本發明涉及組織工程及再生醫學材料
技術領域：
，尤其涉及一種用于硬腦膜缺損部位的修復手術，包括幕上、大腦半球手術，幕下、后顱窩手術，顱底微創手術、鎖孔手術和腦脊液漏的修補手術的復層可吸收生物膜的制備方法。
背景技術：
：硬腦膜是腦組織表面一層重要的組織結構，是保護腦組織的一道重要屏障。硬腦膜的完整性對于顱腦手術患者十分重要，腦膜修補材料對于重建硬腦膜完整性，保護腦組織，防止腦脊液漏，顱內感染，腦膨出，癲癇等并發癥具有重要意義。創傷、腫瘤侵蝕及手術過程本身等因素均可造成硬腦膜的缺損，故需要其他代替材料來修補缺損的硬腦膜，以使其保持解剖結構的完整。目前，根據材料來源，臨床上所用到的人工硬腦膜補片主要分為4類，分別是自體組織修補材料、同種異體修補材料、異種天然生物膜和人工合成材料。自體組織修補材料主要為肌筋膜、膜狀腱膜、脂肪等。這些材料具有很好的生物相容性和安全性，不發生排異反應、免疫反應，但其二次損傷、步驟繁瑣、容易粘連以及加重病人痛苦等缺點，在臨床上應用越來越少；同種異體修補材料主要為凍干的人體硬腦膜。這些材料有正常人體腦膜的超微結構，從結構上看是最好的。然而這種材料存在病毒、傳染病等風險，而且供體來源有限，已經被禁用；異種天然生物膜主要為豬腹膜、羊腹膜、牛心包等。這些材料與硬膜結構相似，有助于恢復正常的生理解剖結構，且具有一定的強度。但是這些材料存在細胞殘留、抗原抗體反應，病毒、感染及毒性反應，保存及使用步驟繁瑣等缺點；人工合成材料主要為聚乙醇酸、聚乳酸、聚已內酯等高分子材料。這些材料取材方便，成本低，無潛在病毒感染，但其降解速率較慢、生物學性能差等缺點限制了其應用；除了以上四種材料，以膠原蛋白為原材料制備人工硬腦膜越來越受到大家的關注。i型膠原蛋白是硬腦膜最主要的細胞外基質成分，獨特的三維孔隙結構，為受損硬腦膜的再生和重建提供最佳的介質和支架。既避免了動物源性的潛在危險，又比合成材料具有更好的生物相容性。i型膠原蛋白是由兩條α1肽鏈和一條α2肽鏈組成，三條肽鏈以鏈間的氫鍵緊密地結合在一起，形成穩定的三股螺旋膠原單體結構。膠原有刺激細胞增殖的作用，尤其是成纖維細胞及上皮細胞。人體內的細胞絕大多數屬于貼附依賴性細胞，只有在一定的基質上貼附鋪展，才能使細胞增殖周期運行，而膠原是細胞貼附的最重要的基質成分。由于人體的硬腦膜組織屬不規則致密結締組織，主要由成纖維細胞和i型膠原蛋白組成。因此，i型膠原蛋白對硬腦膜的再生和修復起著至關作用，但是，現有技術在力學性能、是否縫合、降解速率等方面還有不足，需要進一步改進和優化。技術實現要素：有鑒于此，本發明提供一種復層可吸收生物膜的制備方法，以解決現有技術存在的問題?；谏鲜瞿康模景l明提供的一種復層可吸收生物膜的制備方法包括以下步驟：配置硫酸軟骨素乙酸溶液和膠原乙酸溶脹液；在膠原乙酸溶脹液中加入硫酸軟骨素乙酸溶液，得到膠原-硫酸軟骨素漿液，在配置的過程中溶液均勻攪拌并抽真空；將膠原硫酸軟骨素溶液進行第一次真空冷凍干燥，得到具有三維結構的膠原膜；將膠原膜壓制成致密膠原膜；將膠原硫酸軟骨素溶液倒在鋪有致密膠原膜的凍干盤中或直接通過膠原-硫酸軟骨素漿液將膠原致密層和膠原膜粘附在一起，進行第二次真空冷凍干燥，得到具有疏松層和致密層的復合膠原膜；復合膠原膜進行交聯；將交聯后的復合膠原膜進行滅菌，得到復層可吸收生物膜。在基于上述復層可吸收生物膜的制備方法的另一個實施例中，所述硫酸軟骨素乙酸溶液由如下方法配置：將2-4克硫酸軟骨素加入到500毫升濃度為0.4-0.6％乙酸溶液中，在0-10℃溫度條件下，溶解，過濾得到。在基于上述復層可吸收生物膜的制備方法的另一個實施例中，所述膠原乙酸溶脹液由如下方法配置：將3-5克i型膠原蛋白加入到500毫升濃度為0.3-0.6％乙酸溶液中，混合攪拌，攪拌速度為15000-20000轉/分，攪拌時間為1-2小時。在基于上述復層可吸收生物膜的制備方法的另一個實施例中，所述i型膠原蛋白為牛跟腱中提取的高純度膠原蛋白，其中i型膠原蛋白占總蛋白含量不小于99％，羥脯氨酸的含量不小于10％。在基于上述復層可吸收生物膜的制備方法的另一個實施例中，所述在膠原乙酸溶脹液中加入硫酸軟骨素乙酸溶液，得到膠原-硫酸軟骨素漿液，在配置的過程中溶液均勻攪拌并抽真空包括：將200-500毫升硫酸軟骨素乙酸水溶液緩慢加入到膠原乙酸溶脹液中，攪拌速度為15000-20000轉/分，攪拌時間為1-2小時，將溶液抽真空，得到膠原-硫酸軟骨素漿液。在基于上述復層可吸收生物膜的制備方法的另一個實施例中，所述將膠原硫酸軟骨素溶液進行第一次真空冷凍干燥的方法為：將膠原-硫酸軟骨素漿液倒到不銹鋼凍干盤中，輕搖使其分布均勻，控制其厚度在2-5毫米；在溫度為–50-30℃，壓力≤0.2兆帕條件下進行真空冷凍干燥，生成孔隙為30-250微米的膠原膜。在基于上述復層可吸收生物膜的制備方法的另一個實施例中，所述將膠原膜壓制成致密膠原膜包括：用壓膠原機的壓力均勻地分散到膠原膜上，所述壓膠原機的所采用的壓力為5-15兆帕，時間為1-3分鐘，使膠原膜表面平整，膠原膜的壓制厚度為1-2毫米，孔隙≤100微米，達到致密膠原層的要求。在基于上述復層可吸收生物膜的制備方法的另一個實施例中，所述第二次真空冷凍干燥的方法為：將致密膠原層鋪在不銹鋼凍干盤中，將膠原硫酸軟骨素溶液倒在致密膠原膜上或在膠原致密層上刷一層均勻膠原-硫酸軟骨素漿液，將膠原膜平整地放在膠原致密層上，控制其總厚度在3-6毫米；在溫度為–50-30℃，真空度≤0.2bar的條件下進行真空冷凍干燥，上層的膠原硫酸軟骨素溶液生成孔隙為30-250微米的膠原膜，形成上層為膠原膜，下層為致密膠原層的復合膠原膜。在基于上述復層可吸收生物膜的制備方法的另一個實施例中，所述真空冷凍干燥包括緩凍干燥和速凍干燥兩種冷卻干燥方式進行冷卻干燥。在基于上述復層可吸收生物膜的制備方法的另一個實施例中，所述緩凍干燥包括以下步驟：預凍階段，溫度：3-5℃，時間：120-180分鐘；冷凍階段，溫度：-35--45℃，時間：310-360分鐘；抽空干燥階段，溫度：-8--10℃，時間：740-920分鐘，真空度：0.2bar；第一干燥階段，溫度：-10.5--13.5℃，時間：380-460分鐘，真空度：0.2bar；第二干燥階段，溫度：-5℃，時間：350-420分鐘，真空度：0.2bar；第三干燥階段，溫度：0℃，時間：80-90分鐘，真空度：0.2bar；第四干燥階段，溫度：20-30℃，時間：70-100分鐘，真空度：0.2bar。在基于上述復層可吸收生物膜的制備方法的另一個實施例中，所述速凍干燥包括以下步驟：冷凍階段，溫度：-38℃，時間：40分鐘；抽空干燥階段，溫度：-18℃，時間：720分鐘，真空度：0.2bar；第一干燥階段，溫度：-8℃，時間：420分鐘，真空度：0.2bar；第二干燥階段，溫度：0℃，時間：180分鐘，真空度：0.2bar；第三干燥階段，溫度：10℃，時間：180分鐘，真空度：0.2bar；第四干燥階段，溫度：24℃，時間：95分鐘，真空度：0.2bar。在基于上述復層可吸收生物膜的制備方法的另一個實施例中，所述復合膠原膜進行交聯包括：首先進行高溫真空交聯，對膠原膜先進行高溫真空的物理交聯，交聯條件為：溫度為90-110℃，時間為24-36小時；然后使用低濃度的戊二醛作為交聯劑，對膠原膜進行化學交聯，交聯條件為：戊二醛的濃度為0.001％-0.01％，溫度為0-15℃，時間為10-36小時。在基于上述復層可吸收生物膜的制備方法的另一個實施例中，所述將交聯后的復合膠原膜進行滅菌為使用環氧乙烷、co60輻照、紫外輻照中的至少一種方法進行滅菌。在基于上述復層可吸收生物膜的制備方法的另一個實施例中，所述使用環氧乙烷滅菌包括：環氧乙烷占環氧乙烷和二氧化碳混合氣體的比例為40％-60％，溫度為50-60℃,濕度為20％-50％rh，時間為2-5小時,換氣次數為4-7次。由上面所述可以得出，本發明的有益效果為：(1)以高純度i型膠原蛋白為原料，制備了由疏松層和致密層組成的復層可吸收生物膜，具有良好的生物相容性、無毒、無抗原反應。(2)采用兩次特殊冷凍干燥的方式制備的復層可吸收生物膜，具有良好的力學性能?？筛鶕中g要求進行縫合，在某些情況下可免縫合，節省手術時間防止縫線帶來癲癇的危險。(3)應用于硬腦膜缺損的修復手術，其三維多孔結構有利于成纖維細胞、毛管細胞長入，復層可吸收生物膜的再生和支架的降解同步進行，可有效防止腦脊液滲漏，防粘連，減少瘢痕的產生。具體實施方式為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。本發明提供的復層可吸收生物膜的制備方法包括以下步驟：步驟1：配置硫酸軟骨素乙酸溶液和膠原乙酸溶脹液；步驟2：在膠原乙酸溶脹液中加入硫酸軟骨素乙酸溶液，得到膠原-硫酸軟骨素漿液，在配置的過程中溶液均勻攪拌并抽真空；步驟3：將膠原硫酸軟骨素溶液進行第一次真空冷凍干燥，得到具有三維結構的膠原膜；步驟4：將膠原膜壓制成致密膠原膜；步驟5：將膠原硫酸軟骨素溶液倒在鋪有致密膠原膜的凍干盤中或在膠原致密層上刷一層均勻膠原-硫酸軟骨素漿液，將膠原膜平整地放在膠原致密層上，進行第二次真空冷凍干燥，得到具有疏松層和致密層的復合膠原膜；步驟6：復合膠原膜進行交聯；步驟7：將交聯后的復合膠原膜進行滅菌，得到復層可吸收生物膜。步驟1中所述硫酸軟骨素乙酸溶液由如下方法配置：將2-4克硫酸軟骨素加入到500毫升濃度為0.4-0.6％乙酸溶液中，在0-10℃溫度條件下，溶解，過濾得到。步驟1中所述膠原乙酸溶脹液由如下方法配置：將3-5克i型膠原蛋白加入到500毫升濃度為0.3-0.6％乙酸溶液中，混合攪拌，攪拌速度為15000-20000轉/分，攪拌時間為1-2小時。所述i型膠原蛋白為牛跟腱中提取的高純度膠原蛋白，其中i型膠原蛋白占總蛋白含量不小于99％，羥脯氨酸的含量不小于10％。步驟2中所述在膠原乙酸溶脹液中加入硫酸軟骨素乙酸溶液，得到膠原-硫酸軟骨素漿液，在配置的過程中溶液均勻攪拌并抽真空包括：將200-500毫升硫酸軟骨素乙酸水溶液緩慢加入到膠原乙酸溶脹液中，攪拌速度為15000-20000轉/分，攪拌時間為1-2小時，將溶液抽真空，得到膠原-硫酸軟骨素漿液。步驟3中所述將膠原硫酸軟骨素溶液進行第一次真空冷凍干燥的方法為：將膠原-硫酸軟骨素漿液倒到不銹鋼凍干盤中，輕搖使其分布均勻，控制其厚度在2-5毫米；在溫度為–50-30℃，壓力≤0.2兆帕條件下進行真空冷凍干燥，生成孔隙為30-250微米的膠原膜。步驟4中所述將膠原膜壓制成致密膠原膜包括：用壓膠原機的壓力均勻地分散到膠原膜上，所述壓膠原機的所采用的壓力為5-15兆帕，時間為1-3分鐘，使膠原膜表面平整，膠原膜的壓制厚度為1-2毫米，孔隙≤100微米，達到致密膠原層的要求。步驟5中所述第二次真空冷凍干燥的方法為：將致密膠原層鋪在不銹鋼凍干盤中，將膠原硫酸軟骨素溶液倒在致密膠原膜上或在膠原致密層上刷一層均勻膠原-硫酸軟骨素漿液，將膠原膜平整地放在膠原致密層上，控制其總厚度在3-6毫米；在溫度為–50-30℃，真空度≤0.2bar的條件下進行真空冷凍干燥，上層的膠原硫酸軟骨素溶液生成孔隙為30-250微米的膠原膜，形成上層為膠原膜，下層為致密膠原層的復合膠原膜。步驟3和步驟5中所述真空冷凍干燥包括緩凍干燥和速凍干燥兩種冷卻干燥方式進行冷卻干燥。所述緩凍干燥包括以下步驟：預凍階段，溫度：3-5℃，時間：120-180分鐘；冷凍階段，溫度：-35--45℃，時間：310-360分鐘；抽空干燥階段，溫度：-8--10℃，時間：740-920分鐘，真空度：0.2bar；第一干燥階段，溫度：-10.5--13.5℃，時間：380-460分鐘，真空度：0.2bar；第二干燥階段，溫度：-5℃，時間：350-420分鐘，真空度：0.2bar；第三干燥階段，溫度：0℃，時間：80-90分鐘，真空度：0.2bar；第四干燥階段，溫度：20-30℃，時間：70-100分鐘，真空度：0.2bar。所述速凍干燥包括以下步驟：冷凍階段，溫度：-38℃，時間：40分鐘；抽空干燥階段，溫度：-18℃，時間：720分鐘，真空度：0.2bar；第一干燥階段，溫度：-8℃，時間：420分鐘，真空度：0.2bar；第二干燥階段，溫度：0℃，時間：180分鐘，真空度：0.2bar；第三干燥階段，溫度：10℃，時間：180分鐘，真空度：0.2bar；第四干燥階段，溫度：24℃，時間：95分鐘，真空度：0.2bar。步驟6中所述復合膠原膜進行交聯包括：首先進行高溫真空交聯，對膠原膜先進行高溫真空的物理交聯，交聯條件為：溫度為90-110℃，時間為24-36小時；然后使用低濃度的戊二醛作為交聯劑，對膠原膜進行化學交聯，交聯條件為：戊二醛的濃度為0.001％-0.01％，溫度為0-15℃，時間為10-36小時。步驟7中，所述將交聯后的復合膠原膜進行滅菌為使用環氧乙烷、co60輻照、紫外輻照中的至少一種方法進行滅菌。所述使用環氧乙烷滅菌包括：環氧乙烷占環氧乙烷和二氧化碳混合氣體的比例為40％-60％，溫度為50-60℃,濕度為20％-50％rh，時間為2-5小時,換氣次數為4-7次。實施例1i型膠原溶脹液的制備將從牛跟腱中提取的高純度i型膠原蛋白解凍，取3克膠原蛋白溶解于500毫升濃度為0.5％乙酸溶液中，攪拌1-2小時，得到膠原乙酸溶脹液。膠原-硫酸軟骨素漿液的制備將400毫升濃度為0.4％的硫酸軟骨素乙酸水溶液緩慢加入到上述膠原乙酸溶脹液中，攪拌速度為15000-20000轉/分，攪拌時間為1-2小時，抽真空去泡，得到膠原-硫酸軟骨素漿液。致密膠原膜的制備將150毫升上述膠原-硫酸軟骨素漿液倒入到不銹鋼凍干盤中，倒入后的厚度為4±2毫米，通過特殊的梯度冷卻干燥的方法進行冷凍干燥，得到膠原膜。通過壓膠原機將膠原膜壓制成厚度為1-2毫米的致密膠原層。復層可吸收生物膜的制備將致密膠原膜平鋪在不銹鋼凍干盤中，將100毫升的膠原–硫酸軟骨素漿液均勻地倒在致密膠原膜上，控制其總厚度在3-6毫米，通過緩凍干燥的方法進行冷凍干燥，得到具有疏松層和致密層的復層可吸收生物膜，具體的冷凍干燥程序如表1所示：表1：步驟號階段設定溫度(℃)時間(分)真空度(bar)1預凍3-5120-180—2冷凍–35-–45310-360—3抽空干燥–8-–10740-9200.24干燥–10.5-–13.5380-4600.25干燥5350-4200.26干燥080-900.27干燥24-3070-1000.2通過此過程得到的孔隙范圍為微米。復層可吸收生物膜的交聯首先進行高溫真空交聯，將復層可吸收生物膜放置于真空干燥箱中進行高溫真空交聯，條件為：溫度為100℃，時間為12小時。其次，低濃度的戊二醛作為交聯劑，其中，戊二醛的濃度為0.001％，溫度為5℃，時間為24小時。復層可吸收生物膜的滅菌將復合膠原膜切割成不同規格，雙層包裝，利用環氧乙烷滅菌。實施例2i型膠原溶脹液的制備將從牛跟腱中提取的高純度i型膠原蛋白解凍，取4克膠原蛋白溶解于600毫升濃度為0.5％乙酸溶液中，攪拌1-2小時，得到膠原乙酸溶脹液。膠原-硫酸軟骨素漿液的制備將500毫升濃度為0.4％的硫酸軟骨素乙酸水溶液緩慢加入到上述膠原乙酸溶脹液中，攪拌速度為15000-20000轉/分，攪拌時間為1-2小時，抽真空去泡，得到膠原-硫酸軟骨素漿液。致密膠原膜的制備將150毫升的膠原-硫酸軟骨素漿液倒入到不銹鋼凍干盤中，倒入后的厚度為4±2毫米，通過梯度冷卻干燥的方法進行冷凍干燥，得到膠原膜。通過壓膠原機將膠原膜i型壓制成厚度為1-2毫米的致密膠原層。復層可吸收生物膜的制備將致密膠原膜平鋪在不銹鋼凍干盤中，在膠原致密膜上刷一層均勻膠原-硫酸軟骨素漿液，將膠原膜平整地放在膠原致密層上，控制其總厚度在3-6毫米，通過速凍干燥的方法進行冷凍干燥，得到具有疏松層和致密層的復層可吸收生物膜，具體的冷凍干燥程序如表2所示：表2：步驟號階段設定溫度(℃)保持時間(分)真空度(bar)1冷凍–3840—2抽空干燥–187200.24干燥–84200.25干燥01800.26干燥101800.27干燥24950.2通過此過程得到的孔隙范圍為30-150微米。復層可吸收生物膜的交聯首先進行高溫真空交聯，將復層可吸收生物膜放置于真空干燥箱中進行高溫真空交聯，條件為：溫度為95℃，時間為24小時。其次，低濃度的戊二醛作為交聯劑，其中，戊二醛的濃度為0.005％，溫度為10℃，時間為12小時。復層可吸收生物膜的滅菌將復層可吸收生物膜切割成不同規格，雙層包裝，利用環氧乙烷滅菌。以上對本發明所提供的一種復層可吸收生物膜的制備方法進行了詳細介紹，本文中應用了具體個例對本發明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想；同時，對于本領域的一般技術人員，依據本發明的思想，在具體實施方式及應用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內容不應理解為對本發明的限制。最后應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換,凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁12