本發明提出了一種新型的具有腫瘤細胞靶向的給藥系統的制備方法即一種牛血清白蛋白包覆紫杉醇脂質納米粒制劑的制備方法，屬于醫藥技術領域。

背景技術：

白蛋白(Albumin，Alb)由肝實質細胞合成，在血漿中的半衰期約為15-19天，是血漿中含量最多的蛋白質，占血漿總蛋白的40％-60％。白蛋白的分子結構已于1975年闡明，為含585個氨基酸殘基的單鏈多肽，分子量為66458，分子中含17個二硫鍵，不含有糖的組分。在體液pH7.4的環境中，白蛋白為負離子，每分子可以帶有200個以上負電荷。它是血漿中很重要的載體，許多水溶性差的物質可以通過與白蛋白的結合而被運輸,這些物質包括膽紅素、長鏈脂肪酸(每分子可以結合4-6個分子)、膽汁酸鹽、前列腺素、類固醇激素、金屬離子(如Cu²⁺、Ni²⁺、Ca²⁺)、藥物(如阿司匹林、青霉素等)。具有活性的激素或藥物當與白蛋白結合時，可以不表現其活性，而視為其儲存形式，由于這種結合的可逆性和處于動態平衡，因此在調節這些激素和藥物的代謝上，具有重要意義。

目前作為載體材料使用的白蛋白包括人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)和牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)。牛血清白蛋白(BSA)，又稱第Ⅴ組分，是牛血清中的一種球蛋白，包含583個氨基酸殘基，分子量為66000，等電點為4.7。其中35個半胱氨酸組成17個二硫鍵，在肽鍵的34位是一個游離巰基。白蛋白在pH4-9范圍內保持穩定，在60℃加熱10h而沒有變化，具有良好的穩定性。在BSA的三個結構域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中，結構域Ⅱ和Ⅲ均有一個由疏水性及荷正電的基團所構成的袋裝結構，其中能夠容納多種結構的化合物。由于BSA與HSA不僅結構相似，而且兩者的氨基酸序列高度相似，且不同氨基酸均為保守性替換，而BSA更價廉易得，因此被廣泛應用于醫藥研究領域中。

近年來越來越多事實表明，僅僅發展新藥不足以保證藥物治療的進步，發展合適的藥物載體系統可以克服目前存在的一些問題，還可能實現藥物控釋和定點釋藥。因此，微球、微乳、納米粒、脂質體等亞微粒藥物載體輸送系統研究成為藥物新劑型研究中非常活躍的領域，同時研究工作者在選擇性吸收和靶向給藥等方面取得了顯著的成就。將藥物包封于這些亞微粒中可以改變藥物在體內的分布、調節釋藥速度、提高生物利用度、增加藥物對生物膜的透過性、增加藥物在靶器官的分布量，從而提高療效，減輕毒副作用。在以上給藥系統中，脂質體的研究較為廣泛，脂質體在體內具有良好的靶向性和生物相容性等優點，但一般脂質體也存在體內外不穩定、藥物易于滲漏等問題。含藥微乳由于其物理穩定性、油相對藥物的溶解度等問題限制了其進一步發展。聚合物納米粒在制備過程中可能帶來潛在毒性的物質，如殘留單體、有機溶劑、聚合物引發劑等，所用的生物降解性高分子材料在細胞吞噬降解后也常產生細胞毒性。因此人們將目光逐漸轉向由生物相容、體內降解的天然脂質材料作為載體的脂質納米粒。

1990初開發的脂質納米粒(LNP,lipid nanoparticles)是一種可替代乳劑、脂質體和聚合物納米粒的新型給藥系統。LNP系統既具備聚合物納米粒物理穩定性高、藥物泄漏慢的優勢，又兼具了脂質體、乳劑的毒性低、能大規模生產的優點，是一種極有發展前景的新型給藥系統。LNP是由具有生理相容性并可生物降解的，由擁有良好人體使用歷史的脂質制備而成，具有下述優點：(1)納米粒粒徑小，平均粒徑在納米級，微米級顆粒含量極少，可用于注射給藥(當顆粒徑>5μm時，不宜用于注射給藥)；(2)生理可接受，載體無生物毒性，制備過程中不使用有毒聚合物、單體等有毒殘留物；(3)對親脂性藥物有足夠的載藥能力，相對脂質體載藥量提高，通過工藝調整，也可以包封親水性藥物；(4)藥物釋放可以達到緩釋、控釋目的；(5)其水分散系統可以進行高壓滅菌或γ輻射滅菌，具有長期的物理化學穩定性，也可將之凍干或噴霧干燥制成固體粉末；(6)通過對其表面進行特征修飾可控制靶向特定組織(靶向給藥)；(7)有足以供應市場的大規模工業化生產方式；(8)價格相對較為低廉。因此，近期LNP吸引了人們越來越多的注意。

近年來越來越多事實表明，僅僅發展新藥不足以保證藥物治療的進步，需要發展合適的藥物靶向腫瘤載體系統可以克服目前存在的一些問題，實現藥物腫瘤靶向釋藥。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種牛血清白蛋白包覆紫杉醇脂質納米粒制劑的制備方法，為藥物靶向腫瘤載體系統提供了一種新的具有腫瘤細胞靶向的納米給藥系統，提高了抗腫瘤藥物對腫瘤部位的靶向及腫瘤殺傷能力。

本發明采用以下技術方案：

一種牛血清白蛋白包覆紫杉醇納米粒制劑的制備方法，它包括以下步驟：

(1)脂質核心(PTX-LNP)的制備：按比例精密稱取紫杉醇、磷脂、十八胺置于茄形瓶中，加入氯仿8～12ml超聲溶解，30-40℃減壓蒸發成膜，加入水合介質PBS8～12ml，30-40℃水合15～30min，冰浴探頭超聲后即得到脂質核心溶液；所述紫杉醇與磷脂重量比為1:15～1:5；所述十八胺與紫杉醇重量比為1:6～1:3；

(2)牛血清白蛋白包覆載紫杉醇脂質納米粒制劑(BSA-PTX-LNP)的制備：按照磷脂：BSA重量比為5:1～15:1的比例稱取BSA，用PBS溶液溶解后，緩慢加入步驟(1)制備得到的脂質核心溶液中，于30-40℃緩慢攪拌孵育6～10h，使BSA物理包覆于脂質核心表面，微柱離心法分離未包覆的游離蛋白，即得牛血清白蛋白包覆的紫杉醇脂質納米粒。

優選的，所述步驟(1)中紫杉醇與磷脂重量比為1:10。

優選的，所述步驟(1)中十八胺與紫杉醇重量比為1:5。

優選的，所述步驟(1)中超聲的功率為200W，超聲1s，間歇1s，總時間為3～6min。

優選的，所述超聲總時間為5min。

優選的，所述步驟(2)中PBS溶液的pH為7.4。

優選的，所述步驟(2)中磷脂：BSA的重量比為10:1。

優選的，所述步驟(2)中攪拌孵育時間為8h，溫度為37℃。

本發明的制備方法中對紫杉醇脂質核心的制備采用的是加入紫杉醇、磷脂和十八胺，其加入十八胺為了增加脂質核心的電荷帶正電荷，目的是與帶負電荷的牛血清白蛋白通過靜電作用相結合。這種結合方式是通過正負電荷靜電吸引結合在一起，這個方法與白蛋白包覆紫杉醇相比，能增加載藥量及良好的生物相容性。

本發明的有益效果是：紫杉醇脂質納米粒經BSA包覆后，腫瘤細胞對抗腫瘤藥物紫杉醇的攝取大大增加，并且對腫瘤細胞的殺傷力也大大增加，其意義在于：(1)增加藥物分子靶標部位的藥物濃度，有利于減小藥物在正常組織活細胞的分布，降低藥物的毒副作用；(2)藥物分子靶標部位的藥物濃度增加，有利于提高該類抗腫瘤藥物的療效。

附圖說明

圖1為BSA-PTX-LNP的透射電鏡下的形態圖。

圖2為MCF-7細胞在不同藥物載體及濃度的培養液中的細胞存活率。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做進一步的詳細說明

實施例1

一種白蛋白包覆載杉醇脂質納米粒的制備

(1)脂質核心的制備：按比例精密稱取紫杉醇10mg、磷脂50mg、十八胺1.7mg置于茄形瓶中，加入氯仿8～12ml超聲溶解，30℃減壓蒸發成膜，加入水合介質pH為7.4的PBS8～12ml，30℃水合30min，冰浴探頭超聲功率為200w，超聲1s，間歇1s，總時間為3min，即得到脂質核心溶液；

(2)牛血清白蛋白包覆載紫杉醇脂質納米粒制劑的制備：稱取BSA 3.3mg，用PBS溶液溶解后，緩慢加入步驟(1)制備得到的脂質核心溶液中，于30℃緩慢攪拌孵育10h，使BSA物理包覆于脂質核心表面，微柱離心法分離未包覆的游離蛋白，即得牛血清白蛋白包覆的紫杉醇脂質納米粒。

實施例2

一種白蛋白包覆載杉醇脂質納米粒的制備

(1)脂質核心的制備：按比例精密稱取紫杉醇10mg、磷脂100mg、十八胺2mg置于茄形瓶中，加入氯仿8～12ml超聲溶解，35℃減壓蒸發成膜，加入水合介質pH為7.4的PBS 8～12ml，30-40℃水合20min，冰浴探頭超聲，功率為200w，超聲1s，間歇1s，總時間為5min，即得到脂質核心溶液；

(2)牛血清白蛋白包覆載紫杉醇脂質納米粒制劑的制備：稱取BSA 10mg，用PBS溶液溶解后，緩慢加入步驟(1)制備得到的脂質核心溶液中，于37℃緩慢攪拌孵育8h，使BSA物理包覆于脂質核心表面，微柱離心法分離未包覆的游離蛋白，即得牛血清白蛋白包覆的紫杉醇脂質納米粒。

實施例3

一種白蛋白包覆載杉醇脂質納米粒的制備

(1)脂質核心的制備：按比例精密稱取紫杉醇10mg、磷脂150mg、十八胺3.3mg置于茄形瓶中，加入氯仿8～12ml超聲溶解，40℃減壓蒸發成膜，加入水合介質pH為7.4的PBS 8～12ml，40℃水合15min，冰浴探頭超聲，功率為200w，超聲1s，間歇1s，總時間為6min，即得到脂質核心溶液；

(2)牛血清白蛋白包覆載紫杉醇脂質納米粒制劑的制備：稱取BSA 30mg，用PBS溶液溶解后，緩慢加入步驟(1)制備得到的脂質核心溶液中，于3℃緩慢攪拌孵育6h，使BSA物理包覆于脂質核心表面，微柱離心法分離未包覆的游離蛋白，即得牛血清白蛋白包覆的紫杉醇脂質納米粒。

實施例4

紫杉醇脂質納米粒的理化性質考察

取實施例2中制備的PTX-LNP及BSA-PTX-LNP對其理化性質進行考察，粒子的形態、粒徑大小、荷電情況是表征納米粒子的基本參數，很大程度上影響納米粒子分散成膠體溶液的穩定性。本發明主要采用Nicomp-380型粒度測定儀測定PTX-LNP及BSA-PTX-LNP的粒徑和Zeta電位，對納米粒的一些表觀性質進行研究。另外，并對PTX-LNP及BSA-PTX-LNP的包封率與載藥量、包覆率進行了測定。

方法與結果

1.紫杉醇脂質納米粒外觀

新制備的PTX-LNP與BSA-PTX-LNP外觀均為淡藍色乳光明顯的澄明溶液。透射電子顯微鏡(TEM)是以電子束透過樣品經過聚焦和放大產生物像后，投射到光屏進行觀察。由于電子的易散射和易被物體吸收，穿透力低，容易成像。BSA-PTX-LNP的電鏡照片見圖1。由圖可見，牛血清白蛋白包覆載紫杉醇脂質納米粒制劑(BSA-PTX-LNP)呈圓形或類圓形。

2.紫杉醇脂質納米粒粒徑及分布

取制備好的兩種紫杉醇脂質納米粒適量，加滅菌注射用水稀釋，利用Nicomp-380激光粒度測定儀測定其粒徑及分布。兩種紫杉醇脂質納米粒的粒徑數據見表1。

表1 PTX-LNP和BSA-PTX-LNP的直徑

The data are expressed as the mean±SD value for at least three different preparations

由上述表1中的實驗數據可見紫杉醇脂質納米粒在包覆了BSA后粒徑有所增加。

3.紫杉醇脂質納米粒Zeta電位測定

Zeta電位是微粒表面荷電性質和荷電大小的標志，常用來預測和控制微粒分散系統的物理穩定性。本研究采用Nicomp-380激光粒度測定儀測定了PTX-LNP和BSA-PTX-LNP的Zeta電位，將樣品分別稀釋至一定濃度，放入比色池中測定，測得PTX-LNP和BSA-PTX-LNP的Zeta電位分別為+17.5mV和+4.66mV。

4.紫杉醇脂質納米粒包封率與載藥量的測定

微孔濾膜法測定紫杉醇包封率。分別取過膜前后的脂質納米載粒100μL，加適量甲醇破乳，離心取上清液，按上述HPLC法測定紫杉醇含量。分別計算紫杉醇的包封率(EE)和載藥量(DL)。數據見表2。

表2 PTX-LNP和BSA-PTX-LNP中紫杉醇的包封率(EE)和載藥量(DL)

5.紫杉醇脂質納米粒包覆率的測定

凝膠色譜法分離包覆在納米粒表面的BSA及游離BSA。取BSA-PTX-LNP 0.5mL置于瓊脂糖CL-4B凝膠柱上方，以蒸餾水洗脫并收集BSA部分至10mL量瓶，并以蒸餾水定容，考馬斯亮藍法測定BSA含量，BSA包覆率(CE)＝(1－W_f/W_t)×100％。其中，W_f為游離白蛋白的量，W_t為制劑中白蛋白的加入量。BSA在BSA-PTX-LNP上的包覆率為85％。

本發明采用薄膜分散法制備了BSA包覆的陽離子脂質納米粒和未包覆的普通陽離子脂質納米粒(BSA-PTX-LNP和PTX-LNP)，并對包覆和未包覆牛血清白蛋白的紫杉醇脂質納米粒的理化性質分別進行了表征。包括外觀、形態學、粒度、Zeta電位、包封率和載藥量、包覆率。結果顯示：兩種紫杉醇脂質納米粒外觀均為淡藍色乳光明顯的澄明溶液。PTX-LNP和BSA-PTX-LNP的粒徑分別為104.1nm和119.0nm；Zeta電位分別為+17.5mV和4.66mV；包封率分別為93.51％和89.76％；載藥量分別為6.86％和6.21％；BSA在BSA-PTX-LNP上的包覆率為85％。以上實驗數據均表明了白蛋白在BSA-PTX-LNP上的有效包覆。

實施例5

白蛋白包覆載紫杉醇脂質納米粒腫瘤細胞靶向實驗

細胞：人乳腺癌細胞系MCF-7細胞，購自上海坤肯生物化工有限公司。

1.培養液配制及細胞培養

培養液配制

DMEM培養液：取DMEM干粉10.4g，用重蒸餾水溶解后，加入碳酸氫鈉3.7g，HEPES 2.0g，溶解后用重蒸餾水定容至1000mL，用1mol·L^-1HCl調pH至7.0，經0.2μm濾膜過濾器除菌，分裝，-20℃貯存備用。用前加入胎牛血清至濃度為10％，青鏈霉素至終濃度為100單位/mL。

磷酸鹽緩沖液(PBS)：分別稱取氯化鈉8.0g、氯化鉀0.2g，磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g，依次溶解于800mL蒸餾水中，混勻。用1mol·L^-1HCl調pH至7.4，最后加蒸餾水定容至1000mL，配成濃度為0.01mol·L^-1的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)。高壓滅菌30min，4℃貯存備用。

消化液：取胰蛋白酶0.25g，EDTA0.02g，溶解于100mL PBS中，經0.22μm濾膜過濾除菌，4℃貯存備用。

細胞培養

細胞復蘇與培養：從液氮中取出凍存的MCF-7細胞，迅速放入37℃水浴快速解凍，無菌條件下將細胞轉移至10mL離心管，加細胞培養液補足至10mL，1000r·min^-1，離心5min，棄去上清。加入含10％胎牛血清的DMEM培養液，重懸細胞，并接種于100mL培養瓶中，在5％CO2、37℃培養箱中培養，維持細胞處于對數生長期，備用。

細胞傳代：培養瓶中細胞生長面積至培養瓶培養面的70％～80％時，棄去培養液，加入2mL PBS，清洗3次。向培養瓶中加入400μL胰酶消化液，使之充分潤濕瓶壁后倒掉，用殘余的胰酶消化。置于培養箱中2～5min，倒置顯微鏡下觀察，當細胞變圓收縮、細胞間隙增大時，加入含10％胎牛血清的DMEM培養液，輕輕吹打瓶壁，至貼壁細胞全部進入培養液。將細胞懸液平均分為2～3瓶培養，補足培養液。

2紫杉醇脂質納米粒體外細胞毒實驗

MTT法原理

MTT法是一種檢測細胞存活和生長的方法。MTT商品名：噻唑藍，化學名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)，是一種能接受氫離子黃色染料。活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的紫色結晶物，用酶聯免疫檢測儀在492nm波長處測定其吸光度值(OD值)，可間接反映活細胞數量。

MTT溶液的配制

用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)制成濃度為5mg·mL^-1溶液，磁力攪拌30min，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，放2～8℃冰箱內避光保存備用。

MTT的測定

取對數生長期MCF-7的細胞株胰酶消化后，用加有10％胎牛血清的DMEM細胞培養液制成細胞懸液。計數后，以每孔6000個/100μL細胞濃度接種于96孔板，將細胞于5％CO2，37℃、飽和濕度條件下恒溫CO2培養箱中培養24h。取出培養板后，小心吸走孔內培養液，再分別加入含PTX濃度為0.001，0.01，0.1，1，10μg·mL^-1的PTX溶液，PTX-LNP和BSA-PTX-LNP，每孔加入100μL。作用48h后，分別取出培養板，每孔加入MTT(5μg·mL^-1，25μL)繼續置于培養箱培養4h后取出，小心吸出孔內液體,每孔再加入DMSO 100μL。在恒溫搖床上，振搖10min，使沉淀充分溶解。在酶標儀波長(λ)＝490nm處測定吸光度(A)，記錄結果，按公式計算細胞存活結果如圖2所示。

細胞抑制率＝[(A_對照組－A_給藥組)/(A_對照組－A_空白組)]×100％

細胞存活率＝(1－細胞抑制率)×100％

由圖2中的實驗數據可以看出，PTX濃度相同時，腫瘤細胞在三種溶液中的存活率依次為PTX＞PTX-LNP＞BSA-PTX-LNP，并且隨著藥物濃度逐漸增大，細胞存活率逐漸降低，說明白蛋白的包覆有利于提高紫杉醇脂質納米制劑的藥效。

3紫杉醇脂質納米粒細胞攝取實驗

樣品的處理

將培養板中的細胞用4℃預冷的pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細胞三次，每次5ml，加入胰酶消化細胞，用重蒸水稀釋，將細胞轉移至10ml離心管中，1000r·min^-1，離心5min，棄去上清。轉移到5ml離心管中，冰浴下探頭超聲，(工作1s，間歇1s，功率為40w，超聲5min)。10000r·min^-1，離心5min，取上清液待測。

細胞攝取實驗

將對數生長期MCF-7的細胞株胰酶消化，制成細胞懸液。計數后，以每孔6×10⁴個/1mL細胞濃度接種于12孔板中，將細胞置于恒溫CO2培養箱中，5％CO2，37℃，飽和濕度條件下培養24小時。取出培養板，吸走孔內培養液，再分別加含PTX、PTX-LNP、BSA-PTX-LNP的細胞培養液，置于恒溫CO2培養箱中37℃分別孵育2小時后，按“2.3.1”方法操作后，HPLC法測定含量。結果如表3所示。

表3 不同制劑的細胞攝取實驗

由表3中的實驗數據可以看出，三種不同溶液的細胞攝取量為BSA-PTX-LNP＞PTX-LNP＞PTX，說明白蛋白的包覆有利于增加細胞對紫杉醇的攝取量。

通過上述細胞毒性實驗以及細胞攝取實驗初步探討BSA對紫杉醇脂質納米粒腫瘤細胞殺傷力以及在腫瘤細胞中攝取情況的影響。MTT法研究BSA-PTX-LNP和PTX-LNP對MCF-7細胞的體外細胞毒作用，實驗結果表明，BSA的有效包覆有利于增加紫杉醇對腫瘤細胞的殺傷能力。細胞攝取實驗結果表明BSA的有效包覆有利于增加腫瘤細胞對藥物的攝取率。

綜上所述，本發明制備的牛血清白蛋白包覆紫杉醇脂質納米粒制劑為藥物靶向腫瘤載體系統提供了一種新的具有腫瘤細胞靶向的納米給藥系統，提高了抗腫瘤藥物對腫瘤部位的靶向及腫瘤殺傷能力。可增加藥物分子靶標部位的藥物濃度，有利于減小藥物在正常組織活細胞的分布，降低藥物的毒副作用；藥物分子靶標部位的藥物濃度增加，有利于提高該類抗腫瘤藥物的療效。