本發明涉及生物醫學技術領域，特別是涉及一種由成骨細胞膜片和成血管內皮細胞膜片構建的無外源支架血管化組織工程骨及其制備方法。

背景技術：

嚴重創傷、腫瘤切除、感染、先天性畸形等所造成的大塊骨缺損的治療是現代醫學面臨的難題和巨大挑戰,一直是人類幾個世紀以來不斷深入研究和探索的重要課題。目前臨床上常用的修復手段有自體骨移植、異體骨移植以及使用人工骨等，但以上方法均存在一定缺陷。自體骨移植是公認的骨組織修復的金標準，但是患者要經受自體組織移植手術的創傷，而且供區有限，因此，自體骨移植不能視為理想的大面積骨缺損的修復方法；異體骨移植存在免疫排斥反應、疾病傳播等風險，有時甚至危及病人生命；人工骨植入容易導致異物排斥反應、感染等。因此,有必要尋找一種新的大塊骨缺損的修復手段。

在此情況下，組織工程學的興起和發展,為骨缺損的修復提供了新的可能，為彌補目前骨缺損治療方法的缺陷帶來了希望。

近年來,骨組織工程的研究取得了很大進展,應用組織工程技術在小型哺乳動物體內構建骨組織,修復小尺寸的骨缺損的方法已基本成熟，但是對于大型哺乳動物大范圍或受區血供不佳的骨缺損，由于移植物早期沒有獨立的血液供應，營養滲透不足，骨痂形成緩慢等原因，成骨效果仍不穩定。有研究表明,決定和制約組織工程骨修復骨缺損療效的關鍵是其在體內血管化的速度和程度。sahota等也認為組織工程植入物失敗的主要原因在于血管化的遲滯。因此，如何建立有效的血液供應,在體內構建能及時血管化的組織工程骨,縮短骨愈合時間是目前骨組織工程研究的一個重要方向，也是制約組織工程骨大規模臨床應用的關鍵。

目前組織工程骨的血管化策略主要包括：支架的設計開發、應用生長因子、體內埋植、體內動脈小室和整體培養系統等。盡管這些方法在一定程度解決了組織構建時的血管化問題，但均存在不足。比如，在支架的制作過程中，對材料內部的孔隙大小和相互連接進行修飾,可有利于血管網的長入，但存在炎癥反應、潛在的免疫原性風險等,而且血管化速度不理想；促血管生長因子應用時存在調控問題，生長因子在體內半衰期較短,大劑量應用又有致畸可能，并且可能加速某些病理過程，如血管瘤的發生等；體內埋植和體內動脈小室均需二次手術，供體選擇困難，有潛在的疾病傳播風險等，限制了臨床應用；整體培養系統為完善的“人造器官”，但技術難度高，實現困難。

近年，國內外研究人員通過血管內皮細胞與成骨細胞聯合培養的技術方法，構建出血管化組織工程骨，即可形成骨組織又可同時血管化。但傳統的“細胞－支架”策略的不足之處在于：種子細胞在種植到支架材料的過程中，有30-40％的細胞不能粘附于支架而流失，細胞附著率低、利用率差；細胞之間相互作用少，難以形成體內細胞應有的微環境，細胞支架復合物植入體內后，骨形成總是發生在支架的外周，影響成骨的大小和質量。為了解決上述問題，人們研究出細胞膜片技術。它是通過體外對細胞進行高密度培養,使細胞生長成為多層并分泌大量細胞外基質,形成由細胞和細胞外基質構成的細胞膜片。細胞膜片技術應用于組織工程中主要有三方面優勢:一、膜片的形成能夠減少組織構建過程中細胞的流失和損傷,提高細胞利用率；二、細胞膜片具有一定的機械強度,能夠在無支架的情況下進行組織構建,避免了支架材料引起的組織相容性問題,且易于操作、價格低廉；三、豐富的細胞外基質為細胞提供適合的生長環境,并在發育過程中儲存和激活生長因子,為組織的發育提供結構和功能幫助。所以，如能將成骨細胞膜片聯合內皮細胞膜片，通過合適的方法構建血管化組織工程骨，預計將較成骨細胞與內皮細胞共培養更具血管化和成骨優勢。

脂肪間充質干細胞(adipose-derivedstemcells，adscs)是存在于脂肪組織中的成體干細胞。與骨髓間充質干細胞相似，具有向成脂肪、成軟骨、成骨、成肌細胞和神經源細胞等分化的多分化潛能,是一種理想的種子細胞。與骨髓間充質干細胞相比，存在來源廣泛、獲取方式簡單，培養要求低，體外擴增能力強，增殖時間短，對機體創傷小等優點，有望成為組織工程更為理想的細胞來源。目前，脂肪來源間充質干細胞已廣泛應用于組織再生與修復。scherberich等利用脂肪間充質干細胞來源的內皮細胞及成骨細胞復合三維多孔陶瓷支架植入到裸鼠體內，8周后可觀察到血管化組織工程骨形成。papadimitropoulos等利用脂肪來源的內皮細胞，成骨細胞及外周血來源cd14+破骨細胞復合三維多孔陶瓷支架也得到了相似的結論。然而，外源性支架材料的植入可能會對宿主產生炎癥、排異等免疫反應，并且“細胞-支架”構建體系中缺乏細胞外基質參與，而細胞外基質在促進內皮細胞形成血管過程中起到至關重要的作用。細胞膜片技術可以彌補這一缺陷，該技術無需胰酶消化細胞，利用細胞間連接相連成片，保留了細胞間及細胞表面蛋白，利用細胞自分泌外基質作為支架，無需外源性支架材料。雖然血管化組織工程骨的構建已有很多的研究，但是利用脂肪來源的成骨細胞和內皮細胞，制備具有成骨和成血管能力的雙細胞復合膜片來構建血管化組織工程骨的策略卻還很少有人涉及。

技術實現要素：

本發明的目的就在于克服上述現有技術的缺陷，提供一種利用干細胞及細胞膜片技術構建的具有良好的成骨和成血管能力，且細胞來源豐富，易于分離獲取，對供體創傷小，培養要求低，有效避免對宿主產生炎癥、排異等免疫反應的無外源支架血管化組織工程骨。

本發明的另一目的是提供上述無外源支架血管化組織工程骨的制備方法。

為實現本發明目的所采取的技術方案為：

一種無外源支架血管組織工程骨，其特征在于其是由上層成血管內皮細胞膜片和下層成骨細胞膜片構成。

上述用于制備所述成血管內皮細胞膜片的內皮細胞和用于制備成骨細胞膜片的成骨細胞均來源于脂肪間充質干細胞。

上述無外源支架血管組織工程骨的制備方法，其特征在于其工藝包括：

1)成骨細胞膜片的制備

將第三代或第四代脂肪間充質干細胞先用胰蛋白酶消化至絕大部分細胞變圓，從瓶底脫落，然后用dmem/f12培養基終止消化，按1×10⁶～3×10⁶個/cm²的密度接種至培養皿中，加入含10～12％胎牛血清和1～1.5％雙抗(青霉素、鏈霉素)的dmem/f12培養基上，置于37℃，5％co2恒溫培養箱中培養24～48h，然后再用成骨細胞誘導培養液培養10～14天即可；

2)成血管內皮細胞膜片的制備

取第三代或第四代脂肪間充質干細胞按2×10⁶～4×10⁶個/cm²的密度接種于含10～12％胎牛血清和1～1.5％雙抗(青霉素、鏈霉素)的dmem/f12培養基中培養24～48h，然后再用血管內皮細胞誘導液持續培養10～14天即可；

3)無外源支架血管化組織工程骨的構建

將上述過程2)所得的成血管內皮細胞膜片折疊，平鋪在上述過程1)所得的已經折疊好的成骨細胞膜片上，靜置5min，期間間斷滴加含10～12％胎牛血清和1～1.5％雙抗(青霉素、鏈霉素)的dmem/f12培養基，最后折疊卷曲成類圓柱體。

上述過程1)中，所述成骨細胞誘導培養液組成為：dmem/f12培養基170～180ml，胎牛血清17～22ml，雙抗(青霉素、鏈霉素)1.7～2.7ml，谷氨酰胺2～3ml，抗壞血酸550～580ul，β-甘油磷酸鈉2～3ml，地塞米松15～25ul。

上述過程1)中，用成骨細胞誘導培養液培養時，隔日換液培養。

上述過程2)中，所述血管內皮細胞誘導液組成為：內皮細胞生長培養基(egm-2)90～110ml，胎牛血清4.5～5.5ml,維生素c0.09～0.11ml,慶大霉素-兩性霉素b(ga-1000)0.09～0.11ml,氫化可的松(hydrocortisone)0.036～0.044ml,人表皮生長因子(hegf)0.09～0.11ml,人成纖維細胞生長因子(hfgf-b)0.45～0.55ml,類胰島素一號增長因子(igf-i)0.09～0.11ml,血管內皮細胞生長因子(vegf)0.09～0.11ml。

上述過程2)中，用血管內皮細胞誘導液培養過程中，隔2-3天換液培養。

本發明依據材料優化設計的思想，充分借鑒干細胞及細胞膜片技術和骨組織發育過程技術，利用兔脂肪間充質干細胞具有多向分化潛能的特性，將其誘導分化，制備了具有成骨能力及成血管能力的雙細胞膜片，并用該雙細胞膜片構建血管化組織工程骨。此構建策略細胞來源豐富，易于分離獲取，對供體創傷小，不違背倫理學原則，培養要求低；構建血管化組織工程骨所需成骨細胞、內皮細胞均來自于脂肪間充質干細胞，無需額外添加不同來源的內皮細胞；利用細胞自分泌細胞外基質作為“內源性支架”，無需額外添加外源性支架材料，避免了機體免疫排異及炎癥反應。本發明的無外源支架的血管化組織工程骨制備方法簡單，條件溫和，具有良好的成骨和成血管性能，符合生物體內應用的要求，作為一種新型血管化組織工程骨具有良好的應用前景。

本發明的無外源支架血管化組織工程骨構建了一種創新性的血管化組織工程骨的思路和方法，為理想的血管化組織工程骨的開發以及大塊骨缺損的再生治療提供實驗基礎和理論依據，尤其是脂肪干細胞誘導的雙細胞膜片的提出與試驗，因操作技術相對簡單、成本較低、創傷小以及成骨和血管化效果較好，使血管化組織工程骨的應用具有更廣闊的前景，以滿足修復各種臨床硬組織缺損的需要。

將本發明的無外源支架血管化組織工程骨移植至免疫缺陷的裸鼠背部皮下。術后分別進行大體觀察、掃描電鏡(sem)及組織形態學分析等檢測其異位成骨的能力和對血管再生的影響。結果表明：he染色，第8周組織中形成微血管，膜片融合。第12周，組織變致密，微血管變少。masson染色：第12周綠染中出現紅染區域，b組最明顯。sem結果顯示：第12周，a組纖維分層生長排布疏松；b組纖維分層生長排布緊密；c組組織完全融合；d組可見疏松的纖維內有大量血管走行。上述結果充分說明：無外源支架雙細胞膜片復合體具備良好的成骨、成血管性能。

附圖說明

圖1為成骨細胞膜片(左)和內皮細胞膜片(右)的實物圖；

圖2為成骨細胞膜片(左)和內皮細胞膜片(右)的he染色圖；

圖3為成骨細胞膜片(左)和內皮細胞膜片(右)的sem圖；

圖4為雙細胞膜片構建的血管化組織工程骨動物體內移植8周觀察圖；

圖5為a組移植8周(左)和12周(右)he染色，黑箭頭示血管(×400)；

圖6為a組移植8周(左)和12周(右)(×500)的掃描電鏡圖。

具體實施方式

下面用實例予以說明本發明，應該理解的是，實例是用于說明本發明而不是對本發明的限制。本發明的范圍與核心內容依據權利要求書加以確定。

一、利用兔adscs(脂肪間充質干細胞)誘導分化分別構建成骨細胞膜片、成血管內皮細胞膜片及表征

(1)主要試劑

alarmarblue(上海，翊圣)，ascrobicacid(北京索萊寶生物科技有限公司)，directred80(美國sigma)，dmem/f-12、pbs、fbs(美國hyclone)。

(2)儀器與設備

infinitem200pro酶標儀(瑞士，nanoquan)，h-7650透射電子顯微鏡(日本，hitachi)，s-3400n掃描電子顯微鏡(日本，hitachi)，偏光顯微鏡dm2500p(德國，leica)，正置熒光顯微鏡bx-511250ccd(日本，olympus)，co2培養箱(heraeus公司，德國)。

(3)實驗方法

①成骨細胞膜片的制備

將增殖狀態良好的第四代adscs(脂肪間充質干細胞)常規用1％胰蛋白酶消化，至絕大部分細胞變圓，從瓶底脫落，然后用dmem/f12培養基終止消化。調整細胞密度至1×10⁶～3×10⁶個/cm²，接種于預先用1％明膠包被的培養皿中，加入含10～12％胎牛血清和1～1.5％雙抗(青霉素、鏈霉素)的dmem/f12培養基，置于37℃，5％co2恒溫培養箱中培養，24～48h后更換為成骨細胞誘導培養液(dmem/f12培養基170～180ml，胎牛血清17～22ml，雙抗(青霉素、鏈霉素)1.7～2.7ml，谷氨酰胺2～3ml，抗壞血酸550～580ul，β-甘油磷酸鈉2～3ml，地塞米松15～25ul)，隔日換液一次，觀察膜片的形成過程和形成情況，持續培養10～14天，皿底可見半透明乳白色薄膜樣物，膜內有多個白色大小不等的結節時，用細胞刮刀輕輕刮擦，使膜狀物與皿底分離，可獲得成骨細胞膜片。

②成血管內皮細胞膜片的制備

取第三代或第四代脂肪間充質干細胞按2×10⁶～4×10⁶個/cm²的密度接種于含10～12％胎牛血清和1～1.5％雙抗(青霉素、鏈霉素)的dmem/f12培養基中培養24～48h，后更換成血管內皮細胞誘導液(內皮細胞生長培養基(egm-2)90～110ml，胎牛血清4.5～5.5ml,維生素c0.09～0.11ml,慶大霉素-兩性霉素b(ga-1000)0.09～0.11ml,氫化可的松(hydrocortisone)0.036～0.044ml,人表皮生長因子(hegf)0.09～0.11ml,人成纖維細胞生長因子(hfgf-b)0.45～0.55ml,類胰島素一號增長因子(igf-i)0.09～0.11ml,血管內皮細胞生長因子(vegf)0.09～0.11ml)，觀察記錄細胞形態變化，隔2-3天換液。持續培養14天，可獲得內皮細胞膜片。

③細胞膜片的表征

將獲得的細胞膜片進行組織學、掃描電鏡、透射電鏡及特殊染色檢測。4％多聚甲醛固定膜片，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片厚度5μm，脫蠟至水，分別行h&e、alp染色、茜素紅和vonkossa組織學染色、膜片活性檢測等。h&e染色：切片置于蘇木素中浸染5min，鹽酸酒精中分色30秒，自來水沖洗，伊紅1min，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察膜片組織結構。vonkossa染色：滴染5％硝酸銀，日光或紫外光曝曬10min，蒸餾水洗滌，5％硫代硫酸鈉溶液滴染2min，蒸餾水漂洗，l％中性紅襯染10min，充分水洗，酒精系列脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。選取部分膜片，2％戊二醛4℃前固定2h后，換0.1m二甲砷酸鈉緩沖液三次，每隔2h換一次(4℃)，過夜，1％鋨酸4℃后固定2h，0.1m二甲砷酸鈉緩沖液沖洗兩次，每次15min，30％、50％、70％、80％、90％、100％酒精梯度脫水，分別行sem及tem檢測膜片表面形貌及內部超微結構。

④結果

結果顯示，成骨、成血管內皮細胞膜片均呈半透明，乳白色，可自皿底整片提起；鏡下觀察成骨、成血管內皮細胞膜片均似“薄紗樣”，二者膜片下均可見皿底貼附一層細胞，說明細胞膜片活性良好。he染色可見成骨、成血管內皮細胞膜片由復層細胞和豐富的細胞外基質構成，膜片兩側均分布有細胞。天狼猩紅飽和苦味酸染色，光鏡下可見大面積紅染，說明成骨、成血管內皮細胞主要表達膠原纖維。tem結果顯示,成骨細胞膜片，胞內胞外均可見“針狀”或“結節狀”鈣鹽結晶。內皮細胞膜片胞質內可見內皮細胞的特征結構w-p小體形成。sem結果顯示成骨細胞膜片細胞、基質相互交融，膜片表面有大量“蜂窩樣”礦化結節。膜片活性檢測結果顯示：成骨細胞膜片與內皮細胞膜片活性差異無統計學意義(t＝0.83，p>0.05)，說明進行用此方法獲得的成骨、成血管內皮細胞膜片具備一定活性，且二者活性一致。成骨細胞膜片特異性檢測von-kossa染色可見膜片被染成棕褐色，說明膜片存在礦化現象。內皮細胞膜片陽性表達cd31細胞表面分子，說明膜片內含有大量cd31+細胞。

二、雙細胞膜片構建無外源支架的血管化組織工程骨以及動物體內異位移植實驗

(1)主要試劑

速眠新ii注射液(吉林，圣達)，蘇3號注射液(吉林，圣達)，powerdryhetoll3000真空冷凍干燥機(美國thermofisher)，其余試劑均為分析純。

(2)儀器與設備

shz-d(iii)循環水式真空泵(鞏義，予華)。

(3)實驗方法

①雙細胞膜片(doublecellsheet,dcs)復合體構建血管化組織工程骨

將培養好的內皮細胞膜片輕輕用細胞刮刀刮起一側，使膜片與皿底完全分離，用鑷子夾起進行折疊，緩慢平鋪在另一培養皿所培養的折疊好的成骨細胞膜片上，靜置5min間斷滴加含10～12％胎牛血清和1～1.5％雙抗(青霉素、鏈霉素)的dmem/f12培養基，收獲dcs復合體。用細胞刮刀沿培養皿底部刮擦，使之脫離皿底，用鑷子緩慢將其折疊卷曲成類圓柱體。內皮細胞膜片在上，成骨細胞膜片在下記為膜片復合體a，為實驗組。單純成骨細胞膜片記為膜片復合體b，單純內皮細胞膜片記為膜片復合體c，為對照組。

②無外源支架血管化組織工程骨異位移植實驗

將36只裸鼠，隨機分為a組、b組、c組，于雙細胞膜片復合體裸鼠皮下植入術后8周和12周進行檢測(n＝6/組/時間點)。裸鼠皮下植入：將稀釋速眠新液按照0.1ml-0.2ml/20g肌肉注射麻醉，于背部做橫切口，皮下植入構建物。實驗組為膜片復合體a，對照組為膜片復合體b和膜片復合體c。

③表征

大體觀察：組織工程骨植入后觀察裸鼠生活狀態和切口愈合情況和移植物變化；取材前觀察真皮、周圍組織與移植物關系。組織學檢測：將取出的移植物分成兩份，一份使用2.5％戊二醛固定24h，sem樣品制備，觀察標本剖面結構。一份常規石蠟包埋，制作5μm連續切片，選取組織塊中心部位4張切片行he染色，并按照weidner等報道方法進行微血管計數，用spss20.0對結果進行統計分析；選取4張切片行masson染色，觀察纖維礦化狀況。

④結果

結果顯示，植入裸鼠皮下后，切口處未見組織紅腫、未見分泌物，縫合線10天左右自行脫落。取樣時可見植入物與周圍組織相連，表面被一層纖維膜覆蓋，扁橢圓形，色白，質韌。he染色結果顯示：第8周時，三組移植物中出現數量不等的微血管，dcs融合。可見膜片部分區域纖維聚集細胞豐富，部分區域組織致密細胞較少。第12周微血管數量明顯減少，組織更加致密，細胞數量減少，染色偏粉紅色。說明移植物隨時間延長血管數目先增多后減少，礦化度在增加。masson染色結果顯示：第8周，各組移植物均被染成藍綠色，說明組織主要表達新生膠原纖維。第12周可見移植物綠染區域中央出現紅染，其中a組效果最佳。說明細胞膜片植入后，膠原纖維發生礦化，逐漸成熟。sem結果顯示：第8周時，各組移植物主要以纖維化結構為主，纖維疏松，走行無規律，偶可見血管，肉眼未見明顯差異。第12周時，各組表現發生變化：a組組織呈現分層生長，層層排布緊密；b組可見組織完全融合，未見分層結構，可見無纖維分布的空缺部分；c組可見疏松的纖維內有大量血管走行，管腔內可見紅細胞。說明a組復合體逐漸發生礦化，類骨樣層狀生長，b組礦化進程更快。c組礦化過快，形成的大量無機礦物質集結后呈現無組織結構形態。經過weidner方法對組織切片進行微血管計數，結果顯示：第8周和12周時，c組與a、b組微血管數目差異均有統計學意義，而ab組均數之間比較，差異無統計學意義，說明單純內皮細胞膜片組(c組)具備成血管能力，并且明顯高于其他三組。該雙細胞膜片復合體構建的血管化組織工程骨具備良好的成骨、成血管性能。