL，然后接種在培養面積為25cm2的細胞培養瓶中。待細胞生長至匯合度達80％，用PBS洗2遍后，往細胞中加入0.015ml/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化2min，用10倍于消化液的完全培養基終止酶解，取樣計數，200g離心5min，去上清，根據計數結果，用完全培養基重懸細胞沉淀至細胞密度為5×104cell/mL，接種培養。當ADSCs融合度達80％左右，收集細胞使用、傳代或凍存。
(2)制備PRP
清潔消毒后，靜脈抽取全血20ml。第一次離心，1600r/min，離心10min，血液將被分層血漿和紅細胞2層，丟棄紅細胞層；第二次離心，5000r/min，離心5min，離心后吸棄部分血漿，用余下的2ml左右血漿重懸沉淀，制備成PRP。
(3)干細胞制劑的制備
取(1)中培養好的P2代ADSCs細胞3×106個，用2mL PRP重懸ADSCs。
取2mL透明質酸鈉溶液，與含ADSCs的PRP等體積混勻，制備成最終成品制劑。
(4)功效鑒定
1)建立兔子軟骨損傷模型
無菌環境下將兔的右側后腿膝關節內側縱行全層切開，全長2cm，直達關節腔，手搖鉆在股骨髁間前側鉆一直徑厚度達軟骨全層的圓形孔洞，造成全層膝關節軟骨損傷動物模型，切口間斷全層縫合四五針。術后各實驗動物均肌注慶大霉素4×104U/d至術后第3天以預防可能出現的術后感染。實驗動物均放回籠子正常飼養，不予制動措施。隨機取3只兔子。
2)試驗結果
動物一般狀況觀察：兔子術后均能正常活動、進食及飲水，未出現膝關節紅腫、流膿等感染表現，未出現其他疾病情況。
軟骨修復大體形態觀察結果：術后3個月，處死實驗兔，對膝關節軟骨進行大體形態觀察。實施例3軟骨損傷區域不明顯，全部由軟骨樣組織覆蓋，新生組織與周圍正常軟骨組織無明顯界限，表面光滑，與實施例1效果對比沒有明顯差異。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。