本發明涉及有機合成和藥物化學領域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
背景技術：
肝纖維化是慢性肝損傷向肝硬化發展的動態過程，表現為細胞外基質(ECM)大量合成、分泌，而降解絕對或相對不足，使ECM在肝臟內彌漫沉積。其起始于肝細胞(HC)壞死，隨之是炎癥反應、纖維生成介質釋放，肝星狀細胞(FSC)激活，最終以肝臟結締組織成分的合成與降解明顯失去平衡。肝纖維化是多種慢性肝病共同的病理過程，是影響預后的重要因素。
過去的20年間，肝纖維化的研究取得了長足進展，證實肝纖維化與一定程度的肝硬化都是可逆的。近年來陸續出現了一些抗肝纖維化治療方法，包括化學藥、生物制劑、中藥與基因療法等，但是理想的臨床治療手段仍然缺乏(劉平.加強抗肝纖維化作用機制的研究.中華肝病雜志，2005,8(13)：561)。目前防治肝纖維的關鍵是針對與肝星狀細胞激活相關的環節，主要是：減輕肝損傷；抑制星狀細胞激活，減少細胞外基質產生；調節細胞因子紊亂，促進活化肝星狀細胞凋亡；抑制肝臟成纖維細胞的增殖以及星狀細胞激活大量分泌誘導肝臟成纖維細胞的增殖。
從天然產物中尋找化合物或先導化合物并進行結構修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價值。
本發明涉及的化合物I是一個2011年發表(Meng Shao et al.,2010.Psiguadials A and B,Two Novel Meroterpenoids with Unusual Skeletons from the Leaves of Psidium guajava.Organic Letters 12(2010)5040–5043)的化合物，我們對化合物I進行了結構修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗肝纖維化活性進行了評價，其具有抗肝纖維化活性。
由于肝臟星狀細胞的激活，從而引起了多種生長因子的大量分泌，這些生長因子會誘導肝臟成纖維細胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長因子之一就是TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細胞增殖的藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長因子誘導的成纖維細胞的增殖，篩選常常在成纖維細胞上進行，NIH/3T3細胞是最常用的細胞株。
技術實現要素：
本發明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質量百分數分別為20％和80％。
本發明公開的組合物可以制成藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體。
藥效學實驗表明，本發明的組合物具有較好的抗肝纖維化作用。本發明的藥學上可接受的鹽具有同樣的藥效。
進一步的，組合物的體外實驗表明，組合物具有很強的抗成纖維細胞增殖的活性，因此本發明的組合物有望被用于制備新型抗肝纖維化藥物。
進一步的，組合物的體外實驗表明，組合物具有很強的抗生長因子誘導的成纖維細胞增殖的活性，組合物是一個極具開發潛力的化合物,它可直接用于相應疾病的治療以及相關藥物的制備。
以下通過實施例對本發明作進一步詳細的說明，但本發明的保護范圍不受具體實施例的任何限制，而是由權利要求加以限定。
具體實施方式
實施例1 化合物Psiguadial A的制備
化合物Psiguadial A(I)的制備方法參照Meng Shao等人發表的文獻(Meng Shao et al.,2010.Psiguadials A and B,Two Novel Meroterpenoids with Unusual Skeletons from the Leaves of Psidium guajava.Organic Letters 12(2010)5040–5043)的方法。
實施例2 Psiguadial A的O-溴乙基衍生物(II)的合成
將化合物I(474mg，1.00mmol)溶于20mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.16g)，1,2-二溴乙烷(7.520g，40.00mmol)和12mL的50％氫氧化鈉溶液。混合物在35攝氏度攪拌8h。8h之后將反應液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機相溶液。然后對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產物粗品。產物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:0.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棕色粉末(502mg，73％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.44(s,2H),7.24(s,2H),7.20(d,J＝10.0Hz,3H),4.31(s,4H),3.89(s,1H),3.74(s,4H),2.30(s,1H),2.12(s,1H),2.02(s,1H),1.92(s,1H),1.79(s,1H),1.73(s,1H),1.51(d,J＝19.8Hz,3H),0.99(s,3H),0.95(d,J＝4.7Hz,7H),0.85(s,3H),0.53(s,1H),0.43(s,1H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ188.69(s),170.54(s),165.42(s),163.38(s),142.72(s),129.71(s),127.96(s),127.08(s),118.00(s),116.82(s),114.82(s),72.73(s),40.19(s),34.75(s),34.32(s),31.75(s),30.93(s),28.09(s),26.43(s),24.48(s),23.74(s),21.18(s),20.77(s),19.99(s),14.39(s).
HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for C34H41Br2O5:689.1300；found 689.1303.
實施例3 Psiguadial A的O-(苯并咪唑基)乙基衍生物(III)的合成
將化合物II(344mg，0.5mmol)溶于25mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(690mg，5.0mmol)，碘化鉀(168mg，1.0mmol)和苯并咪唑(4720mg，40mmol)，混合物加熱回流3h。反應結束后將反應液倒入20mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產物粗品。產物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:0.5，v/v)，收集黃色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物III的黃色粉末(289.6mg,76％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.45(s,2H),8.21(s,2H),7.62(d,J＝25.0Hz,4H),7.23(s,4H),7.22–7.14(m,5H),4.66(s,4H),4.45(s,4H),3.88(s,1H),2.11(s,1H),1.93(s,1H),1.89(s,1H),1.82(s,1H),1.71(d,J＝4.2Hz,1H),1.62(d,J＝26.0Hz,1H),1.54(s,1H),1.47(s,2H),1.18(s,1H),0.96(s,3H),0.95–0.71(m,9H),0.50(s,1H),0.25(s,1H).
13C NMR(125MHz,Common NMR Solvents)δ188.43(s),170.27(s),165.08(s),163.05(s),147.11(s),146.19(s),142.40(s),132.81(s),129.35(s),127.61(s),126.74(s),123.84(s),123.27(s),120.67(s),117.67(s),116.50(s),114.46(s),112.79(s),68.49(s),44.65(s),39.85(s),34.42(s),34.00(s),30.58(s),27.75(s),26.10(s),24.16(s),23.38(s),20.83(s),20.43(s),19.67(s),14.02(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C48H51N4O5:763.3859；found:763.3857。
實施例4 Psiguadial A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物(IV)的合成
1、Psiguadial A的O-(二羥乙胺)乙基衍生物的合成
將化合物II(344mg，0.5mmol)溶于18mL乙腈，加入無水碳酸鉀(0.345g，2.5mmol)，碘化鉀(0.084g，0.5mmol)和二乙醇胺(2.103g，20mmol)，混合物加熱回流2h。反應結束后將反應液倒入冷水中，用二氯甲烷萃取2次，合并有機相，依次用水和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑。產物用硅膠柱層析純化(石油醚/丙酮100:0.7，v/v)，得到Psiguadial A的O-(二羥乙胺)乙基衍生物的淡棕色固體(0.254g,69％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.45(s,2H),7.27(t,J＝15.0Hz,2H),7.21(t,J＝15.0Hz,2H),7.21(s,1H),4.04(s,4H),3.97(s,1H),3.39(s,8H),2.68(s,4H),2.54(s,8H),2.16(s,1H),2.01(s,1H),1.98–1.90(m,3H),1.68(s,1H),1.62(s,1H),1.45(s,2H),1.40(s,1H),1.12(s,4H),1.00(s,3H),0.93(s,6H),0.89(s,3H),0.52(s,1H),0.27(s,1H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ188.43(s),170.26(s),165.08(s),163.04(s),142.40(s),129.34(s),127.61(s),126.73(s),117.67(s),116.49(s),114.46(s),69.16(s),58.86(s),56.40(s),53.85(s),39.84(s),34.42(s),33.99(s),30.58(s),27.74(s),26.10(s),24.15(s),23.38(s),20.82(s),20.43(s),19.66(s),14.02(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C42H61N2O9:737.4377；found:737.4374。
2、Psiguadial A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物(IV)的合成
合成足夠多的Psiguadial A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物，將Psiguadial A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物(0.368g，0.5mmol)溶于4mL氯仿，逐滴加入氯化亞砜(2.38g，20mmol)，反應物加熱回流2h。將反應物冷卻至室溫，滴加甲醇分解過量的氯化亞砜，減壓濃縮除去溶劑。產物經硅膠柱層析純化(石油醚/丙酮100:0.5，v/v)，得到化合物IV的淡黃色固體(271.4mg，67％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.33(s,2H),7.09(t,J＝15.0Hz,5H),3.97(s,1H),3.92(s,4H),3.60(s,8H),2.74(s,2H),2.68(s,2H),2.61(d,J＝17.2Hz,4H),2.51(s,4H),2.08(s,1H),1.77(dd,J＝13.8,8.4Hz,4H),1.54(s,1H),1.30(d,J＝12.7Hz,3H),1.13(s,1H),0.86(s,3H),0.81(s,6H),0.75(s,3H),0.39(s,1H),0.11(s,1H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ205.87(s),197.63(s),194.85(s),189.66(s),134.68(s),119.48(s),114.43(s),83.84(s),75.99(s),66.29(s),62.15(s),59.77(s),59.54(s),55.66(s),53.29(s),52.49(s),50.35(s),44.63(s),39.08(d,J＝0.9Hz),36.02(s),30.20(d,J＝8.9Hz),28.18(s),24.69(s),23.50(d,J＝19.2Hz),22.16(s),17.61(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C42H57Cl4N2O5:811.2992；found:811.2988。
實施例5 組合物抗肝纖維化活性
由于肝臟星狀細胞的激活，從而引起了多種生長因子的大量分泌，這些生長因子會誘導肝臟成纖維細胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長因子之一就是TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細胞增殖的藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長因子誘導的成纖維細胞的增殖，篩選常常在成纖維細胞上進行，NIH/3T3細胞是最常用的細胞株。
組合物的制備：將研磨之后過200目網的20mg化合物III的粉末和研磨之后過200目網的80mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。
實驗例1：組合物對成纖維細胞NIH/3T3增殖的抑制作用
一、實驗方法：
NIH/3T3細胞株購自引自ATCC(American Type Culture Collection)的中科院上海細胞所細胞庫。
將對數生長期的亞融合的NIH/3T3細胞用0.25％胰酶消化，洗滌，離心后，用DMEM培養液(含10％FCS)制成1×104cell/ml的細胞懸液，臺盼藍染色鑒定存活率大于95％，按每孔100ul加入96孔板中，在37℃、5％CO2培養24h同步處理后，棄上清，加入含有藥物的DMEM培養液(含10％FCS)200ul，培養48h，每孔加入MTT溶液孵育4h。棄去培養液，加入150ulDMSO，振蕩10分鐘，使結晶溶解，酶標儀490nm處讀取OD值，結果以OD490表示。
二、實驗結果：
1、形態學觀察
NIH/3T3在用藥前伸展良好，折光性較弱，有方向性，呈放射狀，細胞增殖的速度快；而加組合物24h后，成纖維細胞數目減少，形狀變得不規則，突起變短，細胞排列混亂，細胞內代謝產物增多。化合物III和化合物IV無此作用。
MTT法檢測組合物對NIH/3T3細胞增殖的抑制作用。
表1：MTT法檢測組合物對NIH/3T3增殖的抑制作用
注：*，與細胞陰性對照P<0.05
結果：組合物在20ug/ml對成纖維細胞NIH/3T3的細胞增殖有顯著的抑制作用。表明組合物體外對成纖維細胞的增殖有顯著抑制作用。化合物III和化合物IV無此作用。
實驗例2：組合物對轉化生長因子-β1(TGF-β1)誘導的成纖維細胞增殖的抑制作用
TGF-β1是促進細胞增殖和膠原生成的強活性因子，在細胞中加入TGF-β110ng/ml刺激細胞增殖，再檢測藥物對TGF-β1誘導的細胞增殖的抑制作用，以分析判斷組合物的作用機理。
表2：MTT法檢測組合物對TGF誘導NIH/3T3增殖的抑制作用
注：*，與細胞+TGF對照P<0.05
結果：組合物在20ug/ml對成纖維細胞NIH/3T3在TGF-β1的誘導下的細胞增殖有顯著的抑制作用，化合物III和化合物IV無此作用。表明組合物體外對纖維細胞增殖的抑制作用可能是通過干預TGF信號通路實現的。
結論：組合物對成纖維細胞NIH/3T3在10％小牛血清的刺激下的細胞增殖有顯著的抑制作用；組合物對成纖維細胞NIH/3T3在TGF-β1的誘導下的細胞增殖有顯著的抑制作用。組合物可以用來制備抗肝纖維化藥物。化合物III和化合物IV對成纖維細胞NIH/3T3在10％小牛血清的刺激下的細胞增殖無顯著的抑制作用，對成纖維細胞NIH/3T3在TGF-β1的誘導下的細胞增殖無顯著的抑制作用，不可以用來制備抗肝纖維化藥物。
實施例6 本發明所涉及組合物片劑的制備
取2克組合物，加入制備片劑的常規輔料18克，混勻，常規壓片機制成100片。
實施例7 本發明所涉及組合物膠囊的制備
取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。