本發(fā)明屬于納米粒子應用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蘆丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸鈉復合納米粒子及其制備方法。

背景技術(shù)：

納米粒子通常是指粒徑小于1μm的固體顆粒。由于重力的原因，微米級顆粒難以分散并懸浮在液體體系中。而納米粒子具有良好的穩(wěn)定性，其懸浮液可以在長達三個月的時間內(nèi)保持穩(wěn)定。在腸道模型的測試中，100nm的納米粒子的吸收率是1-10μm的15-250倍，這是因為納米粒子可以穿透亞黏膜層而微球只能停留在表皮層上。因此，納米粒子相對于微米級的粒子在穩(wěn)定性和生理利用率方面具有明顯的優(yōu)勢。納米粒子的應用領(lǐng)域非常廣泛，可用于催化反應、電導材料、高色度染料、紡織服裝、強化材料以及包埋輸送活性物質(zhì)等等。其中輸送活性物質(zhì)是納米粒子最重要的用途之一，常用于包埋檢測物質(zhì)、藥物、營養(yǎng)物質(zhì)、食品添加劑等等。

用于制備納米粒子的材料有很多種。近年來的研究大都傾向于可降解的納米粒子材料，分為兩類：合成可降解材料和天然可降解材料。前者如聚α-氰基丙烯酸烷基酯、聚乙烯醇(PVA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)等；后者如蛋白、脂質(zhì)、多糖等生物大分子物質(zhì)。而天然可降解材料易于作為食品組分被消費者接受，并且易于大量獲得并具有良好的生物相容性，可包埋活性成分后用作新型食品添加劑。

玉米醇溶蛋白是玉米的主要貯藏蛋白是由四個主要部分組成：α-，β-，γ-和δ-玉米醇溶蛋白，其中α-玉米醇溶蛋白占整個蛋白質(zhì)的近85％。在玉米醇溶蛋白中50％以上的氨基酸殘基是疏水的，這使得它是能在60-90％乙醇溶液而不是水中被溶解的少數(shù)天然蛋白質(zhì)之一。這種特性使玉米醇溶蛋白作為天然生物納米粒子，用來包封，保護和釋放疏水性活性物質(zhì)、藥物，營養(yǎng)成分以及天然活性成分如葉黃素和槲皮素等。然而，在食品活性物質(zhì)遞送過程中使用玉米醇溶蛋白納米粒子可能不是最佳的，由于玉米醇溶蛋白是生物大分子且等電點在約pH 6.2。因此，在接近中性pH的玉米醇溶蛋白納米粒子失去pH穩(wěn)定性，從而導致粒子的聚集。

酪蛋白酸鈉是由幾個不同的酪蛋白(αs1，αs2，β，κ)可溶性混合物組成。酪蛋白酸鈉含有不同順序和比例的親水性和疏水性基團。酪蛋白酸鈉由于營養(yǎng)豐富，因而可當作食品營養(yǎng)強化劑使用。根據(jù)我國GB2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》規(guī)定，酪蛋白酸鈉可用于各類食品，按生產(chǎn)需要適量添加。目前酪蛋白酸鈉大量應用在肉制品、冰淇淋、餅干等食品的生產(chǎn)中。此外酪蛋白酸鈉的LD50>400-500g/kg體重(大鼠，經(jīng)口)，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織規(guī)定其ADI值不受限制，這表明酪蛋白酸鈉的食用安全性很高。

蘆丁又名蕓香苷，是由槲皮素C3位上的羥基和蕓香糖(-Glu-Rha)連接而成的雙糖苷，屬于黃酮類物質(zhì)中的葡萄糖糖苷。蘆丁具有抗氧化及抗自由基作用，可用于心腦血管疾病、腫瘤、炎癥等的治療。由于蘆丁不溶于水，使其在作為一種良好的新型抗自由基的食品添加劑添加至食品中時受到了很大的局限。傳統(tǒng)的將蘆丁包埋制成復合粒子的技術(shù)雖然解決了蘆丁的溶解度問題，但仍然存在以下問題：一、微球粒徑太大，難以分散并懸浮在液體體系中；二、合成可降解納米粒子材料不易被消費者接受；三、天然納米粒子材料中：脂質(zhì)由于其長鏈結(jié)構(gòu)不能很好的包埋活性成分；蛋白質(zhì)由于其較強的親水性需要添加化學交聯(lián)劑在蛋白和蛋白之間構(gòu)建共價鍵來防止納米粒子結(jié)構(gòu)的崩解，化學交聯(lián)劑大多有毒，殘留有交聯(lián)劑的蛋白納米粒子的安全性大大降低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了一種蘆丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸鈉復合納米粒子及其制備方法，由于蘆丁不溶于水，本發(fā)明采用反溶劑法，利用玉米醇溶蛋白和蘆丁在乙醇與水中的溶解度差異制備蘆丁—玉米醇溶蛋白納米粒子，并對其粒徑大小、顆粒形貌、帶電性以及復合納米粒子的抗氧化性等進行了分析，為蘆丁—玉米醇溶蛋白綜合利用開拓新的思路。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種蘆丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸鈉復合納米粒子，所述復合納米粒子以蘆丁為抗氧化劑，玉米醇溶蛋白為載體，酪蛋白酸鈉為穩(wěn)定劑，所述蘆丁與玉米醇溶蛋白的質(zhì)量比為0.05～0.2:1，所述玉米醇溶蛋白與酪蛋白酸鈉的質(zhì)量比為1:0.5～1:1.25。

進一步的：所述復合納米粒子粒徑分布在245nm-255nm之間，PDI在0.09-0.14之間均小于0.3，電位在-21—-28m V之間。

進一步的：所述納米粒子中蘆丁在水中的釋放曲線分為兩個階段：在第一階段的3h內(nèi)，蘆丁釋放量迅速增加到10-23％；在第二階3-12h里，蘆丁的釋放比例相對緩慢提高到23-40％。

本發(fā)明還提供了所述的蘆丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸鈉復合納米粒子的制備方法，它包括以下步驟：

(1)將蘆丁、玉米醇溶蛋白溶于乙醇-水溶液；

(2)向步驟(1)中混合溶液加入酪蛋白酸鈉溶液；

(3)將步驟(2)的混合液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，經(jīng)離心除去不溶物，之后冷凍干燥，得到粉狀物為所述蘆丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸鈉復合納米粒子。

進一步的：所述步驟(1)中乙醇-水溶液中乙醇的濃度為60％～90％。

進一步的：所述步驟(2)中酪蛋白酸鈉溶液的質(zhì)量比濃度為1％～2.5％。

進一步的：所述步驟(3)中混合液在45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10min。

進一步的：所述步驟(3)中經(jīng)4000rpm離心10min；冷凍干燥24h。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和技術(shù)效果是：本發(fā)明以蘆丁為抗氧化劑，玉米醇溶蛋白為載體，酪蛋白酸鈉為穩(wěn)定劑，利用反溶劑法制備蘆丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸鈉復合(CN-ZR)納米粒子。采用激光粒度儀、傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀(FTIR)等儀器對蘆丁納米玉米醇溶蛋白顆粒表征結(jié)構(gòu)進行分析，并對其得率，包埋率、緩釋率以及抗氧化性進行了測定。結(jié)果表明，玉米醇溶蛋白納米粒子對蘆丁有良好的包埋效果，且具有較小的粒徑，在溶液中分布均勻；SEM圖片顯示，CN-ZR納米粒子呈球形，顆粒大小分布均勻；傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀(FTIR)分析表明該納米粒子分子內(nèi)部羥基作用有所增加；且制備的納米粒子具有一定的緩釋比例和較強的抗氧化性。

附圖說明

圖1是蘆丁標準曲線。

圖2是納米粒子的掃描電鏡圖片；其中，A和B：玉米醇溶蛋白納米粒子；C和D：酪蛋白酸鈉-玉米醇溶蛋白納米粒子(二者質(zhì)量比1:l)；E和F：含有蘆丁的酪蛋白酸鈉-玉米醇溶蛋白納米粒子(酪蛋白酸鈉與玉米醇溶蛋白質(zhì)量比為1:l，蘆丁與玉米醇溶蛋白質(zhì)量比0.1:1。

圖3為納米粒子的紅外光譜圖；其中A：蘆丁；B：酪蛋白酸鈉-玉米醇溶蛋白納米粒子；C-F：載有蘆丁的酪蛋白酸鈉-玉米醇溶蛋白納米粒子(蘆丁與玉米醇溶蛋白質(zhì)量比分別為C：0.05:1；D：0.1:1，E：0.15:1，F(xiàn)：0.2:1。

圖4是蘆丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸鈉復合(CN-ZR)納米粒子中蘆丁的累積釋放曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細的描述。

本發(fā)明所用的材料和儀器如下：

1、材料

乙醇、硫酸：萊陽市康德化工有限公司；DPPH、ABTS：美國Sigma-Aldrich公司；磷酸鉀、K₂S₂O₈、鉬酸銨：天津巴斯夫化工有限公司；所有的試劑均為分析純。

玉米醇溶蛋白(zein)：食品級，上海瑞勇生物科技有限公司；酪蛋白酸鈉(NaCas)：食品級，上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；蘆丁：食品級，國藥集團化學試劑有限公司。

2、實驗儀器

AR224CN電子天平：奧豪斯儀器(上海)有限公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海愛朗儀器有限公司；TU-1810DASPC紫外分光光度計：北京普析通用有限公司；CR-400色彩色差計：日本柯尼卡美能達公司；IS10型傅里葉紅外變換光譜分析儀：美國Nicolet公司；FD8–3a凍干機：美國SIM；79-1磁力加熱攪拌器：上海雙捷實驗設(shè)備有限公司；DD5M低速大容量離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；Nano-ZS電位及納米粒徑儀：英國Malvern公司。實驗室常規(guī)玻璃儀器若干。

3、數(shù)據(jù)處理

所有樣品至少平行測試三次，取平均值。使用SPSS17.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，并表示為平均值±標準差。在95％的顯著水平(p＜0.05)范圍內(nèi)分析顯著性。

實施例1

一、蘆丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸鈉復合納米粒子(CN-ZR納米粒子)的制備及得率、粒徑、Z-電位、PDI與包埋率特性

1、CN-ZR納米粒子的制備方法

采用反溶劑法制備CN-ZR納米粒子，步驟如下：

(1)將0.1g蘆丁和1.0g玉米醇溶蛋白溶于20mL的乙醇-水溶液，乙醇-水溶液中乙醇的體積比濃度為60％～90％。

(2)然后向步驟(1)的混合液中快速加入50mL酪蛋白酸鈉溶液。酪蛋白酸鈉溶液的質(zhì)量比濃度為1％-2.5％。

(3)將步驟(2)得到的混合液在45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10min，經(jīng)4000rpm離心10min除去少量不溶物，之后冷凍干燥24h。得到的凍干粉狀樣品儲藏于4℃下待測。

2、得率

溶液經(jīng)過冷凍干燥后得到粉末狀納米粒子樣品稱重后用于計算得率。

式中：

m₁：是制備中加入樣品的質(zhì)量(g)；

m₂：冷凍干燥后收集的樣品質(zhì)量(g)。

3、納米粒子粒徑的測定

用動態(tài)光散射測定納米粒子在溶液狀態(tài)下的粒徑。首先取凍干后的樣品，配制質(zhì)量比0.1～0.5％的溶液并在室溫下超聲處理5min，用移液槍取1mL溶液，沿比色皿邊緣一角緩緩注入后，放入測試臺中測試，每個樣品分別測試三次，取平均值。

4、納米粒子Z-電位與PDI的測定

用動態(tài)光散射測定納米粒子在溶液狀態(tài)下的表面zeta電位。取凍干后的樣品，配制質(zhì)量比0.1～0.5％的溶液并在室溫下超聲處理5min后，用移液槍取適量溶液，從比色皿一孔迅速注入，放入測試臺中測試，每個樣品分別測試三次，取平均值。

5、包埋率

由于CN-ZR納米粒子不溶于無水乙醇，凍干后的樣品中游離的蘆丁由無水乙醇萃取后測定。準確稱取凍干后樣品10mg，加入1mL無水乙醇，充分震蕩并在10000rpm下離心5min，取出上清。反復三次后將萃取液通過紫外分光光度計法，在蘆丁特征吸收峰—波長510nm下測定吸光值，并按照圖1的蘆丁標準曲線計算得到游離蘆丁含量，包埋率＝(加入的蘆丁總量-游離蘆丁的量)/蘆丁總量*100％。

二、復合納米粒子中酪蛋白酸鈉濃度的影響

將1.0g玉米醇溶蛋白溶于20mL的80％的乙醇-水溶液，快速加入50mL質(zhì)量比為0％、1％、1.5％、2％和2.5％的酪蛋白酸鈉溶液。將此混合液在45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10min，經(jīng)4000rpm離心10min除去少量不溶物，之后冷凍干燥24h。得到的凍干粉狀樣品儲藏于4℃下待測。實驗結(jié)果如表1所示。

將0.1g蘆丁和1.0g玉米醇溶蛋白溶于20mL的80％的乙醇-水溶液，快速加入50mL質(zhì)量比為0％、1％、1.5％、2％和2.5％的酪蛋白酸鈉溶液。將此混合液在45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10min，經(jīng)4000rpm離心10min除去少量不溶物，之后冷凍干燥24h。得到的凍干粉狀樣品儲藏于4℃下待測。實驗結(jié)果如表1所示。

表1不同濃度的酪蛋白酸鈉對納米粒子的形成及蘆丁包埋的影響

同列相同字母表示在p<0.05水平上差異不顯著

復溶能力是納米粒子一項關(guān)鍵性質(zhì)，在生產(chǎn)、儲藏、運輸及使用過程中十分重要。未添加NaCas的納米粒子在凍干后無法復溶。當NaCas溶液濃度為1％時，復溶后的納米粒子懸浮在溶液中，沒有可見的沉淀物且溶液呈現(xiàn)玉米醇溶蛋白的淡黃色。但隨著濃度的增加，由于更多的NaCas吸附在zein納米粒子表面，會逐漸呈現(xiàn)出NaCas的乳白色。

從表1可知，未添加蘆丁時，隨著NaCas濃度從0％增加到2％，納米粒子的粒徑從285nm下降到252nm，粒徑下降明顯，有顯著性不同(P<0.05)，PDI穩(wěn)定在0.14-0.17之間，電位穩(wěn)定在－23mV與－26mV之間，得率從51.23％增加到77.28％。這個結(jié)果說明NaCas作為穩(wěn)定劑，由于其靜電穩(wěn)定作用以及空間位阻作用，在混合液中與玉米醇溶蛋白分子有一定的相互作用，隨著NaCas濃度的增加，在反溶劑混合、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以及離心過程中能夠減少沉淀的生成，并能抑制納米粒子粒徑的增大。但當NaCas濃度增加到2.5％時納米粒子性質(zhì)變化不大，粒徑從252nm到248nm，電位－23mV到－25mV，PDI為0.11，得率從77.28％增大至78.75％，除電位有顯著性變化，其他指標均無顯著性差異(p<0.05)，是由于酪蛋白酸鈉濃度繼續(xù)增加時，酪蛋白酸鈉本身帶有負電荷，而酪蛋白酸鈉與玉米醇溶蛋白之間相互作用接近飽和，因此其他指標變化不大，僅有電位出現(xiàn)顯著性差異。曾有文獻利用殼聚糖和羧甲基殼聚糖作為穩(wěn)定劑，通過反溶劑制備玉米醇溶蛋白納米粒子，復溶后粒徑范圍分別為211-811nm及205-732nm。與其相比本發(fā)明的復合納米粒子的粒徑較小，且在溶液中分散更均勻，從而說明NaCas在控制粒徑方面比殼聚糖和羧甲基殼聚糖具有更明顯的優(yōu)勢。

納米粒子的包埋能力是其作為輸送系統(tǒng)的一個重要指標。蘆丁作為被包埋的活性成分添加到NaCas-zein納米粒子中，其中蘆丁與zein的質(zhì)量比為0.1:1。由表1可以看出不同NaCas濃度的添加蘆丁的復合納米粒子的性質(zhì)。粒徑、PDI、電位及得率均表現(xiàn)出與未添加蘆丁的復合納米粒子相似的趨勢，粒徑從267nm下降到246nm，PDI穩(wěn)定在0.09-0.16，電位維持在－23-－25mV之間。由表1可知，NaCas的濃度對包埋率也有明顯的影響，當NaCas濃度從0％增加到2％時，復合納米粒子對蘆丁的包埋率從77.26％增加至88.11％。但當NaCas添加濃度繼續(xù)增加到2.5％時，復合納米粒子包埋率為89.52％，并無顯著性差異(p<0.05)。因此接下來的實驗NaCas添加濃度均為2％。

三、乙醇濃度的影響

將0.1g蘆丁和1.0g玉米醇溶蛋白分別溶于20mL的60％、70％、80％和90％的乙醇-水溶液，快速加入50mL 2％的酪蛋白酸鈉溶液。將此混合液在45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10min，經(jīng)4000rpm離心10min除去少量不溶物，之后冷凍干燥24h。得到的凍干粉狀樣品儲藏于4℃下待測。實驗結(jié)果如表2所示。

表2不同濃度的乙醇對納米粒子的形成及蘆丁包埋的影響

注：同列相同字母表示在p<0.05水平上差異不顯著

從表2中可以看出無水乙醇體積分數(shù)對復合納米粒子性質(zhì)的影響。隨著乙醇濃度的增加，復合納米粒子的粒徑逐漸減小，當乙醇濃度增加到80％時，粒徑大小從264nm減小到248nm，是由于乙醇濃度越大玉米醇溶蛋白和蘆丁溶解越充分，在混合體系中分散越均勻，從而形成納米粒子的粒徑也會相對減小。乙醇濃度從60％增加到80％時，電位穩(wěn)定在－24mV到－25mV，PDI也相對穩(wěn)定在0.11-0.12。但當乙醇濃度繼續(xù)增加到90％時，粒徑從248nm減小到245nm，變化不大，并無顯著性差異(p<0.05)，PDI也無顯著性差異(p<0.05)，僅有電位從-25變化到-28，略有增加并出現(xiàn)顯著性差異(p<0.05)，是由于酪蛋白酸鈉在高濃度乙醇中充分溶解，并附著在納米粒子表面，使復合納米粒子負電荷增加。

從表2中還可以看出，隨著乙醇濃度的增加，得率和包埋率均呈現(xiàn)增大趨勢，當乙醇濃度增大到80％時，得率從76.70％增大至84.25％，包埋率從80.78％增大至88.11％。是由于乙醇濃度增加使蘆丁和玉米醇溶蛋白在混合體系中分散更加均勻，形成納米粒子更加穩(wěn)定，因此在反溶劑混合、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和離心過程中損失減少，因此得率增大。而蘆丁溶解度增加也使得更多的蘆丁和玉米醇溶蛋白—酪蛋白酸鈉混合體系之間形成一定的相互作用，從而使包埋率增大。當乙醇濃度繼續(xù)增加至90％時，得率變化不大，增大至86.61％，并無顯著性差異(p<0.05)，但包埋率增加至91.56％，有顯著性差異(p<0.05)。因此從粒徑，電位，得率等綜合考慮，接下來的實驗乙醇濃度均為80％。

四、蘆丁添加量的影響

分別將0g、0.05g、0.1、0.15和0.2g的蘆丁和1.0g玉米醇溶蛋白溶于20mL80％的乙醇-水溶液中，快速加入50mL2％的酪蛋白酸鈉溶液。樣品分別標記為CN-ZR0、CN-ZR0.5、CN-ZR1、CN-ZR1.5和CN-ZR2。將此混合液在45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10min，經(jīng)4000rpm離心10min除去少量不溶物，之后冷凍干燥24h。得到的凍干粉狀樣品儲藏于4℃下待測。實驗結(jié)果如表3所示。

表3蘆丁添加量對納米粒子的形成及蘆丁包埋的影響

注：相同字母表示在p<0.05水平上差異不顯著

添加不同蘆丁含量的納米粒子CN-ZR0，CN-ZR0.5，CN-ZR1，CN-ZR1.5和CN-ZR2的特征如表3所示。幾乎所有的復合納米粒子均有較小的粒徑大小、較均勻的分布和良好的靜電穩(wěn)定性：粒徑分布在245nm-255nm之間，PDI在0.09-0.14之間均小于0.3，電位在-21—-28m V之間。如表3所示，CN-ZR0.5相對于CN-ZR0具有較小的粒徑，這是由于小分子物質(zhì)影響了大分子聚集過程中的結(jié)晶狀態(tài)：蘆丁分子和NaCas—zein納米粒子之間具有一定的交聯(lián)作用，類似大分子間的塑化劑。低添加量的蘆丁能使zein納米粒子的聚集結(jié)構(gòu)更均一穩(wěn)定，從而形成的復合納米粒子的粒徑相對減小。隨著蘆丁添加量的增加，CN-ZR納米粒子的粒徑大小從245nm增加到255nm，PDI穩(wěn)定在0.09-0.14之間。

從表3可以看出在利用反溶劑法制備CN-ZR納米粒子的過程中，蘆丁和NaCas—zein納米粒子之間發(fā)生疏水相互作用并參與了玉米醇溶蛋白納米粒子的自組裝過程中，不僅吸附在納米粒子的表面，還有一部分的蘆丁分子被玉米醇溶蛋白包裹在納米粒子的內(nèi)部。從表3可以得出隨著蘆丁添加量的增加，CN-ZR納米粒子的得率在77.38-84.42％之間，這說明在通過反溶劑法制備CN-ZR納米粒子的整個過程中大顆粒分子和沉淀的生成得到了有效的抑制。當蘆丁與玉米醇溶蛋白的質(zhì)量比從0.05:1增加到0.2:1時，NaCas—zein納米粒子對蘆丁的包埋率從68.37增加至90.63％。而相比蘆丁，玉米醇溶蛋白顆粒荷載氟尿嘧啶和芰皂素時包封率分別為6.9－68％和1.8－21％。玉米醇溶蛋白顆粒對維生素D₃的包封率可達到52-88％，但僅限于維生素D₃與玉米醇溶蛋白比為0.075時，遠低于本發(fā)明中的荷載量。有文獻采用噴霧干燥法制備了荷載百里香酚的玉米醇溶蛋白顆粒，其包封率不到30％。因此本發(fā)明中NaCas-zein納米粒子成功的包埋了蘆丁。

實施例2、CN-ZR納米粒子的SEM掃描電鏡、紅外譜圖、顏色、緩慢釋放能力和抗氧化能力測定

一、納米粒子的外觀形態(tài)SEM

利用電子掃描顯微鏡來觀察納米顆粒的外觀形態(tài)。首先配制質(zhì)量比0.1～0.5％的納米粒子溶液，室溫下超聲處理5min后，將金屬箔放入溶液中浸染上后拿出放入載物臺上，并迅速凍干以進行觀察。結(jié)果如圖2所示。由圖2A、B可見，未添加酪蛋白酸鈉和蘆丁的玉米醇溶蛋白納米粒子呈現(xiàn)均勻的球形，粒徑均一(左右)，而添加了酪蛋白酸鈉后，納米粒子部分集聚，出現(xiàn)粒徑較小的顆粒，粒徑均值下降為直徑253nm左右(如圖2C和D所示)。再進一步添加蘆丁后，顆粒聚集加劇，出現(xiàn)更小的粒子，而平均粒徑進一步下降為左右(如圖2E和F所示)。由前述可知，酪蛋白酸鈉附著在玉米醇溶蛋白納米粒子表面，包埋有蘆丁，因而得到了一種帶有負電荷，具有復溶能力和穩(wěn)定性的新型球狀納米粒子。

二、納米粒子FT-IR分析

納米顆粒FT-IR的試驗步驟如下：將溴化鉀放入105℃烘箱中烘烤24h以徹底除去水分，然后按樣品和溴化鉀1：100(m/m)量壓片測試掃描，掃描范圍為400～4000cm^-1。

實驗結(jié)果如圖3所示。圖3中C-F為CN-ZR納米粒子的紅外譜圖，在CN-ZR納米粒子的紅外譜圖中，3423.73cm^-1處的吸收峰應該是屬于玉米醇溶蛋白納米粒子-OH的伸縮振動；添加不同量的蘆丁后，O-H…O的伸縮振動吸收峰有向低波移動的趨勢，當蘆丁與玉米醇溶蛋白的質(zhì)量比從0.05:1增加到0.2:1時，-OH伸縮振動吸收峰3442.78cm^-1移動至3423.78cm^-1，變化19cm^-1。由此可知，CN-ZR納米粒子與玉米淀粉之間存在著較為強烈的分子間氫鍵等相互作用，這些相互作用使混合組分中各組分之間具有良好的相容性。

三、納米粒子表面顏色評價

采用色度計進行測量(CR400，大阪，日本)。儀器經(jīng)自檢及零點、白板校正后，將探頭垂直的置于呈有CN-ZR納米粒子的薄膜上進行測量，樣品與探頭之間不能有空隙，每個樣品測定三次。其中，色彩參數(shù)范圍從L＝0(黑色)至L＝100(白色)，-a(綠色)到+a(紅)和-b(藍色)到+b(黃色)。根據(jù)自動比較樣板與樣品之間的顏色差異計算總色差ΔE。

式中：

L₀，L_s：分別為標準和樣品的亮度值；

a₀，a_s：分別為標準和樣品的紅綠值；

b₀，b_s：分別為標準和樣品的黃藍值。

表4及表5為酪蛋白酸鈉添加量及蘆丁添加量對納米粒子顏色值的影響。

表4不同濃度的NaCas對復合納米粒子顏色值的影響

注：相同字母表示在p<0.05水平上差異不顯著

表5蘆丁添加量對復合納米粒子顏色值的影響

注：相同字母表示在p<0.05水平上差異不顯著

表4所示的是NaCas濃度對復合納米粒子的明度差(L*黑白)、色度差(a*紅綠色和b*黃藍色)和總色差(△E*)的影響。由表4可以看出未添加NaCas的zein納米粒子的色度L*為88.90，色度最小。隨著NaCas濃度增加至2.5％時，色度從88.90增加至91.62，說明NaCas的加入增加量復合納米粒子的亮度。從表4可知，zein納米粒子中加入NaCas，明顯減小了復合粒子的b*值，從16.86減小至12.79，這說明復合粒子的顏色隨著NaCas濃度的增加黃色逐漸變淡。而總色差△E*隨著NaCas濃度增加至2.5％時，從17.50減小至13.45，有顯著性差異(p<0.05)。這可能是由于NaCas濃度的增加使得更多的NaCas分子吸附在zein納米粒子表面，遮蓋了zein的黃色并逐漸呈現(xiàn)出NaCas的乳白色。不同濃度的NaCas對添加蘆丁的zein納米粒子的明度差(L*)、色度差(a*和b*)和總色差(△E*)的影響如表4所示，均表現(xiàn)出與未添加蘆丁的zein納米粒子相似的趨勢。

而蘆丁本身是一種淡黃色至草黃色粉末，添加量不同會對zein納米粒子的明度差(L*)、色度差(a*和b*)和總色差(△E*)的產(chǎn)生一定的影響，如表5所示。當蘆丁與玉米醇溶蛋白的質(zhì)量比從0.05:1增加到0.2:1時，復合納米粒子的色度L*從90.30減小至83.88，b*值從13.27增加至17.54，總色差△E*從14.00增大至19.85。這可能是由于蘆丁添加量的增加，本身呈現(xiàn)黃色的玉米醇溶蛋白納米粒子的黃色加深，b*值增大，降低了復合納米粒子的明度L*，總色差△E*也出現(xiàn)顯著性差異(p<0.05)。

四、緩慢釋放能力的測定

準確稱取50mg各CN-ZR納米粒子粉末樣品，并溶于10mL蒸餾水中。將得到的CN-ZR納米粒子溶液轉(zhuǎn)移至透析袋(截留分子量8—14kDa)中，并將透析袋放入盛有90mL蒸餾水的燒杯中。在25℃下不斷攪拌，使得透析袋內(nèi)外液體能充分的交換。并在0，1，2，3，5，7，9和12小時各取出3mL溶液在510nm下測定吸光值，按圖1中蘆丁標準曲線計算蘆丁含量，并繪制釋放曲線。

CN-ZR納米粒子中蘆丁在水中的釋放曲線如圖4所示。釋放曲線可分為兩個階段：初始快速釋放階段以及之后的緩慢釋放階段。在第一階段的3h內(nèi)，蘆丁釋放量迅速增加到10-23％。這可能由于是附著在復合納米粒子表面的蘆丁分子迅速釋放到水中。在第二階3-12h里，蘆丁的釋放比例相對緩慢提高到23-40％。在這個階段是由于鑲嵌在復合納米粒子內(nèi)部的蘆丁分子緩慢遷移到表面并釋放在水中。

隨著蘆丁添加量的增多，納米粒子這在兩個釋放階段的釋放比例均有所增加。這是由于此時納米粒子吸水導致納米粒子表面吸附的部分蘆丁遷移并釋放后會在納米粒子結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)一定的空隙和路徑，使得鑲嵌包埋在內(nèi)部的蘆丁有空隙和路徑向外遷移并釋放出來。從圖4同時可以看到在蘆丁與玉米醇溶蛋白的質(zhì)量比從0.05:1增加到0.2:1時，其之間的差異并不顯著。這是由于蘆丁添加量的增加導致納米粒子的粒徑變大，導致其與溶液的接觸表面積變小。在大豆蛋白微球釋放核黃素的研究中，1小時后核黃素釋放率達到50％；在酪蛋白酸鈉微球緩釋研究中，在15min時釋放比例已經(jīng)達到90％，與其相比zein納米粒子具有相對較強的緩釋能力。這是因為zein比大豆蛋白和酪蛋白酸鈉具有更強的疏水性，在中性的水溶液中不會發(fā)生吸水溶脹的現(xiàn)象，使得zein納米粒子可以較長時間的保持穩(wěn)定，且結(jié)構(gòu)不會變得松散或崩塌。與zein納米粒子包埋的其他活性成分，例如5-氟尿嘧啶相比，蘆丁溶解度和親水性低，因此釋放蘆丁的時間較為長久。

五、抗氧化能力的測定

(1)DPPH法

DPPH法用于測定DPPH自由基清除能力。DPPH自由基(二苯代苦味酰基自由基)是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其孤對電子于波長517nm附近有強吸收(顯深紫色)。

準確稱取10mg所述納米粒子粉末樣品，加入5mL蒸餾水并在室溫下超聲處理5min。配置40mg/L的DPPH乙醇溶液，避光攪拌。將1mL樣品溶液與2mL DPPH溶液混合并震蕩，常溫避光儲存30min，在517nm處測定吸光度值A(chǔ)1。同時將1mL蒸餾水與2mL DPPH溶液混合并震蕩，常溫避光儲存30min，在517nm處測定吸光度值A(chǔ)0。所有測定均平行進行3次，最終結(jié)果取平均值。納米粒子的自由基清除能力通過如下公式計算：

式中：

A₀：蒸餾水與DPPH混合后的吸光度值；

A₁：樣品與DPPH混合后的吸光度。

(2)ABTS法

ABTS法用于測定ABTS自由基的清除能力。準確稱取8mg所述納米粒子粉末樣品，加入10mL蒸餾水并在室溫下超聲處理5min。ABTS自由基是由7mmol/L ABTS和2.45mmol/L過硫酸鉀混合反應生成，在室溫、避光條件下靜置12h。使用前，用乙醇稀釋該溶液，使其在734nm處吸光值為0.700±0.025。清除自由基的活性測定是通過0.2mL的樣品溶液與1mLABTS微量工作液混合。準確測量6min后吸光值的減少量。所有測定均平行進行3次，最終結(jié)果取平均值。ABTS清除率的計算公式如下

式中：

A0：對照的吸光度；

A1：樣品的吸光度。

(3)磷鉬法測定樣品的總抗氧化活性。

準確稱取8mg所述納米粒子粉末樣品，加入10mL蒸餾水并在室溫下超聲處理5min。磷鉬試劑是0.6mol/L的硫酸，28mmol/L磷酸鈉，和4mM鉬酸銨的混合液。取0.1mL的樣品溶液加入1mL磷鉬試劑，混勻，混合液于95℃水浴條件下保持90min。冷卻至室溫，在695nm下測定吸光度值。所有測定均平行進行3次，最終結(jié)果取平均值。以蒸餾水為空白，吸光度值越大，表明將氧化能力越強。實驗結(jié)果如表6所示。

表6納米粒子的抗氧化能力

注：同列相同字母表示在p<0.05水平上差異不顯著

CN-ZR納米粒子的抗氧化能力通過DPPH自由基清除能力，ABTS自由基清除能力和總抗氧化能力表示，見表6。DPPH是一種顯色且穩(wěn)定的自由基，常用于測定樣品清除自由基的能力。CN-ZR0的DPPH清除率、ABTS自由基清除率和總抗氧化能力分別為22.29％，24.27％，0.256，這主要是因為玉米醇溶蛋白分子本身具有一定的抗氧化能力。隨著蘆丁添加量的增加，DPPH清除率、ABTS自由基清除率和總抗氧化能力分別提高到52.77％，71.17％，0.404。由此可以看出，包埋后的蘆丁仍具有一定的抗氧化性，是由于附著在納米粒子表面的蘆丁或是鑲嵌在納米粒子內(nèi)部的蘆丁分子緩慢遷移到表面表現(xiàn)出的抗氧化性。由于CN-ZR納米粒子中的蘆丁會緩慢遷移至納米粒子表面，因此CN-ZR納米粒子具有長效的抗氧化能力。

以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護的技術(shù)方案的精神和范圍。