本發明涉及納米生物醫學技術領域，尤其涉及一種復合物及其應用。

背景技術：

影像引導放射治療是一種四維的放射治療技術，它在三維放射治療的基礎上加入了時序的概念，可從定位、計劃到治療實施和驗證等方面創造各種解決方案。患者進行治療前、治療中利用各種先進的影像設備對腫瘤及正常器官進行實時的監控，并根據器官位置的變化調整治療條件，做到精確治療。通過實時成像去監控藥物的輸運情況，從時間及空間上去控制治療是當前實施精準醫學，個性化治療發展的迫切需求。

然而現有的成像引導治療存在許多不足，如在成像過程中，藥物受成像發射光的影響，隨之釋放，以及啟動光動力治療。這樣就會導致不能在真正的病灶處進行藥物釋放及實施光動力治療，并對身體產生嚴重的影響。現有技術在成像過程中雖然選擇了較低的激發功率，盡管功率很低，仍可以啟動治療，從而造成不必要的損傷。現有技術難以達到在成像監控的過程中，完全不啟動治療，當監控藥物大量富集到達病灶部位時，再啟動光控治療的效果。因此，建立真正可實時成像監測，在時間、空間上同時可控釋放的載藥平臺尤為關鍵。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種復合物及其制備方法，本發明提供的復合物能夠實現在時間和空間上同時可控釋放藥物。

本發明提供了一種復合物，由上轉換納米顆粒和光響應藥物復合而成；

所述上轉換納米顆粒的基質具有式I所示的原子比：

MReF_n 式I；

式I中，M為Na、Ba或K，Re為Y或Gd，n為4或5；

所述上轉換納米顆粒的摻雜稀土離子為：Yb³⁺、Er³⁺、Ho³⁺和Tm³⁺中的一種或幾種；

所述光響應藥物由光控分子和臨床藥物制備得到；

所述光控分子選自香豆素類化合物、硝基苯類化合物、偶氮類化合物或苯甲酰甲基酯類化合物。

優選的，所述上轉換納米顆粒的基質為NaYF₄、BaYF₅、KYF₄或NaGdF₄。

優選的，所述上轉換納米顆粒的摻雜稀土離子為Er³⁺、Yb³⁺和Tm³⁺中的一種或幾種。

優選的，所述上轉換納米顆粒為核殼結構的上轉換納米顆粒。

優選的，所述上轉換納米顆粒為NaYF₄:Er@NaYF₄@Yb,Tm@NaYF₄。

優選的，所述香豆素類化合物為氨基、羥基、羧基或酯基修飾的4-甲基香豆素衍生物。

優選的，所述硝基苯類化合物具有式II結構：

式II中，R為羥基、羧基或酯基。

優選的，所述對羥基苯甲酮類化合物具有式III結構：

式III中，LG為光解離去基團。

優選的，所述偶氮類化合物為偶氮苯及其衍生物。

本發明提供了一種上述技術方案所述的復合物在制備藥物中的應用。

與現有技術相比，本發明中的復合物采用特殊成分的上轉化納米顆粒，這種上轉化納米顆粒為受激光調控、發射光可轉變的納米粒子；同時，本發明采用與上轉化納米顆粒發射峰有交疊的可剪切的光敏分子作為光控分子，通過上轉換納米顆粒與光控分子的相互配合，能夠使這種復合物實現采用不同的發光源分別控制實時成像和藥物釋放的效果，本發明提供的這種復合物能夠將成像波段與光控治療波段分開，實現藥物在時間和空間上的同時可控，可作為治療腫瘤的藥物從而達到實時成像引導治療手段的目的。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據提供的附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發明實施例1制備得到的上轉換納米顆粒的掃描電子顯微鏡照片；

圖2為本發明實施例2制備得到的上轉換納米顆粒的掃描電子顯微鏡照片；

圖3為本發明實施例2制備的上轉換納米顆粒不同波長激發下的熒光發射光譜；

圖4為紫杉醇光響應藥物的制備的流程圖；

圖5為阿霉素光響應藥物的制備的流程圖；

圖6為本發明實施例測試得到的藥物釋放曲線；

圖7為本發明實施例測試得到的熒光成像圖片結果；

圖8為本發明實施例測試得到的腫瘤治療效果圖。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

本發明提供了一種復合物，由上轉換納米顆粒和光響應藥物復合而成；

所述上轉換納米顆粒的基質具有式I所示的原子比：

MReF_n 式I；

式I中，M為Na、Ba或K，Re為Y或Gd，n為4或5；

所述上轉換納米顆粒的摻雜稀土離子為：Yb³⁺、Er³⁺、Ho³⁺和Tm³⁺中的一種或幾種；

所述光響應藥物由光控分子和臨床藥物制備得到；

所述光控分子選自香豆素類化合物、硝基苯類化合物、偶氮類化合物或苯甲酰甲基酯類化合物。

在本發明中，所述上轉化納米顆粒為一種基于多波長近紅外光激發，發射光可變的上轉換納米粒子，這種上轉化納米顆粒受激發光調控，發射光可轉變。在本發明中，所述上轉換納米顆粒包括基質和摻雜稀土離子，所述基質為MReF_n，其中M為Na、Ba或K；Re為Y或Gd；n為4或5。在本發明中，所述基質優選為NaYF₄、BaYF₅、KYF₄或NaGdF₄。在本發明中，所述摻雜稀土離子為Yb³⁺、Er³⁺、Ho³⁺和Tm³⁺中的一種或幾種，優選為Er³⁺；Yb³⁺和Er³⁺；或Tm³⁺。在本發明中，對于Er的發光中心所述基質在上轉換納米顆粒中的摩爾含量優選為20～100％，更優選為40～80％，更優選為50～60％，最優選25％。在本發明中，所述上轉化納米顆粒的粒徑優選為10～80nm，更優選為20～40nm，最優選為25～35nm。

在本發明中，所述上轉換納米顆粒可以為核殼結構的上轉換納米顆粒，可以為核殼型分區摻雜的上轉換納米顆粒，如雙層殼結構或多層殼結構。在本發明中，所述上轉換納米顆粒優選為NaYF₄:Er、NaErF₄:Er、NaYF₄:Yb,Er或NaYF4:Er@NaYF₄@Yb,Tm@NaYF₄。在本發明中，所述NaYF₄:Er和NaErF₄:Er為裸核結構上轉換納米顆粒，基質為NaYF₄和NaErF₄，摻雜稀土離子為Er³⁺，其中基質與摻雜稀土離子的摩爾比優選為3:1。在本發明中，所述NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@Yb,Tm@NaYF₄為核殼結構的上轉換納米顆粒，核成分為NaYF₄:Yb,Er，第一層殼成分為NaYF₄，第二層殼成分為Yb,Tm，第三層殼成分為NaYF₄。本發明對所述核、第一層殼、第二層殼和第三層殼的摩爾比沒有特殊的限制可以為任何比例，優選為1：3：4：8。在本發明中，所述核成分中基質和摻雜稀土離子的摩爾比優選小于3：1。在本發明中，所述第二層殼中Yb和Tm的摩爾比優選為(20-99.8)：(0.3-1％)，更優選為99.5:0.5。

本發明對所述上轉換納米顆粒的來源沒有特殊的限制，采用本領域技術人員熟知的上述基質和摻雜稀土離子的上轉化納米顆粒即可，可按照本領域技術人員熟知的上轉化納米顆粒的制備方法制備得到。

在本發明中，所述光響應藥物由光控分子和臨床藥物制備得到。在本發明中，所述光控分子為與上轉化納米顆粒發射峰有交疊的可剪切的光敏分子，優選為與上轉化納米顆粒藍紫光發射峰有交疊的可剪切的光敏分子。在本發明中，所述光控分子為香豆素類化合物，硝基苯類化合物、偶氮類化合物或苯甲酰甲基酯類化合物。在本發明中，所述香豆素類化合物優選為氨基、羥基、羧基或酯基修飾的4-甲基香豆素衍生物，更優選為7-氨基-4-甲基香豆素。在本發明中，所述硝基苯類化合物優選具有式II結構：

式II中，R為羥基、羧基或酯基，所述硝基苯類化合物更優選為鄰硝基苯甲醇。在本發明中，所述對羥基苯甲酰類化合物優選具有式III結構：

式III中，LG為光解離去基團。

在本發明中，所述對羥基苯甲酰類化合物更優選為對羥基苯甲酰磷酸酯。在本發明中，所述偶氮類化合物優選為偶氮苯及其衍生物，更優選為偶氮苯。

本發明對所述臨床藥物沒有特殊的限制，采用本領域技術人員熟知的臨床常用藥物即可，可以為消炎類藥物、抗腫瘤類藥物等，優選為抗腫瘤類藥物，更優選為紫杉醇類抗腫瘤藥物、鉑類抗腫瘤藥物、5氟尿嘧啶類抗腫瘤藥物、阿霉素或苯丁酸氮芥類表面可修飾功能基團的抗腫瘤藥物，最優選為表面可修飾功能化的抗癌藥紫杉醇、阿霉素或苯丁酸氮芥。在本發明中，所述抗腫瘤物質還可以為抗腫瘤化合物的衍生物，所述衍生物優選為抗腫瘤化合物的羧基衍生物或碳酸酯衍生物。

在本發明中，所述光控分子和臨床藥物的摩爾比優選為(0.5～1.5):1，更優選為(0.8～1.2)：1，最優選為1：1。

本發明對所述光響應藥物的制備方法沒有特殊的限制，采用本領域技術人員熟知的光控分子和藥物復合的方法制備得到即可，如將光控分子和臨床藥物進行縮合反應即可制備得到光響應藥物。

在本發明中，所述復合物由上轉換納米顆粒和光響應藥物復合而成，可以通過上轉換納米顆粒和光響應藥物偶聯得到，利用上轉換納米顆粒表面共價、配位或吸附光響應藥物。在本發明中，所述上轉換納米顆粒和光響應藥物的摩爾比優選為(5～15)：1，更優選為(8～12)：1，最優選為10：1。

在本發明中，所述復合物的制備方法可以為：

將上轉換納米顆粒進行表面修飾后與光響應藥物進行載藥即可得到復合物。

在本發明中，可以將光響應藥物通過化學偶聯、配位或吸附的方法接枝到經過修飾的上轉化納米顆表面。在本發明中，將上轉換納米顆粒進行表面修飾的方法優選為：

將上轉換納米顆粒溶解于酸中。

在本發明中，所述酸優選為鹽酸。在本發明中，優選將上轉換納米顆粒溶解于酸中調節pH值為3～5，更優選調節pH值為4。在本發明中，所述溶解的時間優選為10～20小時，更優選為12～18小時。在本發明中，將上轉換納米顆粒溶解于酸中可去除其表面的油酸配體。本發明優選將溶解于酸中的上轉換納米顆粒取出后進行離心處理，得到經過表面修飾的上轉換納米顆粒。在本發明中，經過表面修飾的上轉換納米顆粒可直接與光響應藥物配位相連或經過生物相容性良好的其他配體間接偶聯進行復合。

本發明優選將光響應藥物通過化學反應連接到經過修飾的上轉換納米顆粒表面，具體方法為：

將表面經過修飾的上轉換納米顆粒和光響應藥物在溶劑中進行反應，得到復合物。

在本發明中，所述溶劑優選為四氫呋喃。在本發明中，所述反應的溫度優選為室溫，更優選為20～30℃，最優選為25℃。在本發明中，所述反應的時間優選為10～15小時，更優選為12～13小時。

在本發明中，所述反應完成后，本發明優選將反應體系進行分離提取，以去除未反應的光響應藥物。在本發明中，所述分離提取的方法優選為離心。

在本發明中，上述技術方案所述的復合物可作為藥物應用，尤其適用于作為抗腫瘤藥物。本發明提供的復合物作為藥物能夠實現實時監測成像引導及可選擇光控制藥物釋放。本發明提供的復合物采用發射光可轉變的上轉換納米顆粒與光響應藥物偶聯，得到可選擇光控釋放型載藥納米粒子，通過高效能量傳遞，控制藥物釋放，達到高效的光控治療效果。本發明可調控上轉換納米顆粒的激發波長產生不同波段的發射光，從而調諧與光控載藥分子的作用，可精確的控制藥物的釋放，實現一種激發光源進行實時成像，其他激發光源進行可光控釋放藥物的目的，應用于實時成像引導的精準光控藥物治療方法。

本發明提供的復合物作為抗腫瘤藥物進行應用優選將其分散后通過靜脈注射或瘤內直接注射方式作用于腫瘤部位，選擇波長分別進行成像與控制釋放藥物，用近紅外光照射釋放時間1～15分鐘，以進行時時成像監測引導治療。在本發明中，優選采用生理鹽水或PBS溶劑進行分散。

本發明優選對上述復合物制備的藥物在波長范圍為700～2000nm的激光下照射；更優選在波長為792nm、802nm和1500nm的激光下進行成像，980nm的激光照射下進行光控釋藥；最優選在802nm的激光照射下進行成像，980nm激光照射下進行光控治療。本發明提供的復合物作為藥物其中的上轉換納米顆粒在980nm短時間的照射條件下，可以高效釋放藥物，而800nm左右的激發光對藥物釋放完全沒有影響，相對傳統單一發射模式，顯現出明顯的可控治療優勢，因此在臨床治療方面有著廣闊的治療前景。本發明提供的復合物作為藥物結合成像手段能夠對腫瘤(或其他病變部位)進行精準有效的定位，實施準確殺傷作用。同時這種復合物還可以修飾靶分子應用于靶向熒光成像與靶向治療；結合Gd基質作為MRI成像；Yb,Lu或Gd等元素的摻入，可以作為CT成像試劑。

本發明采用具有發射光可控制的多色上轉換納米粒子，通過響應外部“生物窗口”波長范圍內的近紅外光的刺激分別發射具有成像功能及治療功能的上轉換熒光。本發明利用在上轉換納米粒子表面共價、配位或吸附光控載藥分子，提高能量傳遞效率，從而提高藥物釋放產率，提高療效；將上轉換成像波段與光控治療波段分開，實現時間空間同時可控，從而實現實時成像及成像引導的治療，達到對疾病的有效治療，最低限度的傷害，最終提高病人的預后。

本發明以下實施例所用原料均為市售商品。

實施例1NaYF₄:Er的制備

分別稱取氯化釔YCl₃·6H₂O 227.3毫克、氯化鉺ErCl₃·6H₂O 95.3毫克，放入50毫升三口瓶中，加入4毫升油酸和17毫升1-十八(碳)烯。除氧半小時，隨后加熱升溫溶解上述物質，待各物質完全溶解后，停止加熱并冷卻至室溫，并向其中加入溶有0.1g氫氧化鈉和0.1482克氟化銨的甲醇溶液，之后升溫到65℃，待甲醇除凈后，升溫到300℃并保持1.5小時進行反應。待反應結束后，將得到的反應產物降至室溫，用丙酮和乙醇分別離心，得到NaYF₄:Yb,Er上轉換納米顆粒，溶于4毫升環己烷中待用。

對本發明實施例1制備得到的上轉換納米顆粒進行掃描電子顯微鏡檢測，檢測結果如圖1所示，圖1為本發明實施例1制備得到的上轉換納米顆粒的掃描電子顯微鏡照片；由圖1可以看出，本發明實施例1制備得到的上轉換納米顆粒的粒徑為20nm。

實施例2NaYF₄:Er@NaYF₄@Yb,Tm@NaYF₄的制備

取氯化釔YCl₃·6H₂O 60.7毫克，放入50毫升三口瓶中，加入3毫升油酸和7.5毫升1-十八(碳)烯。攪拌除氧半小時之后，加熱升溫，待氯化釔溶解后，停止加熱，冷卻至室溫，加入溶有25毫克氫氧化鈉和37毫克氟化銨的甲醇溶液，之后升溫到60℃并保持半小時。之后加入實施例1制備得到的上轉換納米粒子80℃保持45分鐘。隨后升溫到300℃并保持1.5小時。重復以上合成步驟進行第二殼層包覆，取氯化鐿YbCl₃·6H₂O 385.0毫克、氯化銩TmCl₃·6H₂O 1.9毫克。再次重復NaYF₄殼層包覆步驟及用量，最終得到核殼的多色發光的NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@Yb,Tm@NaYF₄上轉換納米顆粒。

對本發明實施例2制備得到的上轉換納米顆粒進行掃描電子顯微鏡檢測，檢測結果如圖2所示，圖2為本發明實施例2制備得到的上轉換納米顆粒的掃描電子顯微鏡照片；由圖2可以看出，本發明實施例2制備得到的上轉換納米顆粒尺寸均一為納米粒子，而非混合不同材料的樣品，其粒徑為40nm。

檢測本發明實施例2制備得到的上轉換納米顆粒不同波長激發下的熒光發射圖譜，檢測方法為：

將實施例2中所得的上轉換納米粒子，溶于8mL環己烷中，取100μL溶液，稀釋10倍進行光譜測量。分別以980nm和800nm激光器進行光照，并采集光譜。

檢測結果如圖3所示，圖3為本發明實施例2制備的上轉換納米顆粒不同波長激發下的熒光發射光譜，由圖3可知，本發明提供的這種納米粒子可以在800nm與980nm激發光下，發射不同波長的上轉換光譜，實現選擇激發，光譜可調的光子上轉換發光。

實施例3紫杉醇光響應藥物的制備

按照文獻J.Am.Chem.Soc.2012,134,5052-5055公開的方法采用7-氨基-4-甲基香豆素作為光控分子、紫杉醇為藥物按照圖4所述的流程制備得到紫杉醇光響應藥物，圖4為紫杉醇光響應藥物的制備的流程圖。

實施例4阿霉素光響應藥物的制備

按照文獻small 2015,11,No.45,6078–6090公開的方法，通過圖5中3號化合物與對硝基苯基氯甲酸酯制備得到光控分子，以阿霉素(DOX)為藥物，按照圖5所示的流程制備得到阿霉素光響應藥物，圖5為阿霉素光響應藥物的制備的流程圖。

實施例5復合物的制備

將實施例2制備得到的上轉換納米顆粒10毫克溶于pH＝4鹽酸中，反應6小時，去除表面油酸配體，經三次離心，將所得沉淀復溶于四氫呋喃中備用，得到表面修飾后的上轉換納米顆粒。

將上述制備得到的表面修飾后的上轉換納米顆粒加入到實施例3制備得到的紫杉醇的光響應藥物中，在室溫反應12小時，離心提純得到紫杉醇的光控藥物復合物。

實施例6復合物的制備

將實施例2制備得到的上轉換納米顆粒10毫克溶于pH＝4鹽酸中，反應6小時，去除表面油酸配體，經三次離心，將所得沉淀復溶于四氫呋喃中備用，得到表面修飾后的上轉換納米顆粒。

按照下方法對實施例4制備的阿霉素光響應藥物進行脫保護基團處理，具體過程為：

將實施例4制備得到的阿霉素光響應藥物加入到二氯甲烷中，加入過量的三氟乙酸，反應5小時，進行脫保護。隨后，旋蒸除去溶劑及三氟乙酸，藥品烘干備用。

將上述制備得到的表面修飾后的上轉換納米顆粒加入到脫掉保護基團(Boc)后的阿霉素光響應藥物中，在室溫反應12小時，離心提純得到阿霉素的光控藥物分子光控藥物復合物。

實施例7

將本發明實施例5制備得到的復合物溶于PBS溶液中10mg/mL，進行選擇波段光控藥物釋放及成像原理性檢測，具體方法為：

選擇波段光控藥物釋放：將上述實施例4制備得到的復合物分成二組于1厘米的熒光池中，分別以980nm與800nm的激光器對樣品進行光照。照射15分鐘后抽取相同體積(100μL)進行離心，取上清進行高效液相分析。

檢測結果為，本發明實施例5制備得到的復合物經808nm激光器照射沒有藥物釋放，其可進行細胞熒光成像，熒光成像圖片如圖7所示，圖7為本發明實施例測試得到的熒光成像圖片結果；經980nm激光照射可進行光控釋放藥物，得到如圖6所示的藥物釋放曲線，圖6為本發明實施例測試得到的藥物釋放曲線。因此，本發明提供的復合物能夠進行成像與治療的可調控選擇。

實施例8

將本發明實施例5制備得到復合物采用水溶性介質生理鹽水分散劑進行分散后，質量濃度為200μg/mL，注射到荷瘤鼠的腫瘤部位，采用下述方法進行選擇波段進行成像與釋藥檢測：

將腫瘤尺寸均勻荷瘤小鼠進行分組，分成4組，分別為注射實施例5制得的復合物+800nm光照組a，注射實施例5制得的復合物+980nm光照組b，及實施例5制得的復合物不光照組c以及注射生理鹽水對照組，光照組每只鼠光照30分鐘，每5分鐘間隔2分鐘，治療7天，隨后取腫瘤進行觀察。

檢測結果如圖8所示，圖8為本發明實施例測試得到的腫瘤治療效果圖，由圖8可知，與對照組相比，用980nm功率為0.25～2.5W/cm²近紅外光照射30分鐘，可實現小鼠的光控釋放藥物抑制腫瘤，用808nm功率為0.25～2.5W/cm²近紅外光照射，沒有抑制腫瘤作用，使其可以進行實時成像監控成像的目的。

由以上實施例可知，本發明提供了一種復合物，由上轉換納米顆粒和光響應藥物復合而成；所述上轉換納米顆粒的基質具有式I所示的原子比：MReF_n式I；式I中，M為Na、Ba或K，Re為Y或Gd，n為4或5；所述上轉換納米顆粒的摻雜稀土離子為：Yb³⁺、Er³⁺、Ho³⁺和Tm³⁺中的一種或幾種；所述光響應藥物由光控分子和抗腫瘤物質制備得到；所述光控分子選自香豆素類化合物、硝基苯類化合物、偶氮類化合物或苯甲酰甲基酯類化合物。與現有技術相比，本發明提供的這種復合物能夠將成像波段與光控治療波段分開，實現藥物在時間和空間上的同時可控，可作為治療腫瘤的藥物從而達到實時成像引導治療手段的目的。

以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護范圍內。