本發(fā)明涉及生物藥物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種人源性核糖體蛋白（Ribosomal protein L22，RPL22）全序列蛋白用作為抗癌抗腫瘤藥物的新用途。

背景技術(shù)：

統(tǒng)計顯示，肺癌已成為人類因癌癥死亡的最主要原因；而在我國，肺癌發(fā)病率和死亡率亦居于各類癌癥之首。由于其復(fù)雜病因和發(fā)病的分子生物學(xué)機制尚未完全闡明，臨床治療效果不佳；尋找有效的治療方法是當(dāng)前非小細胞肺癌治療亟需解決的問題。核糖體蛋白（ribosomal protein, RP）是細胞生長過程中的非常重要調(diào)控基因，其可能直接影響了細胞增殖分化過程，且不同來源細胞中作用機制不盡相同。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，細胞在刺激增殖后部分核糖體蛋白基因表達明顯變化；其中，發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)RPL22在肺癌發(fā)展過程中起重要的調(diào)控作用：非小細胞肺癌中RPL22表達下調(diào)；同時發(fā)現(xiàn)肺癌中，RPL22通過與酪蛋白激酶相互作用、并抑制其活性調(diào)控肺癌發(fā)生發(fā)展（參考文獻：MINGXIA YANG*, Haibo, Sun；Ji, He；Hong, Wang；Xiaowei, Yu；Lei, Ma；Changliang, Zhu. Interaction of ribosomal protein L22 with casein kinase 2α:A novel mechanism for understanding the biology of non-small cell lung cancer. ONCOLOGY REPORTS 32: 139-144, 2014.（IF 2.19）；Mingxia Yang* , Haibo Sun, Hong Wang, Shijiang Zhang, Xiaowei Yu, Lei Zhang. Down-regulation of ribosomal protein L22 in non-small cell lung cancer. Med Oncol,2013;30(3):646.（IF 2.14））。

現(xiàn)有對比文件1專利號為200680017309.5，名稱為改進的表達元件，公開了一種分離的多核苷酸，其包含來自核糖體蛋白基因啟動區(qū)的至少500 個連續(xù)的核苷酸的元件，所述核糖體蛋白基因選自諸多基因，其中優(yōu)選有RPL22（說明書【0044】段）。全文只公開了RPL22可分離出來，但未提及其作為抗癌或抗腫瘤藥物的用途。

對比文件2專利號為201280038761.5，名稱為用于癌癥的循環(huán)生物標(biāo)志物，權(quán)利要求書公開了一種方法測定來自受試者的生物樣品中一種或多種生物標(biāo)志物的存在或水平，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物可選自RPL22, 鑒定包含所述一種或多種生物標(biāo)志物的存在或水平的生物印記,將生物印記與參照生物印記相比較，其中該比較用于表征癌癥，具體表征包括鑒定癌癥的存在或風(fēng)險，或鑒定癌癥是轉(zhuǎn)移性的或是侵襲性的（權(quán)利要求權(quán)利要求1、3、4）。雖然文中提到了RPL22可用于表征癌癥，但我們知道表征癌癥和治療癌癥是兩回事，現(xiàn)有的技術(shù)沒有采用過RPL22作為抗癌或抗腫瘤藥物的用途。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有的抗癌技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種原核表達獲得的人源性核糖體蛋白L22用作為抗癌抗腫瘤藥物的新用途。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：重組人源性核糖體蛋白RPL22的全序列蛋白用作為治療非小細胞肺癌的藥物或用作為抗腫瘤的藥物。

所述重組人源性核糖體蛋白RPL22序列如序列表所示序列1：MAPVKKLVVKGGKKKKQVLKFTLDCTHPVEDGIMDAANFEQFLQERIKVNGKAGNLGGGVVTIERSKSKITVTSEVPFSKRYLKYLTKKYLKKNNLRDWLRVVANSKESYELRYFQINQDEEEEEDED。

根據(jù)本發(fā)明的另一個實施例，進一步包括，所述重組人源性核糖體蛋白RPL22與順鉑具有協(xié)同增效作用。

根據(jù)本發(fā)明的另一個實施例，進一步包括，還包括重組人源性核糖體蛋白RPL22進行磷酸化修飾、糖基化修飾、甲酰化修飾后改進的蛋白用作為治療非小細胞肺癌的藥物或抗腫瘤的藥物。

根據(jù)本發(fā)明的另一個實施例，進一步包括，所述重組人源性核糖體蛋白RPL22按照藥物制備的常用方法制成口服劑、針劑、片劑或緩釋劑。

根據(jù)本發(fā)明的另一個實施例，進一步包括，所述重組人源性核糖體蛋白RPL22通過市場購買或自行制備獲得。

根據(jù)本發(fā)明的另一個實施例，進一步包括，所述自行制備獲得的方法如下：根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫公布的人正常核糖體蛋白RPL22基因序列NM_000983，通過基因克隆的方法從人正常支氣管上皮細胞克隆RPL22開放閱讀框序列，通過基因重組的方法構(gòu)建表達型載體，通過工程菌擴增表達后，純化獲得RPL22蛋白并去除內(nèi)毒素，通過真空低溫冷凍干燥方法獲得重組人源性核糖體蛋白RPL22。

本發(fā)明的有益效果是：

（1）本發(fā)明旨在公開----重組人源性核糖體蛋白RPL22全序列蛋白用作為抗癌藥物的新用途，特別是用作為治療非小細胞肺癌的藥物、以及潛在的治療其它腫瘤的藥物。

（2）本發(fā)明采用人體內(nèi)源性蛋白，為人體內(nèi)已經(jīng)存在的一種蛋白，非外源性蛋白，因此，該蛋白用于抗癌藥物開發(fā)并用于臨床，具有良好的組織相容性，無毒性。

（3）本發(fā)明提供的藥物，單藥在細胞水平和實體瘤水平治療非小細胞肺癌方面具有顯著的抗癌作用。

（4）本發(fā)明單藥在保證較強的抗癌活性的前提下，與其它抗癌藥物聯(lián)合使用，有減少其它抗癌藥物使用劑量、降低其它抗癌藥物毒副作用。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。

圖1是本發(fā)明RPL22蛋白抑制肺癌細胞增殖曲線圖。圖中，橫坐標(biāo)為藥物稀釋比例，縱坐標(biāo)為細胞增殖抑制率。

圖2是本發(fā)明RPL22蛋白處理裸鼠種植瘤的結(jié)果。圖中，A:對照組（小鼠血清），B:1/200，C:1/100，D:1/50，E:1/10。

圖3是順鉑DDP抑制肺癌細胞的IC50測定結(jié)果。圖中，各點代表為DDP濃度點為0μM, 0.01μM，0.1μM,10μM,100μM。

圖4 是本發(fā)明RPL22蛋白協(xié)同順鉑（DDP）抑制肺癌細胞增殖的結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，所有實施例僅用于例證本發(fā)明，決不限制本發(fā)明的保護范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

一、本發(fā)明重組人源性核糖體蛋白RPL22的來源

本發(fā)明中采用的重組人源性核糖體蛋白RPL22通過市場購買或自行制備獲得。市場購買本發(fā)明可從PROSPEC公司（Prospec-Tany TechnoGene Ltd, Israel）購買獲得。

自行制備獲得的方法如下：根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫公布的人正常核糖體蛋白RPL22基因序列NM_000983，通過基因克隆的方法從人正常支氣管上皮細胞克隆RPL22開放閱讀框序列，通過基因重組的方法構(gòu)建表達型載體，通過工程菌擴增表達后，純化獲得RPL22蛋白并去除內(nèi)毒素，通過真空低溫冷凍干燥方法獲得重組人源性核糖體蛋白RPL22。該方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員的常用方法，在此不再贅述。

二、本發(fā)明重組人源性核糖體蛋白RPL22儲存

在獲得重組人源性核糖體蛋白RPL22后，可照藥物制備的常用方法制成口服劑、針劑、片劑或緩釋劑，但不限于此。

三、本發(fā)明重組人源性核糖體蛋白RPL22的相關(guān)實驗

實施例1 人源性核糖體蛋白RPL22在肺癌細胞增殖中的實驗

實驗過程如下：

1. 將肺癌細胞種植在96孔板，每組做三個復(fù)孔，每孔培養(yǎng)基為100μL，肺癌細胞數(shù)為5000個，將肺癌細胞放于37℃培養(yǎng)箱，5% CO₂，飽和濕度條件下培養(yǎng)。

2. 藥物母液起始濃度為0.25μg/μl，按照適當(dāng)稀釋的方法進行藥物稀釋藥物，使得培養(yǎng)孔中體積100μl時的藥物濃度為母液的1/50、1/100、1/200、1/400、1/600、1/800、1/1000，對照組為培養(yǎng)基；后處理48小時后，吸去多余培養(yǎng)基，然后加入80μl新鮮培養(yǎng)基，加入20μl CCK8，37℃，5% CO₂，飽和濕度條件下培養(yǎng)2h，在酶聯(lián)免疫檢測儀A450nm和A630nm雙波長測得各孔的OD值。

3. 通過各孔OD值計算細胞增殖抑制率。

結(jié)果如圖1顯示，細胞增殖率抑制曲線，橫坐標(biāo)為藥物稀釋比例，縱坐標(biāo)為細胞增殖抑制率。本藥物呈濃度依賴性的抑制細胞增殖，藥物濃度高，其對腫瘤細胞抑制效果越明顯。RPL22蛋白能呈濃度依賴性的抑制癌細胞的增殖，隨著藥物濃度升高其抑制率增高，可充分說明RPL22蛋白用于抗癌藥物的開發(fā)運用，特別是非小細胞肺癌。

實施例2 人源性核糖體蛋白RPL22在荷瘤小鼠抗腫瘤治療的實驗。

以細胞培養(yǎng)液作為稀釋劑，將人肺癌細胞株A549和Ltep-a-2種植裸鼠皮下構(gòu)建肺癌種植瘤模型，將RPL22蛋白通過倍比稀釋的方法進行藥物稀釋后。通過局部注射的方式處理裸鼠種植瘤。實驗用人源性核糖體蛋白RPL22采購自PROSPEC公司，裸鼠購自常州卡文斯實驗動物公司，采用6-8周齡雄性小鼠。

實驗過程如下：

1、分別擴培人肺癌細胞株A549和Ltep-a-2，取對數(shù)生長期的腫瘤細胞用于荷瘤實驗。

2、收取1×10⁶對數(shù)生長期細胞，用1×PBS清洗腫瘤細胞1次。

3、每皿腫瘤細胞加入1ml胰酶，37℃消化1-2min，鏡下觀察腫瘤細胞皺縮變圓，立即加入3ml完全培養(yǎng)基終止消化。

4、用移液槍輕輕吹打細胞培養(yǎng)皿，收集腫瘤細胞懸液。

5、采用離心機1500rpm離心5min，收集腫瘤細胞沉淀，PBS重選洗滌腫瘤細胞1次。

6、對腫瘤細胞計數(shù)，調(diào)整裸鼠細胞接種密度為5×10⁶/100μl。

7、在裸鼠雙側(cè)腋下，用酒精棉球擦拭消毒，1ml注射器單側(cè)推入腫瘤細胞5×10⁶/100μl，7-10d后，裸鼠雙側(cè)腋下出現(xiàn)體積約1mm³的瘤體。

8、按照一定稀釋比例稀釋藥物即人源性核糖體蛋白RPL22，分為五組實驗，A:對照組（小鼠血清），B:1/200，C:1/100，D:1/50，E:1/10；藥物用小鼠血清進行稀釋(藥物母液起始濃度為0.25μg/μl，按照適當(dāng)稀釋的方法進行藥物稀釋藥物至母液濃度的1/200、1/100、1/50、1/10，每次給藥終體積為100μl)。

9、在腫瘤瘤體周邊多點給藥，每三天測量腫瘤大小一次。

10、藥物每周注射1次，連續(xù)干擾3周后，用乙醚麻醉裸鼠，按照實驗要求進行瘤體大小測量拍照，進行腫瘤抑制分析。

如圖2，結(jié)果顯示，在瘤體部位注射人源性核糖體蛋白RPL22后，荷瘤小鼠種植瘤生長明顯受到抑制，隨著藥物濃度升高腫瘤抑制效果更明顯。動物荷瘤實驗充分說明RPL22蛋白可用于抗腫瘤藥物，或相關(guān)抗腫瘤藥物組合物的開發(fā)。

實施例3 人源性核糖體蛋白RPL22協(xié)同順鉑DDP抑制肺癌細胞增殖的實驗

1. 將肺癌細胞種植在96孔板，每組做三個復(fù)孔，每孔培養(yǎng)基為100μL，肺癌細胞數(shù)為5000個，將肺癌細胞放于37℃培養(yǎng)箱，5% CO₂，飽和濕度條件下培養(yǎng)。

2. 根據(jù)藥物實驗，測得DDP對兩種肺癌細胞的IC50 為10μM（圖3），在此基礎(chǔ)上進行藥物協(xié)同作用實驗。RPL22蛋白藥物母液起始濃度為0.25μg/μl，培養(yǎng)孔中體積100μl時的RPL22藥物濃度為母液的1/100，即終濃度為0.025ng/μl；細胞分別設(shè)組為：DDP(10uM), RPL22, RPL22+DDP(1.25uM), RPL22+DDP(2.5uM), RPL22+DDP(5uM)；后處理48小時后，吸去多余培養(yǎng)基，然后加入80μl新鮮培養(yǎng)基，加入20μl CCK8，37℃，5% CO₂，飽和濕度條件下培養(yǎng)2h，在酶聯(lián)免疫檢測儀A450nm和A630nm雙波長測得各孔的OD值。從圖4可以看出，RPL22與抗癌藥物DDP有協(xié)同作用，可以降低DDP用量。

3. 通過各孔OD值計算細胞增殖抑制率。

細胞增殖率抑制曲線圖中，橫坐標(biāo)為藥物稀釋比例，縱坐標(biāo)為細胞增殖抑制率。結(jié)果如圖3-4顯示，DDP能抑制肺癌細胞的增殖，其IC50約為10μM，藥物濃度越高，抑癌效果越好；在DDP處理肺癌細胞時，同時摻入RPL22蛋白后，在達到相似抑制率時，DDP的用量明顯減少。實驗可充分說明RPL22蛋白用于抗癌藥物的開發(fā)運用，可輔助其它抗癌治療方法協(xié)同作用，以達到增效減毒的目的。

當(dāng)RPL22蛋白與一種或多種其它的抗癌或抗腫瘤物質(zhì)合用時，所述的抗癌或抗腫瘤物質(zhì)可以有順鉑等，但同時不僅僅限于順鉑，依然包括其它的抗癌化療藥物，例如其它抗腫瘤物質(zhì)絲分裂抑制劑、長春堿、烷化劑、抗代謝物，生長因子抑制劑、嵌入抗生素、酶、抗激素等。

四、本發(fā)明的給藥

重組人源性核糖體蛋白RPL22用作為抗癌或抗腫瘤藥物的給藥可以通過口服途徑、注射途徑等，給藥量取決于所治療的對象、疾病或病癥的嚴重性、給藥速率和臨床醫(yī)生的判斷。

本藥物在動物實體瘤實驗單獨給藥時，每周給藥一次，當(dāng)藥物總劑量低于0.375μg后，藥物的抗腫瘤效果就不顯效了；而藥物總劑量達到或高于7.5μg時抗腫瘤效果最明顯。在某些情況下，低于上述范圍下限的劑量水平可能更合適。而在另一些情況下，則可以采用更大的劑量而不會引起任何有害的副作用。

藥物協(xié)同給藥的方式包括同時給藥，總之根據(jù)情況疾病的情況確定。

五、本發(fā)明重組人源性核糖體蛋白RPL22用作為抗癌或抗腫瘤藥物，其中藥物還應(yīng)當(dāng)指包括含有人源性核糖體蛋白L22的藥物組合物以及可藥用載體。后續(xù)針對本蛋白所的有關(guān)修飾如蛋白的磷酸化修飾、糖基化修飾、甲酰化修飾等所做的藥物改進，以及各種復(fù)方劑型組合亦包括在本發(fā)明之中。

基于上述構(gòu)思，基本內(nèi)容原理與本發(fā)明相似，在精神和范圍下對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換的，均應(yīng)落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

序列表

<110>：楊明夏

<120>：人源性核糖體蛋白L22用作為抗癌抗腫瘤藥物的新用途

<160>：1

<210>：1

<211>：128

<212>：氨基酸序列

<213>：人源性核糖體蛋白L22蛋白，Human ribosomal Protein L22，RPL22

<400>:

MAPVKKLVVKGGKKKKQVLKFTLDCTHPVEDGIMDAANFEQFLQERIKVNGKAGNLGGGVVTIERSKSKITVTSEVPFSKRYLKYLTKKYLKKNNLRDWLRVVANSKESYELRYFQINQDEEEEEDED