本申請是申請日為2012年05月15日、申請號為201280035142.0、發明名稱為“噻唑化物類化合物用于預防和治療病毒性疾病、癌癥和由細胞內感染引起的疾病的用途”的中國專利申請的分案申請。

相關專利申請的交叉引用

本申請要求2011年5月16日遞交的美國臨時申請61/486,728的優先權，該臨時申請全部內容以引用的方式并入本文。

本發明針對用于免疫調節(包括預防或治療病毒性疾病、癌癥和由細胞內原生動物感染引起的疾病)的組合物和方法。

背景技術：

流行性感冒為高度傳染性的急性呼吸系統疾病，該疾病影響所有年齡群，并且每年僅在美國就引起大約36,000人死亡，超過226,000人住院治療。流感病毒根據其核蛋白和基質蛋白的抗原差異而進行分類(甲型、乙型和丙型)，流感病毒為有包膜的負鏈rna病毒。甲型流感病毒的許多亞型在它們的兩個表面糖蛋白(血凝素“ha”和神經氨酸酶“na”)方面存在不同，這兩個表面糖蛋白是保護性免疫反應的主要目標，且根據血凝素(用h數字表示)和神經氨酸酶(用n數字表示)的類型進行標記。由于抗原漂移和抗原轉變，ha和na連續不斷地變化。已知16個h亞型(或“血清型”)和9個n亞型。

乙型肝炎為由乙型肝炎病毒(hbv)引起的傳染性疾病。大約世界人口的四分之一，即多于20億人，已感染了乙型肝炎病毒。該急性疾病導致肝臟發炎、嘔吐、黃疸和罕有的死亡。慢性乙型肝炎可最終導致肝硬化和肝癌—對目前的化療有非常差的反應的絕癥。乙型肝炎病毒具有由部分雙鏈的dna構成的環狀基因組，且相似于逆轉錄酶病毒，通過rna中間體利用逆轉錄復制。盡管復制發生在肝臟中，但病毒擴散至血液，在受到感染的人的血液中，發現病毒特異性蛋白和其相應的抗體。

癌癥的特征在于異常細胞的不受控制的增長和擴散。由于腫瘤細胞源于正常細胞，故宿主免疫系統不會將腫瘤細胞抗原識別為外來的。另外，一些腫瘤細胞通過消除抗原或減少細胞表面上的受體的數目，來逃脫宿主免疫防御系統。

黑素瘤為起源于黑色素細胞中的惡性皮膚癌。如果早期發現和治療，黑素瘤幾乎是百分之百可治愈的。沒有早期治療，癌癥會發展、擴散，然后是致命的。黑素瘤為引起最多死亡人數的皮膚癌。表淺擴散型黑素瘤為最常見的黑素瘤類型，尤其在年輕人中。這種黑素瘤在滲透更深之前，相當長的時間影響皮膚的表層。惡性雀斑樣痣最常在長期暴露于太陽下的老年人中發現。肢端雀斑樣黑素瘤也在滲透更深之前表面地擴散，且是非洲裔美國人和亞洲人中最常見的黑素瘤，在白種人中是最不常見的。結節性黑素瘤在首次診斷出時通常是入侵性的，且是黑素瘤的最具攻擊性的形式。

白血病為血癌或骨髓癌，其特征在于白血球的異常增多。毛細胞白血病為罕見的惡性血液腫瘤，其特征在于骨髓中異常b淋巴細胞的累積，該異常b淋巴細胞干擾正常白血球、紅血球和血小板的生成。慢性髓性白血病(cml)為白血球癌癥，其特征在于骨髓中主要的骨髓細胞的增強的且不受調控的生長以及血液中這些細胞的累積。非霍奇金淋巴瘤會是攻擊性的或無痛的，可以出現在任何年齡段，且通常特點為淋巴結大于正常、發燒和體重減輕。b細胞非霍奇金淋巴瘤包括伯基特淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤(cll/sll)、彌漫性大b細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、免疫母細胞性大細胞淋巴瘤、前體b淋巴母細胞性淋巴瘤和套細胞淋巴瘤。t細胞非霍奇金淋巴瘤包括蕈樣真菌病、間變性大細胞淋巴瘤和前體t淋巴母細胞性淋巴瘤。

腎細胞癌，包括腎細胞癌、腎盂癌和腎母細胞瘤，是成年人中最常見的腎癌類型。在2010年，僅在美國就有58,240個估計新病例和13,040人死亡。

盡管通過分子生物學在腫瘤抗原的識別及其以重組和合成形式的生成方面取得的重大進展已使得許多復雜的方法運用到癌癥治療中，但腫瘤細胞疫苗的產生免疫性的成功最終取決于抗原遞呈細胞上的主要組織相容性復合體(mhc)的表達和由宿主免疫系統將腫瘤抗原看作“外來的”的識別。然而，預防和治療受到病原體的逃避宿主免疫反應的能力的阻礙。

因此，對于病毒性疾病和癌癥疾病，在本領域中強烈地需要開發新的預防和治療方案。

硝唑尼特(nitazoxanide)(2-(乙酰氧基)-n-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺)為噻唑化物類(thiazolide)抗寄生蟲藥，具有下面的結構：

替唑尼特(tizoxanide)為硝唑尼特的活性循環代謝物。人類口服硝唑尼特或硝唑尼特和替唑尼特的混合物后，這些化合物部分被腸道吸收，且硝唑尼特在血漿中被快速地水解形成替唑尼特。替唑尼特與血漿蛋白結合，替唑尼特的排尿半衰期為7.3小時。替唑尼特與葡糖醛酸共軛，且該藥物在尿液和膽汁中排泄為替唑尼特或替唑尼特葡糖苷酸。在血漿中替唑尼特的半衰期僅大約為1.5小時。替唑尼特具有下面的結構：

rm-4848為替代的噻唑化物類，其具有與替唑尼特相同結構，但包括替代硝基的氯代基團，從而產生化合物n-(5-氯代噻唑-2-基)-2-羥基苯甲酰胺。硝唑尼特(ntz)和替唑尼特(tiz)為具有抗寄生蟲、厭氧細菌和病毒的活性的噻唑化物類化合物。ntz在美國被批準用于治療由小球隱孢子蟲(cryptosporidiumparvum)和藍氏賈第鞭毛蟲(giardialamblia)引起的腹瀉。ntz和tiz也抑制包括甲型流感病毒和丙型肝炎病毒的rna病毒和dna病毒的復制。在臨床試驗中，ntz被證明在治療輪狀病毒性胃腸炎、諾羅病毒性胃腸炎和慢性丙型肝炎中是有效的，且對于治療流行性感冒，正處于后期臨床開發階段。

技術實現要素：

本發明提供了包含噻唑化物類的藥物組合物用于免疫調節有需要的對象的用途，包括用于預防和/或治療病毒性疾病、癌癥和由細胞內原生動物感染或細菌感染引起的疾病的用途。在特定實施方式中，本發明提供了一種在有需要的對象中刺激免疫應答的方法，包括向該對象施用藥物組合物，該藥物組合物包括治療有效量的噻唑化物類化合物。本發明可接受的噻唑化物類化合物包括在美國專利no.7,645,783、no.7,550,493、no.7,285,567、no.6,117,894、no.6,020,353、no.5,968,961、no.5,965,590、no.5,935,591和no.5,886,013中描述的那些噻唑化物類化合物，這些專利全部內容以引用的方式并入本文。在優選的實施方式中，噻唑化物類試劑為硝唑尼特。在另一優選實施方式中，噻唑化物類試劑為替唑尼特。在又一優選實施方式中，噻唑化物類試劑為rm-4848或其酯前體藥物rm-5038。在本發明的優選方面，所述對象患有病毒性感染。在本發明的另一個優選方面，所述對象存在發展成病毒性感染的危險。在本發明的一個方面，病毒性感染為流行性感冒。流行性感冒可由選自hlnl、h2n2、h3n2、h5n1、h7n7、h1n2、h9n2、h7n2、h7n3和h10n7的病毒所引起。在本發明的另一個方面，病毒性感染為乙型肝炎。在優選的實施方式中，單獨施用噻唑化物類化合物。在其它的優選實施方式中，噻唑化物類化合物與神經氨酸酶抑制劑(如，那尼納米韋、奧司他韋、扎那米韋或帕拉米韋)、或免疫刺激劑(如，咪喹莫特或雷西莫特)、或金剛烷類似物、或重組唾液酸酶融合蛋白、或抗乙型肝炎藥物聯合施用。在又一優選實施方式中，噻唑化物類化合物與疫苗聯合施用。

在本發明的另一優選方面，所述對象患有癌癥。在本發明的一不同的優選方面，所述對象存在發展成癌癥的危險。在一個實施方式中，癌癥為白血病。優選地，白血病為毛細胞白血病或慢性髓性白血病。在本發明的不同的方面，癌癥為黑素瘤。在本發明的又一方面，癌癥為非霍奇金淋巴瘤。在本發明的另一個方面，癌癥為腎細胞癌。在一個優選實施方式中，單獨施用噻唑化物類化合物。在本發明的另一優選實施方式中，噻唑化物類化合物與疫苗、或免疫刺激劑、或抗癌藥物聯合施用。抗癌藥物可以包括但不受限于sti571、cgp74588、1-β-d-阿糖呋喃胞嘧啶(ara-c)、阿霉素、達卡巴嗪、順氯氨鉑、博萊霉素、長春新堿、洛莫司汀、長春花堿、卡莫司汀、dtic、它莫西芬、舒尼替尼、索拉非尼和干擾素α。

在本發明的另一優選方面，所述對象患有細胞內原生動物感染。在本發明的不同的優選方面，所述對象存在發展成細胞內原生動物感染的危險。在一個實施方式中，細胞內原生動物感染為隱孢子蟲屬(cryptosporidiumspp.)。在本發明的不同方面，細胞內原生動物感染為利什曼原蟲屬(leishmaniaspp.)。在本發明的又一方面，細胞內原生動物感染為剛地弓形蟲(toxoplasmagondii)。在本發明的另一方面，細胞內原生動物感染為克氏錐蟲(trypanosomacruzi)。在一個優選實施方式中，單獨施用噻唑化物類化合物。

在本發明的另一優選實施方式中，噻唑化物類化合物與疫苗、或免疫刺激劑、或抗原生動物藥聯合施用。抗原生動物藥可以包括但不受限于甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲惡唑、阿托伐醌、克林霉素、乙胺嘧啶、螺旋霉素、二脒那秦(diminazine)、胡米銨、蘇拉明、美拉索明(melarsamine)、葡萄糖酸銻鈉和銻酸葡甲胺。

在本發明的另一優選方面，所述對象患有細胞內細菌感染。在本發明的不同優選方面，所述對象存在發展成細胞內細菌感染的危險。在一個實施方式中，細胞內細菌感染為結核分支桿菌。

在一個特定實施方式中，本發明提供了一種治療或預防有需要的對象中的病毒性感染的方法，包括向該對象施用藥物組合物，該藥物組合物包括治療有效量的噻唑化物類化合物。在優選的實施方式中，噻唑化物類試劑為硝唑尼特。在另一優選實施方式中，噻唑化物類試劑為替唑尼特。在又一優選實施方式中，噻唑化物類試劑為rm-4848或其藥學上可接受的前體藥物。在本發明的一個方面，病毒性感染為流行性感冒。流行性感冒可由選自hlnl、h2n2、h3n2、h5n1、h7n7、h1n2、h9n2、h7n2、h7n3和h10n7的病毒所引起。在本發明的另一個方面，病毒性感染為乙型肝炎。在本發明的另一個方面，病毒性感染為由輪狀病毒或諾羅病毒引起的腹瀉或胃腸炎。在優選的實施方式中，單獨施用噻唑化物類化合物。在其它的優選實施方式中，噻唑化物類化合物與神經氨酸酶抑制劑(如，那尼納米韋、奧司他韋、扎那米韋或帕拉米韋)、或免疫刺激劑(如，咪喹莫特或雷西莫特)、或金剛烷類似物、或重組唾液酸酶融合蛋白、或抗乙型肝炎藥物聯合施用。在又一優選實施方式中，噻唑化物類化合物與疫苗聯合施用。

在另一特定實施方式中，本發明提供了一種治療或預防在有需要的對象中的癌癥的方法，包括向該對象施用藥物組合物，該藥物組合物包括治療有效量的噻唑化物類化合物。在優選的實施方式中，噻唑化物類試劑為硝唑尼特。在另一優選實施方式中，噻唑化物類試劑為替唑尼特。在又一優選實施方式中，噻唑化物類試劑為rm-4848。在本發明的特別方面，癌癥為白血病。優選地，白血病為毛細胞白血病或慢性髓性白血病。在本發明的不同的方面，癌癥為黑素瘤。在本發明的又一方面，癌癥為非霍奇金淋巴瘤。在本發明的另一個方面，癌癥為腎細胞癌。在一個優選實施方式中，單獨施用噻唑化物類化合物。在本發明的另一優選實施方式中，噻唑化物類化合物與疫苗、或免疫刺激劑、或抗癌藥物聯合施用。抗癌藥物可以包括但不受限于sti571、cgp74588、1-β-d-阿糖呋喃胞嘧啶(ara-c)、阿霉素、達卡巴嗪、順氯氨鉑、博萊霉素、長春新堿、洛莫司汀、長春花堿、卡莫司汀、dtic、它莫西芬、舒尼替尼、索拉非尼和干擾素α。

在又一特定實施方式中，本發明提供了一種治療或預防在有需要的對象中的細胞內原生動物感染的方法，包括向該對象施用藥物組合物，該藥物組合物包括治療有效量的噻唑化物類化合物。在優選的實施方式中，噻唑化物類試劑為硝唑尼特。在另一優選實施方式中，噻唑化物類試劑為替唑尼特。在又一優選實施方式中，噻唑化物類試劑為rm-4848。在本發明的特別方面，細胞內原生動物感染為隱孢子蟲屬。在本發明的不同方面，癌癥為黑素瘤。在本發明的不同方面，細胞內原生動物感染為利什曼原蟲屬。在本發明的又一方面，細胞內原生動物感染為剛地弓形蟲。在本發明的另一方面，細胞內原生動物感染為克氏錐蟲。在一個優選實施方式中，單獨施用噻唑化物類化合物。在本發明的另一優選實施方式中，噻唑化物類化合物與疫苗、或免疫刺激劑、或抗原生動物藥聯合施用。抗原生動物藥可以包括但不受限于甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲惡唑、阿托伐醌、克林霉素、乙胺嘧啶、螺旋霉素、二脒那秦(diminazine)、胡米銨、蘇拉明、美拉索明(melarsamine)、葡萄糖酸銻鈉和銻酸葡甲胺。

在患有免疫缺陷的對象中，有效地治療或預防病毒性疾病、癌癥或細胞內原生動物感染或細菌感染所需的免疫應答可不由噻唑化物類利用通常用于成功地治療具有完全勝任的免疫系統的對象的給藥方案而產生。患有極度免疫缺陷的對象不會是利用噻唑化物類治療的好的人選。患有中度免疫缺陷的對象相比于具有完全勝任的免疫系統的對象，可需要較高劑量的噻唑化物類治療、較頻繁地給藥、或較長的給藥時間段。還未發展成免疫缺陷的患有hiv(人類免疫缺陷病毒)感染的對象可以通過噻唑化物類有效地治療，然而，患有與hiv感染相關聯的免疫缺陷的對象，在通過噻唑化物類治療之前或與噻唑化物類治療同時，可需要通過抗逆轉錄病毒藥物的治療以減小hiv病毒滴度，以及部分地恢復免疫功能。因此，使用噻唑化物類刺激免疫應答可基于免疫狀態而為病人特別設計。

前述一般說明和下面的附圖的簡要說明和詳細的說明書是示例性的和解釋性的，用來提供所要求保護的本發明的進一步解釋。對于本領域的技術人員而言，從本發明的下面的詳細描述中，其它的目的、優點和新穎特征將是顯而易見的。

附圖說明

圖1a、圖1b和圖1c為表示在未受刺激和受流行性感冒刺激的條件下，不存在替唑尼特或存在不同劑量的替唑尼特時cd14+單核細胞的圖。顯示了平均值、s.e.(標準誤差)和p值。

圖2a、圖2b和圖2c為表示在未受刺激和受流行性感冒刺激的條件下，不存在替唑尼特或存在不同劑量的替唑尼特時，在未受刺激和受流行性感冒刺激的外周血單核細胞(pbmc)中的tlr(toll樣受體)路徑的替唑尼特調節的圖。顯示了平均值。

圖3a、圖3b和圖3c為表示在未受刺激和受流行性感冒刺激的條件下，不存在替唑尼特或存在不同劑量的替唑尼特時，在未受刺激和受流行性感冒刺激的pbmc中的ifn(干擾素)路徑的替唑尼特調節的圖。顯示了平均值。

圖4a和圖4b為表示在未受刺激和受流行性感冒刺激的條件下，不存在替唑尼特或存在不同劑量的替唑尼特時，輔助性t細胞的功能(分泌ifng和il2(白細胞介素2)的cd4+t細胞)的圖。顯示了平均值、s.e.和p值。

圖5a、圖5b和圖5c為表示在未受刺激和受流行性感冒刺激的條件下，不存在替唑尼特或存在不同劑量的替唑尼特時，細胞毒性t細胞的功能(表達穿孔素、顆粒酶和脂肪酸合成酶(fas)的cd8+t細胞)的圖。顯示了平均值、s.e.和p值。

圖6a、圖6b和圖6c為表示在未受刺激和受流行性感冒刺激的條件下，表達tlr3(圖6a)、tlr7(圖6b)和tlr8(圖6c)的cd14+細胞的百分比的圖。顯示了不存在rm4848或存在五種不同劑量的rm4848(0.5μg/ml；1.0μg/ml；10μg/ml；20μg/ml；40μg/ml)時所獲得的數據。示出了平均值、s.e.和p值。

圖7a和圖7b為表示在未受刺激(圖7a)和受流行性感冒刺激(圖7b)的條件下，在通過三種不同劑量的rm4848(1.0μg/ml；10μg/ml；20μg/ml)刺激之后的toll樣受體信號路徑mrna(信使核糖核酸)表達的圖。在toll樣受體信號路徑中涉及的84個基因的表達已通過實時定量反轉錄聚合酶鏈式反應(rt-pcr)而評估，相對于5個管家基因而計算，且顯示為自未受刺激樣品的倍數變化表達。在圖中僅顯示了在替唑尼特刺激之后示出了不同的表達水平的靶點。

圖8a和圖8b為表示在未受刺激(圖8a)和受流行性感冒刺激(圖8b)的條件下，在通過三種不同劑量的rm4848(1.0μg/ml；10μg/ml；20μg/ml)刺激之后的i型干擾素信號路徑mrna表達的圖。在i型干擾素信號路徑中涉及的84個基因的表達已通過實時定量rt-pcr而評估，相對于5個管家基因而計算，且顯示為自未受刺激樣品的倍數變化表達。在圖中僅顯示了在替唑尼特刺激之后示出了不同的表達水平的靶點。

圖9a和圖9b為表示在未受刺激和受流行性感冒刺激的條件下，分泌ifnγ(圖9a)和il2(圖9b)的cd4+t細胞的百分比的圖。顯示了不存在rm4848或存在五種不同劑量的rm4848(0.5μg/ml；1.0μg/ml；10μg/ml；20μg/ml；40μg/ml)時所獲得的數據。示出了平均值、s.e.和p值。

圖10a、圖10b和圖10c為表示本發明的實施方式的圖，其中表示在未受刺激和受流行性感冒刺激的條件下，表達顆粒酶(圖10a)、穿孔素(圖10b)和fas(圖10c)的cd8+t細胞的百分比。顯示了不存在rm4848或存在五種不同劑量的rm4848(0.5μg/ml；1.0μg/ml；10μg/ml；20μg/ml；40μg/ml)時所獲得的數據。示出了平均值、s.e.和p值。

圖11a和圖11b示出表示本發明的實施方式的圖，其中，評估了在感染后的5天時，不存在替唑尼特或存在不同劑量的替唑尼特(1.0μg/ml；10μg/ml)時hiv-1復制的抑制：在暴露于hiv的pbmc中的p24水平(圖11a)和hiv復制的抑制百分比(圖11b)。示出了平均值、s.e.和p值。

具體實施方式

除另有規定外，“一”意為“一個或多個”。

本發明的組合物和方法用來刺激有需要的對象中的免疫應答，從而預防和治療感染和/或癌癥疾病。本發明的目的是提供有效的非侵入性的方法以通過在有需要的對象中刺激強烈的免疫應答來預防和治療該對象中的病毒性感染、癌癥疾病和/或由細胞內原生動物感染引起的疾病，該免疫應答由先天的和后天的免疫系統介導。

先天免疫系統給予對抗感染的立即的短期的防御，在炎癥部位處提供吞噬細胞、尤其是中性粒細胞的聚集，該吞噬細胞、尤其是中性粒細胞接著刺激白細胞和淋巴細胞的釋放，并伴隨著產生細胞因子，包括tnf(腫瘤壞死因子)、hmgb1(高遷移率族蛋白1)和il-1(白細胞介素-1)。先天的白細胞包括自然殺傷細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和吞噬細胞，該吞噬細胞包括巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞。toll樣受體(tlr)為先天免疫系統的關鍵組分，這是因為tlr檢測微生物感染，且引發抗微生物宿主防御應答。tlr控制多個樹突狀細胞功能，且引發導致后天免疫系統應答(包括生成i型干擾素(iifn))的級聯。tlr3、tlr7、tlr8和tlr9參與病毒檢測，且識別病原體核酸。tlr7、tlr8和tlr9位于細胞內內溶酶體的區室中。

當病原體逃脫了先天免疫系統時在脊椎動物中所引發的后天免疫系統或適應性免疫系統負責在抗原呈遞期間識別特定的“非自體”抗原和負責目的在于消除外來病原體或病原體所感染的細胞的免疫應答。在后天免疫系統中，b細胞參與體液免疫應答，且t細胞負責細胞介導免疫應答。通過樹突狀細胞的抗原呈遞刺激t細胞，以成為“細胞毒性”cd8+細胞或“輔助性”cd4+細胞。

在淋巴結中，樹突狀細胞通過將“非自體”抗原結合至主要組織相容性復合體(mhc，在人類中也被稱為人類白細胞抗原(hla))而在其表面上呈現出“非自體”抗原，該主要組織相容性復合體由穿過淋巴結的t細胞識別。外源性抗原通常顯示在mhcii類分子上，該外源性抗原激活cd4+輔助性t細胞。由在宿主細胞內復制的病毒產生的內源性抗原通常顯示在mhci類分子上，且激活cd8+細胞毒性t細胞。后天免疫系統包括細胞毒性t細胞，也被稱為tc、殺傷性t細胞或細胞毒性t淋巴細胞(ctl)。一旦細胞毒性t細胞中的t細胞受體(tcr)與肽結合的mhci類分子相互作用，ctl變得有活性，且變成效應器ctl，釋放細胞毒素(如穿孔素和顆粒溶素)，該細胞毒素在靶細胞的質膜中形成孔。通過cd4+淋巴細胞或輔助性t細胞調控ctl激活。輔助性t細胞表達t細胞受體(tcr)，該tcr識別與mhcii類分子結合的抗原。效應器cd4+t輔助性細胞可以通過引發thl型或th2型應答來對感染進行應答。thl應答導致細胞介導免疫，且特征在于生成干擾素γ，該干擾素γ激活巨噬細胞，且誘導b細胞產生抗體。th2應答導致體液免疫，且特征在于釋放白細胞介素4，隨后激活b細胞和產生中和抗體。通常，thl應答更加有效地抵抗細胞內病原體(如在宿主細胞內部的病毒和細菌)，而th2應答更加有效地抵抗細胞外細菌、寄生蟲和毒素。

本發明人發現，噻唑化物類試劑(尤其是硝唑尼特、替唑尼特和rm-4848)或其前體藥物的抗病毒效應起因于這些試劑的免疫調節活性，這些試劑能夠通過激活先天的和后天的免疫系統而刺激強烈的免疫應答。特別地，本申請的發明人發現，硝唑尼特、替唑尼特和rm-4848通過誘導如下方面的增加來刺激t輔助性細胞和ctl的活性、tlr7和tlr8的表達和i型干擾素應答：1)分泌ifnγ和il2的cd4+t細胞，2)ctl脫粒，3)表達fas的cd8+t細胞，4)表達tlr8的單核細胞，5)ifnα-mrna表達和ifnβ-mrna表達，6)對于i型ifn誘導型基因(mxa、prkcz、adar、cxcl10、irf1、prkra)特異性的mrna，和7)對于在mhci類呈遞中涉及的基因(hla-a、hla-b、tap1)特異性的mrna。因此，在有需要的對象中，尤其是在存在發展成需要強烈的免疫應答的疾病(如病毒性感染、癌癥或由細胞內原生動物感染所引起的疾病)的危險或患有這樣的疾病的對象中，這些噻唑化物類試劑可用于刺激免疫應答。此外，本發明的方法可用來減輕疾病的癥狀，或在對象中用作預防措施。

術語“對象”和“患者”可交換地使用，且意思是指患有病毒性感染或癌癥疾病或存在發展成病毒性感染或癌癥疾病的風險的任何哺乳動物，包括人類。該對象或患者典型地為人類，然而，其他適合的對象或患者包括但不受限于實驗用動物(如小鼠、大鼠、兔子或豚鼠)、農場動物和家畜或寵物。也包括非人靈長類動物。

本文中使用的術語“治療”指的是降低癥狀的嚴重程度和/或發生率、消除癥狀和/或根本病因、預防癥狀的發生和/或癥狀的根本病因(如，預防性治療)、改善或修復損傷、或降低感染的強度。

本文中使用的“治療有效量”為對于引起臨床上顯著的細胞應答有效的量。

“藥學上可接受的”意為生物學上或其它方面可取的材料，即，該材料可被包含在藥物組合物中，且可向患者施用，而不造成任何不良的生物效應或不以有害的方式與包含該材料的組合物中的任何其他組分相互作用。當術語“藥學上可接受的”用來指藥物載體或賦形劑時，意味著該載體或賦形劑已滿足毒物學和生產測試的必需標準，或意味著該載體或賦形劑包含在由美國藥物管理局編制的非活性成分指南中。

本發明的方法考慮施用含有噻唑化物類化合物的制劑。本發明可接受的噻唑化物類化合物為在美國專利no.7,645,783、no.7,550,493、no.7,285,567、no.6,117,894、no.6,020,353、no.5,968,961、no.5,965,590、no.5,935,591、no.5,886,013中公開的那些噻唑化物類化合物，這些專利全部內容以引用的方式并入本文。優選的噻唑化物類化合物為硝唑尼特、替唑尼特或rm-4848、或rm-4848的酯類前體藥物rm-5038。應當理解，與rm-5038相似或同源的其它前體藥物也被考慮，且作為本發明的實施方式。本文所使用的術語“噻唑化物類”指的是噻唑化物類、噻唑化物類類似物或被取代的噻唑化物類。本文所使用的術語“硝唑尼特”指的是硝唑尼特(2-(乙酰氧基)-n-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺)和硝唑尼特類似物，例如，在美國專利no.7,285,567或us2007/0167504中公開的化合物之一。本文所使用的術語“替唑尼特”指的是替唑尼特、替唑尼特類似物或被取代的替唑尼特。硝唑尼特、替唑尼特、rm-4848或任何一種噻唑化物類類似物可以以化合物本身的形式施用，和/或，在適當情況下，可以以鹽、多形體、酯、酰胺、前體藥物、衍生物等形式施用，條件是所述的鹽、多形體、酯、酰胺、前體藥物或衍生物為藥理學上適宜的。這些活性試劑的這樣的鹽、酯、酰胺、前體藥物和其它衍生物可利用標準方法而制備，該標準方法是有機合成化學領域中的技術人員熟知的，且例如由以下文獻描述：j.march，advancedorganicchemistry：reactions，mechanismsandstructure，第四版(紐約：wiley-interscience，1992)。本發明的組合物中的硝唑尼特或替唑尼特的總量通常大約為組合物的重量的60％至75％。該組合物可配制成用于速釋、控釋或緩釋。該組合物可含有一種或多種另外的藥學上可接受的添加劑或賦形劑。這些賦形劑是本領域中公知的且認可的治療惰性成分。本文中所使用的術語“惰性成分”指的是制藥科學領域熟知的治療上的惰性成分，這些惰性成分可單獨地使用或以各種組合的方式使用，所述惰性成分包括：例如，稀釋劑、崩解劑、粘合劑、懸浮劑、助流劑、潤滑劑、填充劑、包衣劑、增溶劑、甜味劑、著色劑、芳香劑和抗氧化劑。例如，參見remington：由e.w.martin編輯的thescienceandpracticeofpharmacy1995，馬克出版公司，第19版，賓夕法尼亞州伊斯頓。

稀釋劑或填充劑的示例包括但不限于淀粉、乳糖、木糖醇、山梨醇、糖果店的糖、可壓縮糖、葡萄糖結合劑、糊精、右旋糖、左旋糖、乳糖醇、甘露醇、蔗糖、滑石、微晶纖維素、碳酸鈣、二元磷酸鈣或三元磷酸鈣、二水磷酸氫鈣、硫酸鈣等。稀釋劑或填充劑的量可以在整個組合物的重量的大約2％至大約15％之間的范圍內。

崩解劑的示例包括但不限于海藻酸、甲基丙烯酸dvb(二乙烯基苯)、交聯pvp(聚乙烯吡咯烷酮)、微晶纖維素、可斯卡麥勒斯鈉、交聚維酮、波拉克林鉀、羧基乙酸淀粉鈉、淀粉(包括玉米淀粉或玉蜀黍淀粉、預膠化淀粉)等。通常地，崩解劑占整個組合物的重量的大約2％至大約15％。

粘合劑的示例包括但不限于：淀粉，如馬鈴薯淀粉、小麥淀粉、玉米淀粉；微晶纖維素；纖維素，如羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素(hpmc)、乙基纖維素、羧基甲基纖維素鈉；天然樹膠，如阿拉伯樹膠、海藻酸、瓜爾豆膠；液體葡萄糖、糊精、聚維酮、糖漿、聚氧化乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚-n-乙烯基酰胺、聚乙二醇、明膠、聚丙二醇、黃蓍膠等。粘合劑的量為整個組合物的重量的大約0.2％至大約14％。

助流劑的示例包括但不限于二氧化硅、膠態無水二氧化硅、三硅酸鎂、磷酸三鈣、硅酸鈣、硅酸鎂、膠態二氧化硅、粉狀纖維素、淀粉、滑石等。助流劑的量為整個組合物的重量的大約0.01％至大約0.3％。

潤滑劑的示例包括但不限于硬脂酸鎂、硬脂酸鋁、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂酸、聚乙二醇、山崳酸甘油酯、礦物油、硬脂富馬酸鈉、滑石、氫化植物油等。潤滑劑的量為整個組合物的重量的大約0.2％至大約1.0％。

組合物可以包含作為低粘度聚合物的粘合劑。低粘度聚合物的示例包括但不限于低粘度羥丙基甲基纖維素聚合物(如由dowchemical出售的商標名(如methocelmethocel和methocel)的產品)和低粘度羥乙基纖維素聚合物。通常地，低粘度聚合物占整個組合物的總重量的大約10％至大約20％，或大約10％至大約15％，或優選大約12％，或者，在具有控釋部分和速釋部分的實施方式中，通常地，在控釋部分中的低粘度聚合物占控釋部分的重量的大約15％至大約20％，優選大約18％。

組合物還可以包括包衣材料。通常地，包衣材料呈現為劑型上的完全覆蓋制劑的外層。例如，在一些實施方式中，劑型為口服片劑，在該口服片劑中，控釋部分形成片劑的第一層，速釋部分形成在第一層上面沉積的第二層，從而形成芯片劑。在這種實施方式中，例如，包衣材料可以處于在芯片劑的上面沉積的外包衣層的形式。通常地，包衣材料為組合物的重量的大約1％至大約5％，且可以包括羥丙基甲基纖維素和/或聚乙二醇和選自包衣劑、遮光劑、掩味劑、填充劑、拋光劑、著色劑、抗粘著劑等中的一種或多種賦形劑。對于本領域的技術人員而言，包膜物質和用于使用這種包衣物質的方法的示例是公知的。

本發明的組合物可有效地用來在有需要的對象中刺激免疫系統，從而治療或預防病毒性感染、癌癥或由細胞內原生動物感染或細胞內細菌感染引起的疾病。病毒性感染可以為流行性感冒(尤其是由選自hlnl、h2n2、h3n2、h5n1、h7n7、h1n2、h9n2、h7n2、h7n3和h10n7的病毒所引起的流行性感冒)、或乙型肝炎、或由輪狀病毒或諾羅病毒引起的腹瀉或胃腸炎。癌癥可以為白血病(包括毛細胞白血病和慢性髓性白血病)、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤或腎細胞癌。由細胞內原生動物感染引起的疾病可以為隱孢子蟲屬、利什曼原蟲屬、剛地弓形蟲、克氏錐蟲。由細胞內細菌感染引起的疾病可以為結核分支桿菌。組合物可被施用任何時間長度，該時間長度適合于有效地治療或預防病毒性感染、癌癥或由細胞內原生動物感染引起的疾病。任何適當的劑量和方案可用于該組合物。通常地，在大約3天至大約104周的時間段內可進行施用，然而可以在長于104周的時間段內進行施用，甚至可以無限期地施用。適當的方案可由醫師確定。

噻唑化物類化合物可被單獨施用或結合一種或多種另外的活性試劑施用，該活性試劑包括神經氨酸酶抑制劑(如，那尼納米韋、奧司他韋、扎那米韋或帕拉米韋)、免疫刺激劑(如，咪喹莫特或雷西莫特)、金剛烷類似物和重組唾液酸酶融合蛋白。噻唑化物類化合物也可被單獨施用或結合一種或多種包括抗原生動物藥的另外的活性試劑施用。抗原生動物藥可以包括但不受限于甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲惡唑、阿托伐醌、克林霉素、乙胺嘧啶、螺旋霉素、二脒那秦(diminazine)、胡米銨、蘇拉明、美拉索明(melarsamine)、葡萄糖酸銻鈉和銻酸葡甲胺。在預防上，可以結合疫苗或結合抗癌藥物施用噻唑化物類化合物。抗癌藥物可以包括但不受限于sti571(甲磺酸伊馬替尼)、cgp74588、1-β-d-阿糖呋喃胞嘧啶(阿糖胞苷)、阿霉素、達卡巴嗪、順氯氨鉑、博萊霉素、長春新堿、洛莫司汀、長春花堿、卡莫司汀、dtic、它莫西芬、舒尼替尼、索拉非尼和干擾素α。可以同時地、或分開地、或在不同的組合物(包括在劑型、釋放曲線等方面不同的分開的組合物)中施用所述組合物和另外的活性試劑(如干擾素)。要理解，上文的描述以及隨后的實施例用來說明但不限制本發明的范圍。對于本發明所屬領域的技術人員而言，在本發明的范圍內的其他方面、優點和變型將是顯而易見的。

在患有免疫缺陷的對象中，有效地治療或預防病毒性疾病、癌癥或細胞內原生動物感染或細胞內細菌感染所需的免疫應答不可由噻唑化物類利用通常用于成功地治療具有完全勝任的免疫系統的對象的給藥方案而產生。患有極度免疫缺陷的對象不會是利用噻唑化物類治療的好的人選。患有中度免疫缺陷的對象相比于具有完全勝任的免疫系統的對象，可需要較高劑量的噻唑化物類治療、較頻繁地給藥、或較長的給藥時間段。還未發展成免疫缺陷的患有hiv(人類免疫缺陷病毒)感染的對象可以通過噻唑化物類有效地治療，然而，患有與hiv感染相關聯的免疫缺陷的對象，在通過噻唑化物類治療之前或與噻唑化物類治療同時，可需要通過抗逆轉錄病毒藥物的治療以減小hiv病毒滴度，以及部分地恢復免疫功能。因此，使用噻唑化物類刺激免疫應答可基于免疫狀態而為病人特別設計。

實施例

實施例1：細胞制備

單核血細胞在免疫應答系統中具有重要作用，這是因為單核血細胞響應于病原體感染而產生不同的細胞因子。因此，在從10名健康的捐贈者獲得的且在菲科帕克(ficoll-paque)上通過離心分離而分離的外周血單核細胞(pmbc)中，測試替唑尼特(tiz)的免疫調節效應。在未受刺激的條件下和受流行性感冒刺激的條件下，在存在或不存在三種不同劑量的tiz(0.5mg/ml；1.0mg/ml和10mg/ml)下，在補充有10％的人血清的rpmi-1640培養基中培養pmbc。

實施例2：免疫分析

在不存在或存在不同劑量的替唑尼特下，針對輔助性t細胞和ctl的活性以及tlr7表達和tlr8表達和i型ifn應答，分析未受刺激的pmbc和受刺激的pmbc。免疫分析如下：

通過確定分泌ifnγ和il-2的cd4+t細胞的量來檢測輔助性t細胞的功能。通過確定表達穿孔素、顆粒酶和fas的cd8+t細胞的量來檢測ctl的活性。

通過測量表達tlr8、tlr7和tlr3的cd14+單核細胞來檢測tlr的表達。通過人類i型干擾素(ifn)的pcr陣列分析來檢測tlr路徑的替唑尼特的調節。

特別地，在未受刺激的pmbc中和受流行性感冒刺激的pmbc中通過如下分析來確定tiz的免疫調節效應：

人類i型干擾素(ifn)和tlr路徑(pcr陣列)：

干擾素：用于干擾素α受體和干擾素β受體的配體：ifna1、ifna4、ifnb1、ifnk、ifnwl。用于干擾素γ受體的配體：ifng。用于紅細胞生成素受體和干擾素類(d200域)細胞因子受體的配體：ifna14、ifna2、ifna21、ifna5、ifna6、ifna8、ifne1、il15。與干擾素有關的其它基因：ifrd1、ifrd2、il28a、il29、il6。

干擾素受體：干擾素α受體和干擾素β受體：ifnar1、ifnar2。干擾素γ受體：ifngr1、ifngr2。其它的紅細胞生成素受體和干擾素類(d200域)細胞因子受體：cntfr、crlf2、csf2ra、csf3r、ebi3、f3、il20rb(fndc6)、il10ra、il10rb、il11ra、il12b、il13ra1、il20ra、il21r、il22ra2、il28ra、il2rb、il2rg、il31ra、il3ra、il4r、il5ra、il6r、il7r、il9r、lepr、mpl、ttn。

干擾素調節因子：轉錄調節因子：irf1、irf2、irf3、irf4、irf5、irf6、irf7、irf8。其它的干擾素調節蛋白：irf2bp1、irf2bp2。干擾素誘導蛋白：參與對病毒應答的基因：isg15(g1p2)、ifi16、ifi35、ifi44、ifih1、mx1、oas1。轉錄調節因子：ifi16、sp110。其它的干擾素誘導基因：adar、cxcl10、ifi6(g1p3)、ifi27、ifi30、ifi44l、ifit1、ifit1l、ifit2、ifit3、ifitm1、ifitm2、irgm、psme1、pyhin1。

toll樣受體：ly64、sigirr、tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10。

銜接子&tlr互作蛋白：btk、cd14、hmgb1、hras、hspa1a、hspd1、ly86(md-1)、ly96(md-2)、mapk8ip3、myd88、peli1、ripk2、sarm1、ticam2、tirap、tollip、trif。

效應子：casp8、eif2ak2、fadd、irak1、irak2、map3k7(tak1)、map3k7ip1(tab1)、nr2c2、ppara、prkra、sitpec、traf6、ube2n、ube2v1。

下游路徑和靶基因：nfκb(核因子κb)路徑：ccl2、chuk、csf2(gmcsf)、csf3(gcsf)、ifna1、ifnb1、ifng、1kbkb、il1a、il1b、il2、il6、il8、il10、il12a、lta、map3k1、map4k4、nfkb1、nfkb2、nfkbia、nfkbil1、nfrkb、rel、rela、tnf、tnfrsf1a。

jnk/p38路徑：elk1、fos(c-fos)、ju、map2k3、map2k4(jnkk1)、map3k1(mekk)、mapk8(jnk1)。

nf/il6(核因子/白細胞介素6)路徑：clecsf9、ptgs2。

irf(干擾素調節因子)路徑：cxcl10、ifna1、ifnb1、ifng、irfl、irf3、tbk1。

適應性免疫的調節：cd80、cd86、ripk2、traf6。

實施例3：替唑尼特的免疫調節效應

tiz顯示出了誘導如下方面增加的強有力的免疫調節效應：1)分泌ifnγ和il2的cd4+t細胞(圖4a和圖4b)；2)ctl脫粒(圖5b)；3)表達fas的cd8+t細胞(圖5c)；4)單核細胞上的tlr3、tlr8和tlr7的表達(圖1a-圖1c)；5)ifnα-mrna表達和ifnβ-mrna表達(圖3a)；6)對于i型ifn誘導型基因(mxa、prkcz、adar、cxcl10、irf1、prkra)特異性的mrna(圖3b)；和7)對于mhci類呈遞中涉及的基因(hla-a、hla-b、tap1)特異性的mrna(圖3c)。

這些結果清晰地證明：tiz具有顯著的免疫調節活性且刺激強烈的免疫應答，該免疫應答通過先天的和后天的免疫系統而介導。

實施例4：單核細胞上tlr的表達

在未受刺激和受流行性感冒刺激的條件下，在cd14+細胞(單核細胞)上評估tlr3、tlr7和tlr8的表達。與流行性感冒抗原刺激下的對照相比，rm-4848誘導了表達tlr7的cd14+細胞的百分比的增加(1.0μg/ml劑量：p＝0.001；10μg/ml劑量：p＝0.023)，然而，在未受刺激的條件下沒有觀測到明顯的差異。對于在未受刺激和受流行性感冒刺激的條件下測試的所有五種劑量，不存在對表達tlr3和tlr8的cd14+細胞的影響(圖1a、1b和1c)。

實施例5：tlr路徑和rm-4848

為了確定由rm-4848對tlr表達施加的影響是否依賴于與tlr相關的轉導路徑的差異化調節，我們采用了實時pcr陣列，該實時pcr陣列篩選在tlr路徑激活中涉及的84個基因的表達。在通過rm-4848培育3小時后，在未受刺激的pbmc中獲得的數據顯示：如圖2a所示，84個基因中只有3個被上調，在20μg/ml的劑量下，il1a和il1b大約增加5倍，il6大約增加6倍。

在通過rm-4848培育3小時后，在受流行性感冒刺激的pbmc中獲得的數據顯示：如圖2b所示，84個基因中只有7個被上調。在1μg/ml的劑量下，infa1和infb1大約增加6倍，tlr3和tlr5增加7倍，tlr9增加6倍，但在20μg/ml的劑量下，而對于所有測試的劑量，tlr-7和tlr8稍微超過2倍基線。

實施例6：ifn路徑和rm-4848

為了確定在通過rm-4848培育的pbmc中i型干擾素表達水平的增加是否可以影響干擾素誘導型基因的表達，我們采用了實時pcr陣列，該實時pcr陣列篩選在干擾素α和干擾素β應答中所涉及的84個基因的表達。

在通過rm-4848培育的未受刺激的pbmc中進行的分析結果顯示：所測試的84個基因中沒有一個被上調，相反，16個基因被下調。特別地，在20μg/ml的高劑量下，報告顯示出，對于infal降低20倍，對于infa2和infb1降低15倍，infa4降低10倍。在1μg/ml和10μg/ml的兩個較低劑量下，未見到這種下調效應(圖3a)。

在通過rm-4848培育的受流行性感冒刺激的pbmc中進行的分析結果顯示：所測試的84個基因中的12個基因被上調。在通過rm-4848培育3小時后，在受流行性感冒刺激的pbmc中獲得的數據顯示：在1μg/ml的低劑量下，對于infal和infa4增加10倍，對于infb1增加8倍，對于ifna2增加6倍。三種劑量水平中等地上調了isg、ifi27和ifit1，在10μg/ml的劑量下，具有更顯著的效果(大于4倍)(圖3b)。

實施例7：輔助性t細胞的功能和rm-4848

在基礎條件下和在利用流行性感冒特異性抗原刺激之后評估了通過cd4+t細胞的ifn-γ生成和il2生成。0.5μg/ml的低劑量的rm-4848誘導了在未受刺激的細胞中(p＝0.035)和在受刺激的條件下(p＝0.050)ifn-γ生成的在統計上顯著的上調(圖4a)。在未受刺激(0.5μg/ml劑量：p＝0.047)和受流行性感冒刺激(0.5μg/ml劑量：p＝0.037)的條件下，在分泌il2的cd4+t細胞中觀測到相似的趨勢(圖4b)。

實施例8：ctl活性和rm-4848

在未受刺激的條件下和基于流行性感冒抗原刺激，分析了表達顆粒酶、穿孔素和fas的cd8+t細胞。在所測試的三種較高劑量水平下，rm-4848誘導了ctl脫粒，這通過穿孔素表達的減少來評估(圖5b)。在未受刺激(p＝0.006)和受刺激(p＝0.003)的條件下，存在20μg/ml和40μg/ml的較高的rm-4848劑量時，表達fas的cd8+t細胞的百分比也統計上顯著地增加(圖5c)。

從實施例4至實施例8顯而易見的是：tlr上調和激活，尤其直接的是，tlr7導致選擇性地增加i型干擾素(ifn-α、ifn-β)的生成，隨后激活被干擾素刺激的基因(isg)的路徑。更特別地，i型ifn誘導型基因(cd70、col16a1、hspa1l、ifi27、ifit1、nrg1和shb)被上調。這些基因都參與控制病毒復制。rm4848同時激活cd4+t淋巴細胞和cd8+t淋巴細胞。特別地，在cd4+t淋巴細胞中，ifn-γ生成和il-2生成上調，然而，與細胞介導免疫的激活一致，cd8+t細胞被誘導脫粒。

這些結果支持了rm4848的廣譜抗病毒活性，rm4848刺激免疫系統以對抗病毒感染。特別顯著的是，藥物不僅刺激先天免疫應答，很可能負責在感染導致可察覺的疾病之前清除大多數感染，即使許多病原體已逐步形成了阻礙其檢測的機制。從臨床角度看，表明rm4848和可能的具有相似的刺激免疫的屬性的其它噻唑化物類可用來預防疾病或限制疾病的傳播。rm4848針對適應性免疫的活性是顯著的，不僅是因為rm4848針對先天免疫的效果，更是因為rm4848為治愈病毒性疾病所利用的機制。適應性免疫基于淋巴細胞，該淋巴細胞具有單一類型的受體，但具有基本上不受限制的一組識別抗原的變體，變體即為反映淋巴細胞多功能性的操作上定義的術語。除了生成幾種淋巴細胞、輔助性細胞或殺傷性細胞之外，它們將以通過b細胞生成抗體而結束。如果在特異性感染開始時，適應性免疫被延遲幾天，則適應性免疫在生成對病原體有毒的粒子方面的作用和免疫記憶的形成是通過先天免疫觀察到的最有力的抗病毒性機制，同時是必要的和互相關聯的。

盡管前述內容涉及特定優選實施方式，但要清楚，本發明不如此受限。本領域的普通技術人員會想到，對于公開的實施方式可以進行各種改動，并且這樣的改動意在包括于本發明的范圍內。