本發明涉及一種中藥技術領域，且特別涉及一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物及其制備方法。

背景技術：

小兒病毒性心肌炎是小兒疾病中發病率較高的一種，是由多種病毒感染所致心肌損害引起的心肌局限性或彌漫性炎性病變。各年齡均可發病，尤以3歲以上的小兒多見，發病無季節性，輕重各異，病程長短不一。由于病毒性心肌炎的發病機制尚不完全清楚，因此，目前西醫尚無特效治療方法，臨床多采用心肌細胞營養劑、抗病毒藥物及免疫抑制劑等對癥治療。

在中醫領域，本病屬胸痹、心悸、怔忡、溫病等范疇，中醫認為心氣虛則鼓動無力，血脈瘀阻；心陰虛則心脈失養而致病，臨床上以“虛、滯、瘀”的表現多見。正氣不足、邪毒侵心是導致病毒性心肌炎發生的重要因素。而氣陰兩虛是本病發生的內在因素。外感邪毒則是誘發或加重本病的外在因素。氣陰兩虛極易感受溫熱邪毒，邪毒內侵勢必耗傷氣陰。然而在中醫治療中，多數組方用藥復雜，以“毒瘀互結，氣陰兩虛”為重點的藥物較少，同時此類藥物一般為湯劑，不便于兒童服用。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，此中藥組合物具有解毒活血、益氣養陰的作用，特別適用毒瘀互結，氣陰兩虛證的患者兒童。

本發明的另一目的在于提供一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物的制備方法，該制備方法簡單易行，利于工業化生產，制備出來的中藥組合物便于小兒服用。

本發明解決其技術問題是采用以下技術方案來實現的。

本發明提出一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數計，原料包括：黃芪15～50份，麥冬10～30份，板藍根10～30份，丹參10～30份，及甘草5～10份。

本發明提出一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物的制備方法，其包括：用原料7～9倍重量的水煎煮原料1～3次，每次1～1.5小時，得到提取液，將提取液濃縮至在60℃時相對密度為1.05～1.20的濃縮液，將濃縮液與藥用輔料混合。

本發明實施例提供的一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物及其制備方法的有益效果是：該中藥組合物遵循中醫學的配伍規律及“君臣佐使”的組方規律。以“解毒活血、益氣養陰”為主。對于治療毒瘀互結，氣陰兩虛證的患者兒童有顯著療效。其中黃芪、麥冬為君，黃芪補心氣之虧虛，麥冬養陰生津，臣以丹參活血化瘀，佐以板藍根清熱解毒，使以甘草調和諸藥，補脾益氣復脈。其次，該組合物的藥味少，藥性強，且藥效專，治療小兒病毒性心肌炎具有針對性。

該中藥組合物的制備方法，主要以煎煮和濃縮為主，簡單易行，可操作性強。

具體實施方式

為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。

下面對本發明實施例提供的一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物及其制備方法進行具體說明。

本發明實施例提供的一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數計，原料包括：黃芪15～50份，麥冬10～30份，板藍根10～30份，丹參10～30份，及甘草5～10份。

優選地，按重量份數計，黃芪為30份，麥冬為20份，板藍根為20份，丹參為20份，及甘草為10份。

該中藥組合物以“解毒活血、益氣養陰”為主。對于治療毒瘀互結，氣陰兩虛證的患者兒童有顯著療效。其中黃芪、麥冬為君，黃芪補心氣之虧虛，麥冬養陰生津，臣以丹參活血化瘀，佐以板藍根清熱解毒，使以甘草調和諸藥，補脾益氣復脈。

具體地，小兒病毒性心肌炎是由病毒感染引起的以局限性或彌漫性心肌炎性病變為主的疾病，其親心性的特點導致了心肌炎的發生，體現了其“損傷臟腑功能”之特性。與中醫毒邪“內損、暴烈、頑固、危重”之特性相切合。早期毒傷心絡，傷心體損心用，致氣陰兩虛，氣陰兩虛為本，邪毒侵襲為標，此期標實為主；中期由毒致瘀，由瘀化毒，加重氣陰虧虛，以瘀為主，虛實標本夾雜；至后期病情遷延氣陰兩虛明顯，由虛生瘀，瘀久生毒，毒瘀互結，且反復感受外毒，本虛為主，兼夾毒瘀。因此選用補氣與補陰藥黃芪、麥冬為君藥，黃芪補心氣之虧虛，麥冬養陰生津。臣以丹參活血化瘀。再次，輔以清熱解毒藥板藍根祛毒邪。最后使以甘草調和諸藥，補脾益氣復脈。

優選地，黃芪選用炙黃芪，其中炙黃芪有潤燥、補中益氣的功效。甘草選用炙甘草。

進一步地，在本發明較佳實施例中，按重量份數計，原料還包括：黨參10～50份，山藥10～50份，及葛根10～50份。

黨參補脾肺氣，補血，生津。常用于氣虛不能生血，血虛無以化氣。與黃芪配伍，可增強補氣補血的效果。山藥，既補氣，又養陰，與黃芪、麥冬配伍，增強臣藥的作用。葛根，解肌退熱，生津止渴。

進一步地，在本發明較佳實施例中，原料還包括太子參為10～30份，西洋參為5～20份，與白術為10～30份中的至少一種。太子參、西洋參與白術皆為補氣藥，選用三者中的至少一種，可以增強組方補氣的作用。其中，太子參能生津潤肺，西洋參能清熱生津，白術能燥濕利水，增強組合物“清毒、散毒、通毒”的能力。

優選地，按重量份數計，原料包括黃芪50份，麥冬20份，板藍根15份，丹參20份，甘草10份，黨參30份，太子參30份，葛根30份，山藥20份，西洋參10份，及白術30份。

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物的制備方法，其包括：用原料7～9倍重量的水煎煮原料1～3次，每次1～1.5小時，得到提取液，將提取液濃縮至在60℃時相對密度為1.05～1.20的濃縮液，即濃縮液的相對密度為1.05～1.20(60℃)，優選地，為了提高提取率，得到更多的藥物有效活性成分，濃縮提取液的步驟進行兩次，將提取液第一次濃縮至在60℃時相對密度為1.06～1.12的濃縮液，第二次濃縮是在第一次濃縮得到的濃縮液(即在60℃時相對密度為1.06～1.12)中加入第一次濃縮得到的濃縮液1～3倍量的乙醇，靜置20～24h，過濾，得到乙醇與濾液。

其中濾液的處理方式有兩種，一種是將濾液濃縮至在60℃時相對密度為1.10～1.12的濃縮液，將進行過一次或進行過兩次的濃縮液干燥、與藥用輔料混合，制成中藥組合物的丸劑、顆粒劑、片劑或膠囊劑。另一種是將濾液與藥用輔料混合得到中藥組合物的口服液。在乙醇中靜置后，藥用活性成分會繼續析出。其中，藥用輔料可選用矯味劑、粘合劑、潤滑劑與崩解劑中的任意一種或幾種。進一步地，調節口服液的pH值至4.0～6.0，得到中藥組合物的合劑。該制備方法操作簡單，流程清楚，同時可制備出多種劑型，供患者選用。

以下結合實施例對本發明的特征和性能作進一步的詳細描述。

實施例1

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數計，原料包括：炙黃芪30份，麥冬20份，板藍根20份，丹參20份，及炙甘草10份。

該中藥組合物的制備方法為：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小時，濾過，收集提取液，將提取液濃縮成相對密度為1.10(60℃)的濃縮液，濃縮液噴霧干燥(進風溫度180℃，出風溫度100℃)得到干浸膏粉，干浸膏粉中加入適量蔗糖，以乙醇做粘合劑，制粒，干燥，整粒，裝袋，即得中藥組合物的顆粒劑。

實施例2

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數計，原料包括：炙黃芪30份，麥冬15份，板藍根15份，丹參20份，及炙甘草8份。

該中藥組合物的制備方法為：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小時，濾過，收集提取液，將提取液濃縮至相對密度為1.06(60℃)的濃縮液，之后濃縮液中加入等量乙醇攪拌均勻，靜置24小時，濾過，回收乙醇至無醇味，在濾液中加入單糖漿、山梨酸鉀，搖勻，濾過，灌裝，滅菌，即得中藥組合物的口服液。

實施例3

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數計，原料包括：炙黃芪40份，麥冬15份，板藍根15份，丹參20份，炙甘草8份，黨參20份，太子參20份，葛根24份，及山藥30份。

該中藥組合物的制備方法為：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小時，濾過，收集提取液，將提取液進行第一次濃縮，得到相對密度為1.07(60℃)的第一濃縮液，接著第一濃縮液中加入3倍量乙醇攪勻，靜置24小時，濾過，回收乙醇并進行第二次濃縮，得到相對密度為1.10(60℃)的第二濃縮液，第二濃縮液噴霧干燥(進風溫度180℃，出風溫度100℃)后得到干浸膏粉，干浸膏粉加入適量微晶纖維素，以乙醇做粘合劑，制粒，干燥，整粒，裝入2號膠囊，即得中藥組合物的膠囊劑。

實施例4

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數計，原料包括：黃芪50份，麥冬20份，板藍根15份，丹參20份，甘草10份，黨參30份，太子參30份，葛根30份，山藥20份，西洋參10份，及白術30份。

該中藥組合物的制備方法為：先將上述西洋參、太子參、丹參、山藥混合，粉碎成120目的粉末，備用；用水煎煮黃芪、麥冬、板藍根、甘草、黨參、葛根與白術3次，每次加黃芪、麥冬、板藍根、甘草、黨參、葛根與白術總重量9倍的水煎煮1.0小時，濾過，收集提取液，將提取液濃縮成相對密度為1.20(60℃)的濃縮液，加入上述備用粉末及適量煉蜜，混合均勻，制丸條，分粒，搓圓，即得中藥組合物的丸劑。

實施例5

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數計，原料包括：黃芪30份，麥冬20份，板藍根20份，丹參20份，甘草8份，黨參30份，葛根30份，及山藥20份。

該中藥組合物的制備方法為：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小時，濾過，收集提取液，將提取液進行第一次濃縮，得到相對密度為1.07(60℃)的第一濃縮液，第一濃縮液中加入3倍量乙醇攪勻，靜置20小時，濾過，濾液回收乙醇并進行第二次濃縮，得到相對密度為1.12(60℃)的第二濃縮液，將第二濃縮液噴霧干燥(進風溫度180℃，出風溫度100℃)后加入適量微晶纖維素，以乙醇做粘合劑，制粒，干燥，整粒，加入15份硬脂酸鎂，混勻，壓片，即得中藥組合物的片劑。

實施例6

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數計，原料包括：炙黃芪30份，麥冬20份，板藍根20份，丹參20份，及炙甘草10份。

該中藥組合物的制備方法為：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小時，濾過，收集提取液，將提取液濃縮成相對密度為1.05(60℃)的濃縮液，靜置，濾過，加入5份阿司帕坦，10份山梨酸鉀，攪勻，用濃度為10％氫氧化鈉溶液調節pH值為4.0，濾過，灌裝，滅菌，即得中藥組合物的合劑。

實施例7

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數計，原料包括：炙黃芪15份，麥冬10份，板藍根10份，丹參10份，炙甘草5份，黨參10份，葛根10份，山藥10份，及西洋參5份。

該中藥組合物的制備方法為：用水煎煮上述原料2次，每次加原料7倍重量的水，第一次1.5h，第二次1h，濾過，收集提取液，將提取液進行第一次濃縮，得到相對密度為1.07(60℃)的第一濃縮液，接著第一濃縮液中加入2倍量乙醇攪勻，靜置22小時，濾過，回收乙醇并進行第二次濃縮，得到相對密度為1.11(60℃)的第二濃縮液，將第二濃縮液噴霧干燥(進風溫度180℃，出風溫度100℃)，加入適量微晶纖維素，以乙醇做粘合劑，制粒，干燥，整粒，加入15g硬脂酸鎂，混勻，壓片，即得中藥組合物的片劑。

實施例8

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數計，原料包括：炙黃芪50份，麥冬30份，板藍根30份，丹參30份，炙甘草10份，黨參50份，葛根50份，山藥50份，西洋參20份，及白術30份。

該中藥組合物的制備方法為：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小時，濾過，收集提取液，將提取液濃縮成相對密度為1.05(60℃)的濃縮液，靜置，濾過，加入5份阿司帕坦，10份山梨酸鉀，攪勻，用濃度為10％氫氧化鈉溶液調節pH值為6.0，濾過，灌裝，滅菌，即得中藥組合物的合劑。

實施例9

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數計，原料包括：黃芪20份，麥冬18份，板藍根12份，丹參18份，甘草7份，黨參15份，太子參10份，葛根15份，山藥15份，及白術10份。

該中藥組合物的制備方法為：用原料8倍重量的水煎煮上述原料3次，第一次1小時，第二次40min，第三次20min，合并濾液，得到中藥組合物的湯劑。

對比例1

玉丹榮心丸，由玉竹、炙甘草、五味子、丹參、降香、山楂、蓼大青葉、苦參組成，由上海玉丹藥業廠生產，1.5g/丸，36丸/盒。國藥準字：Z10970095。

試驗例一 中藥組合物對EAM模型大鼠治療作用的觀察

1材料與方法

1.1實驗動物

雄性健康SPF級Lewis大鼠60只，6～7周齡，體重180～210g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2實驗材料

1.2.1實驗用藥

中藥組合物，根據實施例6制成，由山東中醫藥大學附屬醫院制劑室生產，100ml/瓶，1ml含生藥1g；

玉丹榮心丸，由上海玉丹藥業廠生產，1.5g/丸，36丸/盒。國藥準字：Z10970095。

1.3實驗方法

1.3.1抗原制備

無菌條件下，用濃度為0.01mmol/L的PBS緩沖液將豬心肌肌球蛋白先稀釋為l0mg/ml濃度的溶液。后用無菌的兩支玻璃注射器分別抽取等體積的上述稀釋溶液及完全弗氏佐劑(含有結核分枝桿菌10mg/ml)。再取一段經滅菌的塑料管連接兩支玻璃注射器，使注射器中的兩種溶液充分混合成油包水乳濁液。混合成功的標準：取1杯冰水，將1滴經混合后的豬心肌肌球蛋白乳濁液滴入，如呈球形并完全不分散即為混合成功。

1.3.2造模及分組

60只SPF級雄性Lewis大鼠按隨機數字表分為2組：正常對照組10只，模型組50只。將50只模型組大鼠造模，方法如下：用豬心肌肌球蛋白和弗氏完全佐劑的混合液0.2ml/只(合計豬心肌肌球蛋白2mg/只)，于實驗第1天、第8天雙后肢足墊區皮下注射，造模成功后將50只大鼠隨機分成5組：EAM模型組，中藥組合物大、中、小劑量組，玉丹榮心丸組，每組10只。給正常對照組大鼠于實驗第1天、第8天雙后肢足墊區皮下注射PBS緩沖液0.2ml/只；中藥組合物大、中、小劑量組及玉丹榮心丸組大鼠，于造模后半小時開始給藥。

1.3.3藥物制備及給藥

將中藥組合物臨用前進行稀釋，大劑量每毫升相當于生藥0.975g，中劑量每毫升相當于生藥0.63g，小劑量每毫升相當于生藥0.325g。玉丹榮心丸臨用時配成每毫升0.25g混懸溶液，4℃冰箱保存。中藥組合物大劑量組、中劑量組、小劑量組每日分別給予中藥組合物大劑量、中劑量、小劑量1ml/100g；玉丹榮心丸組每日給玉丹榮心丸混懸溶液1ml/100g；正常對照組和EAM模型組每日均給予蒸餾水1ml/100g，均采用灌胃法給藥，日一次，連續給藥21天。

1.3.4一般情況觀察

觀察大鼠食欲、精神、活動情況，體重變化情況。

1.3.5標本采集及保存

免疫后21天，各組大鼠鎖骨下靜脈取血1～2ml，3000r/min離心后收集血清，置于-80℃冰箱保存備用；腹腔注射戊巴比妥鈉20mg/kg，麻醉后處死，立刻無菌取心臟，冰鹽水沖洗后放入10％中性福爾馬林固定，常溫保存，用于HE染色和免疫組化檢測。

1.3.6 ELISA法檢測血清cTnT和BNP的表達

本研究應用上海基爾頓生物科技有限公司檢測試劑盒，嚴格按照產品說明書進行操作。計算：用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

1.3.7組織標本制備

將心肌組織沿長軸剖開，每隔1cm取材，大小約1cm×1cm×0.3cm，置于10％中性福爾馬林固定4～6h，水洗20～30min，常規按以下步驟脫水、透明、浸蠟：70％乙醇(35℃)90min、80％乙醇(35℃)90min、90％乙醇(35℃)90min、95％乙醇(35℃)90min、100％乙醇Ⅰ(35℃)60min、100％乙醇Ⅱ(35℃)60min、二甲苯Ⅰ透明20min、二甲苯Ⅱ透明35min、二甲苯Ⅲ透明35min、浸蠟(60℃)30min、浸蠟(60℃)75min、浸蠟(60℃)75min。常規石蠟包埋，4μm連續切片。用于后續的HE染色和免疫組化檢測。

1.3.8蘇木精-伊紅(HE)染色

1.3.8.1鏡檢觀察：在每張切片中隨機選取5個高倍鏡(×100倍)視野，計算每個視野中炎性細胞浸潤及壞死的區域面積占整個視野面積的百分比。無病變的記為0分，病變面積小于25％的記為1分，病變面積在25％～50％間記為2分，病變面積在50％～75％間記為3分，病變面積大于75％的記為4分。

1.3.9統計學方法

實驗結果用SPSS17.0統計軟件，大鼠體重采用重復測量資料的方差分析，其他數據采用單因素方差分析進行統計分析，各組實驗數據以均數±標準差表示，均以P＜0.05為具有統計學意義。

2實驗結果

2.1一般狀態觀察

各組大鼠觀察期間無死亡現象。正常對照組大鼠均健康生長至免疫第21天。造模大鼠于免疫第7天開始出現進食及活動減少、互相撕咬、毛色晦暗、呼吸急促。至免疫第21天，EAM模型組大鼠上述表現尤為明顯。

2.2體重變化

各組大鼠免疫前體重沒有顯著差別(P＞0.05)，EAM模型組大鼠體重自免疫第7天開始逐漸減輕，至免疫第21天達最低。中藥組合物中大劑量組、玉丹榮心丸組大鼠體重于免疫第7天略有下降，后逐漸升高，增高顯著優于中藥組合物小劑量組大鼠(P＜0.01)。

2.3各組大鼠心肌組織病理變化

HE染色結果顯示正常對照組心肌細胞結構清晰，無變性壞死，細胞核結構清楚，間質內未見炎細胞浸潤和纖維組織增生；EAM模型組：心肌細胞大部分被破壞，變性壞死明顯，部分心肌細胞溶解消失，大量急慢性炎細胞彌漫浸潤，邊緣可見少量殘存的心肌細胞，間質成纖維細胞增生，顯示心肌炎大鼠模型造模成功。藥物干預后，中藥組合物小劑量組心肌間存在中等量中性粒細胞等炎細胞浸潤，心肌結構破壞明顯，可見少量成纖維母細胞增生；中藥組合物中劑量組和玉丹榮心丸組均顯示心肌結構基本存在，僅見少量變性壞死，心肌間可見少量中性粒細胞浸潤，未見明顯成纖維細胞增生；中藥組合物大劑量組心肌結構基本正常，心肌細胞無明顯變性壞死，心肌間有少量不等的灶性炎性細胞聚集區。

病理積分比較結果顯示EAM模型組心肌病理積分高于正常對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。中藥組合物中、大劑量組與玉丹榮心丸組心肌病理積分均低于EAM模型組和中藥組合物小劑量組(P＜0.05)，三組之間無顯著差異(P＞0.05)，中藥組合物小劑量組與EAM模型組病理積分無統計學差異(P＞0.05)，見表1。

表1各組病理積分比較表

注：與正常對照組比較，^★P＜0.05；與EAM模型組比較，^△△P＞0.05，^△P＜0.01；與小劑量組比較，^◇P＜0.05；與中劑量組比較^▲P＞0.05；與大劑量組比較^☆P＞0.05。

2.4各組大鼠血清cTnT、BNP表達

ELISA檢測結果顯示，EAM模型組大鼠血清cTnT、BNP水平顯著高于正常對照組(P＜0.01)；中藥組合物中大劑量組、玉丹榮心丸組水平均顯著低于EAM模型組(P＜0.01)、中藥組合物小劑量組(P＜0.01)，三組間無顯著差異。EAM模型組、中藥組合物小劑量組無差異(P＞0.05)，見表2、3。

表2各組大鼠血清cTnT表達

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲▲P＞0.05，^▲P＜0.01；與小劑量組比較^☆P＜0.01；與中劑量組比較^★P＞0.05；與大劑量組比較^○P＞0.05。

表3各組大鼠血清BNP表達

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲▲P＞0.05，^▲P＜0.01；與小劑量組比較^☆P＜0.01；與中劑量組比較^★P＞0.05；與大劑量組比較^○P＞0.05。

綜合上述結果可見，中藥組合物大、中劑量干預后，能顯著改善EAM模型大鼠的體重下降、減輕心肌細胞的壞死和炎性浸潤、降低反映心肌損傷的cTnT和心衰定量標志物BNP的水平，且兩個劑量組之間無顯著性差異，提示該藥物中劑量有較好地對抗EAM模型大鼠心肌損傷的效果。

試驗例二 中藥組合物對EAM模型大鼠Th細胞相關細胞因子的影響

1材料與方法

1.1實驗樣本

本實驗的檢測樣本為試驗例一制備的血清。

1.2主要試劑

ELISA試劑盒均由上海基爾頓生物科技有限公司提供，γ-IFN(批號：RA20594)，IL-2(批號：RA20132)，IL-4(批號：RA20088)，IL-6(批號：RA20069)。

1.2實驗方法

1.2.1 ELISA法檢測血清γ-IFN、IL-2、IL-4、IL-6水平。

本研究應用上海基爾頓生物科技有限公司檢測試劑盒，嚴格按照產品說明書進行操作。

2實驗結果

2.1各組大鼠血清γ-IFN和IL-2的表達

EAM模型組血清γ-IFN、IL-2的表達顯著高于正常對照組(P＜0.01)；中藥組合物中大劑量組、玉丹榮心丸組血清γ-IFN、IL-2水平均顯著低于EAM模型組(P＜0.01)，三組間未見顯著差異，中藥組合物小劑量組血清γ-IFN、IL-2表達與EAM模型組比較無差異(P＞0.05)，見表4、5。

表4各組大鼠血清γ-IFN表達

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲▲P＞0.05，^▲P＜0.01；與小劑量組比較^☆P＜0.01；與中劑量組比較^★P＞0.05；與大劑量組比較^○P＞0.05。

表5各組大鼠血清IL-2表達

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲▲P＞0.05，^▲P＜0.01；與小劑量組比較^☆P＜0.01；與中劑量組比較^★P＞0.05；與大劑量組比較^○P＞0.05。

2.2各組大鼠血清IL-4和IL-6的表達

EAM模型組血清IL-4、IL-6水平顯著低于正常對照組(P＜0.01)。中藥組合物中大劑量組、玉丹榮心丸組分別與EAM模型組相比較，IL-4、IL-6水平均有不同程度的升高，差異有統計學意義(P＜0.01)。其中中藥組合物大劑量組和玉丹榮心丸組升高幅度明顯，二者之間無顯著性差異(P＞0.05)；二者分別與中劑量組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。中藥組合物小劑量組與EAM模型組比較無明顯差異(P＞0.05)，見表6、7。

表6各組大鼠血清IL-4表達

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲▲P＞0.05，^▲P＜0.01；與小劑量組比較^☆P＜0.01；與中劑量組比較^★P＜0.01；與大劑量組比較^○P＞0.05。

表7各組大鼠血清IL-6表達

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲▲P＞0.05，^▲P＜0.01；與小劑量組比較^☆P＜0.01；與中劑量組比較^★P＜0.01；與大劑量組比較^○P＞0.05

綜上可見，中藥組合物大中劑量組能降低Th1細胞分泌的γ-IFN和IL-2，提高Th2細胞分泌的IL-4和IL-6水平，調節EAM模型大鼠出現的Th1/Th2失衡。對于Th1細胞的影響與玉丹榮心丸比較等效，且中藥組合物大、中劑量組之間無顯著差異。

試驗例三 中藥組合物對EAM模型大鼠IL-2/STAT5通路的影響

1材料與方法

1.1實驗樣本

本實驗的檢測樣本為試驗例一制備的石蠟切片。

1.2主要試劑

第一抗體免疫組化試劑盒均由北京博奧森生物技術有限公司提供，IL-2(批號：BS-4586R)，IL-2R(批號：BS-2545R)，STAT5(批號：BS-1142R)；第二抗體SP-9001試劑盒由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，批號：SP-9001；DAB顯色試劑由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，批號：ZLI-9032。

1.2實驗方法

1.2.1免疫組化法檢測大鼠心肌組織IL-2、IL-2R和STAT5表達

本研究應用北京博奧森生物技術有限公司檢測試劑盒，按照產品說明書進行操作。

1.2.1.2圖象分析：

參考R.A.S.的IHS法，在每張切片中隨機選取5個高倍鏡(400×)視野，計算陽性細胞數百分比(A％)，陽性細胞數百分比在1％～10％的為1分，11％～50％為2分，51％～80％為3分，81％～100％為4分，再看陽性細胞顯色強度(B)，0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，HIS為A％與B的乘積，0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8分為陽性，9～12分為強陽性。用美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus管理系統進行分析、讀取數據、最后存盤。

2實驗結果

2.1大鼠心肌組織IL-2、IL-2R的表達

免疫組化顯示EAM模型組大鼠、中藥組合物中劑量組、玉丹榮心丸組大鼠心肌組織IL-2、IL-2R表達增強，顯著區別于正常對照組大鼠(P＜0.01)，中藥組合物中劑量、玉丹榮心丸可抑制IL-2、IL-2R表達，與EAM模型組比較有顯著差異(P＜0.05)，但兩組間無明顯差異(P＞0.05)，見表8、9。

表8大鼠心肌組織IL-2表達

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲P＜0.05；與中劑量組比較^☆P＞0.05。

表9大鼠心肌組織IL-2R表達

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲P＜0.05；與中劑量組比較^☆P＞0.05。

2.2大鼠心肌組織STAT5的表達

免疫組化顯示EAM模型組大鼠心肌組織STAT5蛋白表達顯著高于正常對照組大鼠(^△P＜0.01)，提示自身免疫性心肌炎大鼠有JAKs/STAT5通路的激活，中藥組合物中劑量及玉丹榮心丸組大鼠心肌組織STAT5蛋白表達明顯低于EAM模型組(^▲P＜0.01)，且兩者無明顯差異(^★P＞0.05)，見表10。

表10大鼠心肌組織STAT5表達

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲P＜0.01；與中劑量組比較^☆P＞0.05。

綜上可知，EAM模型大鼠存在IL-2/STAT5通路的激活，實驗證實中藥組合物中劑量及玉丹榮心丸可以抑制IL-2/STAT5通路的激活，且兩者等效。

試驗例四 中藥組合物對EAM模型大鼠心肌纖維化的影響

1材料與方法

1.1實驗動物及飼養條件

雄性健康SPF級Lewis大鼠40只，6～7周齡，體重180～210g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。飼養環境和條件同試驗例一1.2。

1.2主要試劑和儀器

試劑：豬心肌肌球蛋白(美國Sigma公司)，貨號：M0531；完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)，貨號：F588；Masson試劑盒(北京索寶來科技有限公司)，貨號：G1340；MMP-9一抗免疫組化試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)，貨號：BS-4593R；TIMP-1一抗免疫組化試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)，貨號：BS-4600R；第二抗體SP-9001試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，貨號：SP-9001；DAB顯色試劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)，貨號：ZLI-9032。

1.3實驗方法

1.3.1造模及分組

抗原制備方法同試驗例一，將40只SPF級雄性Lewis大鼠按隨機數字表分為2組：正常對照組10只，模型組30只，將模型組大鼠按試驗例一造模方法造模，成功后隨機分成3組，即EAM模型組、中藥組合物中劑量組和玉丹榮心丸組，每組10只。正常對照組處理同試驗例一。

1.3.2藥物制備及給藥

藥物制備同試驗例一，中藥組合物中劑量組每日給予中藥組合物1ml/100g；玉丹榮心丸組每日給玉丹榮心丸混懸溶液1ml/100g；正常對照組和EAM模型組每日均給予蒸餾水1ml/100g，均采用灌胃法給藥，日一次，連續給藥56天。

1.3.3一般情況觀察觀察大鼠食欲、精神、活動情況情況。

1.3.4標本制備

免疫第56天，各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉20mg/kg，麻醉后處死，立刻無菌取心臟，將心肌組織沿長軸剖開，每隔1cm取材，大小約1cm×1cm×0.3cm，置于10％中性福爾馬林固定4～6h，水洗20～30min，常規按以下步驟脫水、透明、浸蠟：70％乙醇(35℃)90min、80％乙醇(35℃)90min、90％乙醇(35℃)90min、95％乙醇(35℃)90min、100％乙醇Ⅰ(35℃)60min、100％乙醇Ⅱ(35℃)60min、二甲苯Ⅰ透明20min、二甲苯Ⅱ透明35min、二甲苯Ⅲ透明35min、浸蠟(60℃)30min、浸蠟(60℃)75min、浸蠟(60℃)75min。常規石蠟包埋，4μm連續切片。用于后續的HE染色、Masson染色和免疫組化檢測。

1.3.5HE染色步驟同試驗例一。

1.3.6大鼠心肌組織Masson染色本研究采用北京索寶來科技有限公司試劑盒，按照說明書操作。

1.3.7免疫組化法測免疫心肌組織MMP-9/TIMP–1表達實驗步驟同試驗例三。

2實驗結果

2.1一般狀態觀察

正常對照組大鼠均健康生長至免疫第56天，EAM模型組大鼠于免疫第28天死亡1只，中藥組合物中劑量組和玉丹榮心丸組大鼠至免疫第56天無死亡。造模大鼠于免疫第7天開始出現進食及活動減少、互相撕咬、毛色晦暗、呼吸急促。至免疫第21天，EAM模型組大鼠上述表現尤為明顯。

2.2各組大鼠心肌組織變化

HE染色可見正常對照組心肌組織結構正常，未見壞死、淋巴細胞浸潤和纖維化改變；EAM模型組：部分心肌細胞變性壞死，間質顯著水腫，多量炎細胞浸潤，并有纖維細胞增生和纖維化形成；中藥組合物中劑量組和玉丹榮心丸組變化相似，心肌細胞變性壞死輕度，均在心肌細胞間有小灶性炎性細胞浸潤，纖維化不明顯。

中藥組合物中劑量組與玉丹榮心丸組心肌病理積分均低于EAM模型組(P＜0.05)，兩組之間無明顯差異(P＞0.05)，見表11。

表11各組病理積分比較表

注：與正常對照組比較，^★P＜0.05；與EAM模型組比較，^△P＜0.05；與中劑量組比較^▲P＞0.05。

Masson染色顯示EAM模型組大鼠發生彌漫性的心肌纖維化，中藥組合物中劑量組心肌有少量灶性纖維化，玉丹榮心丸組比中藥組合物中劑量組心肌成纖維細胞明顯增多。

2.3大鼠心肌組織MMP–9、TIMP–1的表達

免疫組化顯示EAM模型組大鼠心肌組織MMP–9表達較正常對照組大鼠顯著降低，TIMP–1的表達較正常對照組大鼠明顯升高，提示自身免疫性心肌炎心肌纖維化的發生是通過影響了MMP–9/TIMP–1的平衡而發生的。中藥組合物中劑量及玉丹榮心丸可以上調MMP–9的表達，下調TIMP–1的表達，從而調節MMP–9/TIMP–1的比例，促使失衡趨于平衡，抑制了心肌纖維化，且中藥組合物中劑量的作用明顯優于玉丹榮心丸(P＜0.01)，見表12、13。

表12大鼠心肌組織MMP–9的表達

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲P＜0.05；與中劑量組比較^☆P＜0.01。

表13大鼠心肌組織TIMP–1的表達

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲P＜0.05；與中劑量組比較^☆P＜0.01。

上述實驗結果可見中藥組合物對于免疫56天的EAM模型大鼠有抗心肌纖維化作用，能上調心肌組織MMP–9的表達，下調其TIMP–1的表達，且效果優于玉丹榮心丸。

綜上所述，本發明實施例提供的中藥組合物以“解毒活血、益氣養陰”為主。對于治療毒瘀互結，氣陰兩虛證的患者兒童有顯著療效。從現代藥理來講，綜合上述試驗例，該中藥組合物能顯著改善免疫21天實驗性自身免疫性心肌炎模型大鼠的體重下降、減輕心肌細胞的壞死和炎性浸潤、降低反映心肌損傷的心肌肌鈣蛋白T和心衰定量標志物腦鈉素的水平，降低血清γ-干擾素、白介素-2水平，升高白介素-4、白介素-6水平，下調心肌組織白介素-2、白介素-2受體、信號轉導及轉錄因子5的表達；對于免疫56天的實驗性自身免疫性心肌炎模型大鼠有抗纖維化作用，上調心肌組織基質金屬蛋白酶9的表達，下調其抑制因子1的表達。因此該中藥組合物治療小兒病毒性心肌炎具有針對性。該中藥組合物的制備方法簡單易行，可操作性強。

以上所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發明的實施例的詳細描述并非旨在限制要求保護的本發明的范圍，而是僅僅表示本發明的選定實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。