本發明涉及生物醫藥技術領域，具體涉及前列腺癌調控分子及其應用。

背景技術：

前列腺癌(prostatecancer，PCa)是男性最為常見的惡性腫瘤，在歐美國家，位居男性腫瘤發病率第一位和死亡率第二位。近年來，隨著人口老齡化和診斷技術的提高，我國前列腺癌的發病率亦呈逐年上升趨勢。最新統計數據顯示中國人群發病率為4.3/10萬，且大約5％患者首次診斷時已經出現了遠處轉移。PCa發病機制至今仍不完全清楚，研究表明86-98％的PCa屬于激素依賴性腫瘤。

雄激素剝奪治療(androgen deprivation therapy，ADT)是治療首發PCa的主要方法，但大多數PCa病人尤其是發生轉移的Gleason分值高的PCa，都會進展成轉移性去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)。轉移性CRPC是PCa進展的最終階段，在現有的醫療條件下，生存時間一般小于2年，是導致PCa病人死亡的首要原因。因此闡明CRPC進展的分子機制，發現有效的信號分子治療靶點，已成為當前的研究熱點。

CRPC進展的分子機制十分復雜，已有的研究揭示AR信號通路的紊亂是導致CRPC發病的主要原因。瘤內的雄激素合成、AR受體的表達上調、突變和剪切變異體，都會導致AR信號通路的敏感性增加和異常激活，導致CRPC的發生。目前基于AR信號調控通路的藥物阿比特龍(Abiraterone)和恩扎魯胺(Enzalutamide)已用于臨床CRPC的治療，二者雖能緩解CRPC的病情進展，延長病人生存時間，但并不能最終阻止CRPC的進展。說明CRPC的進展受到更多更復雜的分子調控，只有找到關鍵的調控分子作為治療靶點，才能從根本上治療CRPC。

MIIP(migration and invasion inhibitory protein)是2003年科研人員在膠質瘤研究中利用酵母雙雜交發現的與IGFBP2(insulin-like growth factor binding protein 2)相互作用的一個蛋白，由于其分子量約為45kDa，又稱為IIp45(invasion inhibitory protein45)。MIIP基因位于染色體1p36.2區域，全長12595bp，共含10個外顯子，其編碼產生的mRNA為2024bp，蛋白含388個氨基酸殘基，在人體內各組織廣泛表達。對全長MIIP蛋白結構分析發現其含有3個SEG(segments of low compositional complexity)域和一個RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽)模體；另有42個絲氨酸、6個蘇氨酸及1個潛在的蘇氨酸磷酸化位點。

關于MIIP的功能研究充分顯示，MIIP基因是一個新的抑癌基因，依據如下：①MIIP基因所在的染色體區域1p36.2在多種類型腫瘤中缺失，包括膠質瘤、乳腺癌等。②在膠質瘤和肺癌組織中，MIIP表達明顯低于正常組織，且其表達水平與肺癌的病理分期和預后負相關。目前認為MIIP的作用機制包括：A.MIIP結合并拮抗IGFBP-2的作用，抑制細胞遷移侵襲；B.結合并促進HDAC6降解，使后者去乙酰化酶活性受抑，從而影響微管形成、抑制細胞遷移；C.通過與Cdc20直接結合而阻斷Cyclin B1的降解，使細胞停滯在有絲分裂的中期，從而抑制細胞周期進程和細胞增殖。

但目前關于MIIP在前列腺癌中的表達狀態及其作用尚未見報道。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供MIIP作為前列腺癌的調控分子和藥物靶點的應用。

為達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：

遷徙和浸潤抑制蛋白MIIP在制備前列腺癌抗腫瘤藥物中的應用。

所述抗腫瘤藥物選自包含MIIP過表達載體的基因治療藥物。

遷徙和浸潤抑制蛋白MIIP的激動劑在制備前列腺癌抗腫瘤藥物中的應用。

遷徙和浸潤抑制蛋白MIIP作為前列腺癌分子診斷標志物的應用。

遷徙和浸潤抑制蛋白MIIP作為前列腺癌進展調控分子的激動劑或抑制劑的應用。

以遷徙和浸潤抑制蛋白MIIP作為靶分子篩選前列腺癌治療藥物的應用。

以遷徙和浸潤抑制蛋白MIIP作為檢測指標評價前列腺癌治療藥物的應用。

以遷徙和浸潤抑制蛋白MIIP作為靶分子篩選前列腺癌分子診斷標志物的應用。

本發明的有益效果體現在：

本發明通過實驗首次發現MIIP在前列腺癌中表達降低，并且與CRPC進展相關，揭示了MIIP可以作為一種新的前列腺癌調控因子，不僅為前列腺癌的發病機制提供新的理論依據。更為重要的是，可以為前列腺癌藥物研制提供新的途徑，用MIIP作為靶分子篩選新的前列腺癌的治療藥物，同時也可以用MIIP作為檢測指標評價前列腺癌的治療藥物。

附圖說明

圖1為部分前列腺癌患者(Patients)癌組織與癌旁組織中MIIP表達水平比較；其中：ANT(adjacent non-cancerous tissues)：癌旁組織，CT(cancerous tissues)：前列腺癌組織。

圖2為MIIP對CRPC細胞惡性表型的影響；其中：A.免疫印跡檢測的MIIP過表達質?；蛐「蓴_核糖核酸(siRNA)轉染后MIIP表達水平；B.MIIP表達調控對細胞生長的影響；C.MIIP表達調控對細胞克隆形成的影響；D.MIIP表達調控對細胞侵襲能力的影響。

圖3為MIIP穩定敲減對小鼠成瘤惡性表型的影響；其中：A.瘤體體積比較結果；B.腫瘤生長速度比較；C.前列腺癌荷瘤鼠模型腫瘤組織中細胞增殖比較。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明做進一步詳細說明。

本發明公開了遷徙和浸潤抑制蛋白MIIP在前列腺癌中的調控機制和作為藥物靶點的應用。

本發明通過以下實驗：(1)在前列腺癌人群樣本中檢測MIIP；(2)MIIP過表達和MIIP shRNA敲減載體的構建，MIIP cDNA和MIIP shRNA的慢病毒包裝，MIIP穩定過表達和MIIP shRNA穩定敲減前列腺癌細胞株的建立，前列腺癌細胞生物學行為檢測；(3)MIIP shRNA穩定敲減前列腺癌荷瘤鼠模型構建，荷瘤鼠腫瘤生長以及瘤組織細胞增殖的檢測。結果發現，在部分前列腺癌患者中，MIIP在癌組織中的表達較癌旁組織明顯降低；細胞水平研究證實在CRPC細胞系PC-3、DU-145、C4-2中分別過表達MIIP，可顯著的抑制細胞生長、克隆形成和侵襲能力；同時在PC-3和DU-145中采用siRNA敲減MIIP，則顯著增強細胞生長、克隆形成和侵襲能力。這些結果表明MIIP可明顯抑制CRPC的惡性表型。動物水平研究發現，注射MIIP穩定敲減的CRPC細胞系(PC-3-shMIIP和DU-145-shMIIP)行裸鼠成瘤實驗，與正常組相比，實驗組呈現腫瘤生長速度增加、侵襲性增強等惡性表型。因此，本發明指出，MIIP在前列腺發生進展過程中，尤其在CRPC惡性演化過程中發揮極其重要的作用，為前列腺癌提供了新的發病機制理論依據和治療靶點。

本發明中除非另外說明，將使用本領域技術人員已知的化學、生物化學和重組DNA技術。這些技術在文獻中有完整的解釋。參見，A.L.Lehninger，《生物化學》(Biochemistry)(Worth Publishers,Inc.最新版)；Sambrook等，《分子克隆：實驗室手冊》(Molecular Cloning:a Laboratory Manual),第二版，1989。

(1)免疫印跡(Western Blot,WB)檢測前列腺癌病人癌組織中MIIP蛋白的表達水平。

病人組織標本來自西京醫院泌尿外科，采用強RIPA裂解液(碧云天)裂解細胞，裂解前加入蛋白酶抑制劑PMSF和Cocktail(Sigma)。所有操作冰上進行，超聲破碎8秒，提取的蛋白于-80℃保存，蛋白分裝防止反復凍融。跑膠前加入上樣緩沖液，混勻，直接上樣。10％SDS PAGE膠分離MIIP蛋白，分子量大小約42.8kD。以GAPDH(Sigma)作為內參。具體實驗結果見圖1，可見MIIP在前列腺癌組織中的表達較癌旁組織明顯降低。

(2)構建MIIP shRNA穩定敲減和MIIP過表達前列腺癌細胞株，檢測MIIP對前列腺癌細胞惡性表型的影響

1)MIIP shRNA和MIIP過表達載體構建和慢病毒包裝

首先從上海吉凱化學技術有限公司訂購MIIP siRNA，參照前期實驗中應用并證實有效的siRNA序列，選擇其中2對針對MIIP的RNAi靶序列(siRNA1、siRNA2)，合成正向與反向寡核苷酸；退火以后形成寡核苷酸雙鏈，經過酶切、連接克隆入pLKO.1-TRC載體(購自Addgene公司,貨號:10878)，構建為pLKO.1-MIIP shRNA(酶切位點：AgeⅠ，EcoRⅠ)，該重組質粒與包裝質粒psPAX2和pMD2.G(Addgene)共轉染入細胞293T(購自：中科院細胞庫，目錄號：GNHu17)進行病毒包裝，產生pLKO.1-sh MIIP病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中。收集含有pLKO.1-sh MIIP病毒顆粒的上清液，-80℃保存，可直接用于細胞感染。

MIIP過表達系統采用Thermo Scientific公司的pLEX-MCS慢病毒包裝系統。采用PCR技術和分子克隆技術購建pLEX-MCS-MIIP過表達載體(酶切位點：SpeⅠ,XhoⅠ)。擴增重組質粒，分別與另2種輔助/包裝質粒混合物(TLP4616/TLP4617，Thermo Scientific)共轉染293T細胞，進行病毒包裝，產生pLEX-MCS-MIIP病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中。收集含有pLEX-MCS-MIIP病毒顆粒的上清液，-80℃保存，可直接用于細胞感染。

2)MIIP shRNA和MIIP過表達穩定細胞株的建立

①細胞培養

本實驗選用細胞包括激素非依賴性/CRPC細胞系(C4-2、DU-145、PC3)以及人胚腎細胞(293T細胞)，常規培養。其中C4-2是LNCaP(來源于PCa患者淋巴結轉移灶)移植于瘤鼠并經去勢篩選而獲得，為AR陽性；DU-145和PC3分別來源于CRPC患者的腦和骨轉移灶，均為AR陰性。細胞系DU-145、PC3和293T均購自中科院細胞庫(目錄號：TCHu222、SCSP-532和GNHu17)，C4-2源自第四軍醫大學西京醫院泌尿外科。(參考文獻：[1]Murphy G,editor.Models for prostate cancer.37.New York:Liss；1980,pp.115-132.[2]Gibas Z,et al.A high-resolution study of chromosome changes in a human prostatic carcinoma cell line(LNCaP).Cancer Genet.Cytogenet.11:399-404,1984.[3]Papsidero LD,et al.Prostate antigen:a marker for human prostate epithelial cells.J.Natl.Cancer Inst.66:37-42,1981.[4]Stone KR,et al.Isolation of a human prostate carcinoma cell line(DU 145).Int.J.Cancer 21:274-281,1978.[5]Kaighn ME,et al.Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line(PC-3).Invest.Urol.17:16-23,1979.[6]Chen TR.Chromosome identity of human prostate cancer cell lines,PC-3 and PPC-1.Cytogenet.Cell Genet.62:183-184,1993.[7]El Etreby MF,et,al,Antitumor activity of mifepristone in the human LNCaP,LNCaP-C4,and LNCaP-C4-2 prostate cancer models in nude mice.Prostate.2000 Feb 1；42(2):99-106.[8]Xie BX,et,al.The radiation response of androgen-refractory prostate cancer cell line C4-2 derived from androgen-sensitive cell line LNCaP.Asian J Androl.2010 May；12(3):405-14.doi:10.1038/aja.2009.91.)

②藥物濃度的篩選

轉染后細胞篩選用的藥物主要有博萊霉素和嘌呤霉素。建立穩定細胞系之前，需要確定能夠在7-10天殺死細胞的最佳藥物濃度。方法如下：在24孔板中接種細胞，細胞密度達到50％-70％融合時，將藥物按照遞增的濃度，加至培養孔內。觀察細胞死亡情況，隔一天換液，確定殺傷細胞的最佳濃度用于后續篩選穩定細胞株。

③病毒感染與穩定細胞株的建立

分別在CRPC細胞系C4-2、DU-145和PC3中過表達或敲減MIIP：細胞培養過夜，達到約70％匯合時用于病毒轉染。取已制備好的包含pLEX-MCS-MIIP或pLKO.1-shMIIP的病毒上清液，以1:1體積比加入正在培養的處于對數生長期的細胞，24小時后加入最優濃度藥物篩選，建立MIIP過表達的穩定細胞系(MIIP組)和MIIP敲減的穩定細胞系(MIIP siRNA1組、MIIP siRNA2組)；同時以pLEX-MCS(Vector)或pLKO.1-scramble shRNA(NC)感染和篩選的細胞作為相應的對照組，參見圖2A。

(3)前列腺癌細胞生物學行為檢測

1)MTT法檢測細胞生長

收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度加入96孔板(2×10³/孔)，5％CO₂、37℃孵育細胞24h，每孔加入20μL新配制的MTT(0.5mg/mL)，37℃繼續孵育4h，棄MTT液，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶標儀490nm處測量各孔的吸光值。每組設6個重復，連續測5-7天，繪制細胞生長曲線，參見圖2B，可以看出，過表達MIIP抑制細胞生長，而敲減MIIP促進細胞生長。

2)克隆形成實驗

取對數生長期的細胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，將細胞懸浮在培養液中備用。將細胞懸液作梯度倍數稀釋，取100-200細胞數均勻接種于60mm培養皿。置37℃、5％CO₂靜置培養2-3周，出現肉眼可見的克隆時，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加甲醇固定15min，適量Giemsa應用染色液染10-30min，空氣干燥。將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，肉眼計數克隆數或計算克隆形成率，參見圖2C，可以看出，過表達MIIP抑制細胞克隆形成，而敲減MIIP促進細胞克隆形成。

3)Transwell檢測細胞遷移和侵襲能力

將Matrigel與無血清的DMEM培養液以1:6混合，鋪于Transwell小室中，37℃孵箱放置2h，使其凝固；各組細胞以胰酶消化，細胞計數，制備2×10⁴/mL單細胞懸液，每個Transwell小室接種100μL；24孔板中加入含有血清的DMEM新鮮培養液，將Transwell小室放入24孔板中，37℃孵箱繼續培養24h；擦除上層未穿膜的細胞及Matrigel，乙醇固定，Giemsa染色，倒置顯微鏡下隨機選取10個視野并計數，取均值，參見圖2D，可以看出，過表達MIIP抑制細胞侵襲。

根據以上實驗，可以得出，在CRPC細胞系中分別過表達MIIP，發現MIIP可顯著抑制癌細胞的生長、克隆形成和侵襲能力；而采用siRNA敲減MIIP，則促進細胞生長、克隆形成和侵襲能力。這些結果表明了MIIP對前列腺癌細胞增殖、遷徙和浸潤過程的調控作用，通過對MIIP的表達調控可明顯抑制CRPC的惡性表型。

(4)前列腺癌荷瘤鼠模型中驗證MIIP的在體功能

1)前列腺癌荷瘤鼠模型建立

選取5-7周齡，體重18-22g的雄性裸鼠為實驗對象(10只/組)，于皮下接種MIIP穩定敲減的CRPC細胞系(PC-3-shMIIP和DU-145-shMIIP)，建立前列腺癌荷瘤鼠模型。具體如下：將上述MIIP穩定敲減的CRPC細胞以1×10⁷接種于裸鼠后肢近端皮下。

2)荷瘤鼠腫瘤生長以及標本采集

a)腫瘤生長曲線

每日常規監測荷瘤鼠的飲食、行為表現和腫瘤形成情況。隔日用卡鉗測量腫瘤的大小以監測其體積V變化，V＝d×D²×0.5(d:腫瘤的長徑,D:腫瘤的短徑)。5周后處死小鼠，取瘤組織稱重，并根據測量結果繪制出腫瘤生長曲線，不同組別之間進行t檢驗統計分析。參見圖3A、B，可以看出，MIIP shRNA穩定敲減前列腺癌荷瘤鼠模型(shRNA1組由siRNA1敲減，shRNA2組由siRNA2敲減)中，瘤體重量較對照組Scramble增加，腫瘤生長速度加快。

b)Ki-67染色檢測細胞增殖

標本收集處死小鼠的同時，留取部分瘤組織制作石蠟切片。常規處理并固定，以10％BSA/PBS室溫封閉1h，加入抗Ki-67抗體，溫育1h，洗滌后滴加生物素標記二抗，室溫1h，滴加過氧化物酶偶聯的抗生物素蛋白，再加入0.1％DAB+0.05％H₂O₂，處理10-30min，蘇木精復染，顯色。顯微鏡下觀察，計數陽性細胞比例，參見圖3C，Ki-67染色揭示MIIP shRNA穩定敲減前列腺癌荷瘤鼠模型，與對照組Scramble相比細胞增殖加快。

以上實驗揭示了MIIP在前列腺癌細胞成瘤過程中的調控作用，在CRPC細胞系中穩定敲減后，小鼠成瘤惡性表型明顯增強。

總之，本發明發現MIIP在前列腺癌病人瘤組織樣本中表達顯著降低，細胞學實驗和荷瘤裸鼠實驗都證實MIIP具有抑制前列腺癌進展的功能。揭示MIIP可作為一個調控前列腺癌進展和(或)CRPC演化的關鍵調控分子。以MIIP作為靶向分子可用于篩選前列腺癌治療、預防藥物以及相關分子診斷標志物。