本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種exosomes裝載的mir-93-5p在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用，具體涉及粒細(xì)胞樣髓源性抑制細(xì)胞來源exosomes裝載的mir-93-5p在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，ra)是一種病因不明的慢性進(jìn)行性并累及全身多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，病理特征表現(xiàn)多為手、足小關(guān)節(jié)對(duì)稱性的滑膜慢性炎癥，其造成的身體危害，嚴(yán)重影響人類生產(chǎn)和生活。ra的確切發(fā)病機(jī)制不明，免疫學(xué)與流行病上的研究認(rèn)為與遺傳、激素、環(huán)境、病毒感染等因素有關(guān)。目前對(duì)其治療的主要目的在于減輕關(guān)節(jié)的炎癥，抑制疾病的發(fā)展，盡可能保護(hù)關(guān)節(jié)和降低疾病的活動(dòng)度。臨床上對(duì)于ra的治療主要包括藥物治療和免疫學(xué)治療。藥物治療主要包括非甾體類藥物、抗風(fēng)濕類藥物、糖皮質(zhì)激素等，但藥物帶來的毒副作用較多，影響肝腎代謝功能，容易產(chǎn)生藥物依賴，此外激素類藥物可導(dǎo)致患者胃腸不良反應(yīng)、向心性肥胖、免疫力低下、骨質(zhì)疏松等。免疫學(xué)治療主要包括免疫凈化和生物靶向藥物治療，其中免疫凈化可以去除類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血中自身抗體、免疫復(fù)合物和免疫球蛋白等，但治療成本高、操作復(fù)雜，創(chuàng)傷較大。生物靶向藥物主要包括tnf-α拮抗劑和針對(duì)ra炎癥分子的生物制劑，這些藥物具有快速抑制炎癥反應(yīng)，修復(fù)已損傷關(guān)節(jié)的作用，但價(jià)格十分昂貴，并且存在導(dǎo)致潛伏結(jié)核感染的患者結(jié)核病復(fù)燃，肝損傷，罹患腫瘤等風(fēng)險(xiǎn)。另外針對(duì)ra炎癥分子的生物制劑包括il-1受體拮抗劑和il-6受體拮抗劑等。傳統(tǒng)藥物治療帶來極大的毒副作用，目前免疫學(xué)治療方法相對(duì)單一且價(jià)格昂貴，對(duì)于ra的治療仍然有很多需要研究和改進(jìn)之處。

已有研究者發(fā)現(xiàn)一類新的cd4⁺輔助性t細(xì)胞，由此細(xì)胞亞群特異性分泌il-17而被稱為輔助t細(xì)胞17型(helpertcelltype17,th17)，它還可以分泌il-6、tnf-α等細(xì)胞因子，il-17和th17細(xì)胞在ra及其動(dòng)物模型的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

近年來相關(guān)研究表明mdscs在自身免疫性疾病的治療方面有巨大的潛能，已有實(shí)驗(yàn)利用mdscs治療小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-inducedarthritis，cia)，并取得一定療效；但是，由于mdscs來源不足、儲(chǔ)存不便及成分復(fù)雜等缺點(diǎn)限制了其應(yīng)用。髓源性抑制細(xì)胞(myeloidderivedsuppressorcells,mdsc)是骨髓來源的異質(zhì)性細(xì)胞群體，在小鼠中，mdsc是gr-1(由ly6g和ly6c組成)和cd11b雙陽性的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)及l(fā)y6g、ly6c的表達(dá)量的高低，又將mdsc分為兩個(gè)亞型：cd11b⁺ly6g⁺ly6c^low粒細(xì)胞樣mdsc(g-mdsc)和cd11b⁺ly6g^-ly6c^hi單核細(xì)胞樣mdsc(m-mdsc)，其中g(shù)-mdscs主要通過精氨酸酶1(arginine1，arg-1)和活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)來抑制t細(xì)胞的活化和增殖，m-mdsc則主要通過arg-1和一氧化氮來發(fā)揮抑制作用。

有研究表明g-mdsc來源的exosomes(g-exosomes)對(duì)于炎癥性腸病模型小鼠和cia模型小鼠均有保護(hù)作用，exosomes是由細(xì)胞內(nèi)吞系統(tǒng)產(chǎn)生的具有生物活性的囊泡，exosomes內(nèi)包裹各種脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸，并能將其攜帶的物質(zhì)運(yùn)輸至受體細(xì)胞而發(fā)揮生物學(xué)作用。目前exosomes的應(yīng)用主要包括藥物載體和疾病診斷，以exosomes作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體，相對(duì)于目前的脂質(zhì)體載體和聚合物載體具有免疫原性低、運(yùn)輸效率高、穩(wěn)定性好、靶向性強(qiáng)及跨越血腦屏障的優(yōu)點(diǎn)，目前以exosomes作為載體的藥物主要有基因類藥物(sirna、mrna、mirna)和抗癌類藥物(阿霉素、紫杉醇等)以及增強(qiáng)免疫的抗原等。由于不同疾病下不同細(xì)胞分泌的exosomes含有不同的核酸、蛋白成分，所以分析從病人體液中分離的exosomes所包含的成分可以作為疾病診斷的依據(jù)。越來越多的研究表明exosomes在自身免疫性疾病的炎癥發(fā)生過程中起到重要作用，但是g-mdsc來源的exosomes成分復(fù)雜，其具體作用機(jī)制仍不清楚。

較多研究表明exosomes攜帶的mirna具有抑制t細(xì)胞增殖分化的作用，例如treg細(xì)胞來源exosomes攜帶的let-7d可以抑制th1細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并且在體內(nèi)減輕炎癥性腸病小鼠模型的疾病嚴(yán)重程度(okoyeis,coomessm,pellyvs,cziesos,papayannopoulosv,tolmachovat,etal.microrna-containingt-regulatory-cell-derivedexosomessuppresspathogenicthelper1cells[j].immunity.2014,41(1):89-103.)。微小rna(microrna，mirna)是一系列長(zhǎng)度為18～22核苷酸的非編碼小rna，它們主要是通過與靶基因的3’非翻譯區(qū)(3’-utr)特異性結(jié)合，抑制其靶基因的翻譯或誘導(dǎo)其mrna的降解，從而抑制靶標(biāo)蛋白的表達(dá)。

根據(jù)g-exosomes的結(jié)構(gòu)和功能特性，利用其裝載的mirna應(yīng)用于ra的治療，可達(dá)到“安全性高、靶向性強(qiáng)”的目的，具有良好的臨床應(yīng)用前景，有望在維持機(jī)體免疫平衡方面發(fā)揮積極作用，為ra的治療提供一種全新的治療途徑。本發(fā)明對(duì)g-exosomes中mirna進(jìn)行人工干預(yù)，過表達(dá)后能顯著提高應(yīng)用效果，以獲得具有更佳治療效果的g-exosomes。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes的制備方法及其在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)手段如下：

本發(fā)明首先提供一種mir-93-5p在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種mir-93-5p的篩選方法。

本發(fā)明還提供一種過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes的制備方法。

本發(fā)明還提供一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物，所述藥物包含過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes。

具體的，采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明首先分離提取m-mdsc和g-mdsc，然后提取鑒定這兩種細(xì)胞所分泌的exosomes(g-exosomes和m-exosomes)，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證g-exosomes和m-exosomes對(duì)于cia模型小鼠發(fā)病的影響，結(jié)果表明，g-exosomes具有抑制cia模型小鼠的發(fā)病的作用，通過g-exosomes和m-exosomes對(duì)th17細(xì)胞進(jìn)行處理，進(jìn)一步表明，g-exosomes可以抑制th17細(xì)胞的分化，進(jìn)而減輕小鼠發(fā)病，而m-exosomes沒有明顯的抑制作用。

對(duì)g-exosomes和m-exosomes進(jìn)行mirna的提取測(cè)序分析，篩選出在g-exosomes和m-exosomes中含量相差的差值絕對(duì)值較大的前二十個(gè)mirna；進(jìn)一步根據(jù)mirna的結(jié)構(gòu)和功能特性進(jìn)行篩選，篩選出9個(gè)可能對(duì)ra產(chǎn)生作用的mirna，分別為：mir-16-5p、mir-29a-3p、mir-93-5p、mir-22-3p、mir-26b-5p、let-7f-5p、let7g-5p、mir-221-3p、mir-92a-3p。

根據(jù)篩選出的9個(gè)mirna序列設(shè)計(jì)引物，通過qrt-pcr檢測(cè)9個(gè)mirna在g-exosomes處理后的th17細(xì)胞中表達(dá)量的變化，結(jié)果篩選出g-exosomes處理后的th17細(xì)胞中表達(dá)量增加最大3個(gè)mirna為mir-16-5p、mir-29a-3p、mir-93-5p。

將篩選出的3個(gè)mirna(mir-16-5p、mir-29a-3p、mir-93-5p)相對(duì)應(yīng)的mimics和mimics-陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染初始t細(xì)胞，并誘導(dǎo)分化th17細(xì)胞，通過qrt-pcr檢測(cè)，結(jié)果顯示mir-93-5p可以抑制初始t細(xì)胞向th17細(xì)胞的分化，也表明g-exosomes可能是通過其裝載攜帶的mir-93-5p抑制th17細(xì)胞的分化。

進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染mimics和inhibors的g-mdsc，制備過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes，并通過體外實(shí)驗(yàn)證明，過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes相對(duì)于原有g(shù)-exosomes更加明顯的抑制了th17細(xì)胞的分化；而阻斷mir-93-5p的g-exosomes則失去了原有g(shù)-exosomes對(duì)th17細(xì)胞分化的抑制作用。結(jié)果表明g-exosomes攜帶的mir-93-5p體外抑制th17的分化，本發(fā)明制備的過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes相對(duì)于原有的g-exosomes對(duì)th17細(xì)胞分化的抑制能力更強(qiáng)。

本發(fā)明通過研究過表達(dá)和阻斷mir-93-5p的g-exosomes對(duì)于cia模型小鼠發(fā)病的作用，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes相對(duì)于原有g(shù)-exosomes對(duì)cia小鼠的保護(hù)作用更強(qiáng)了，而阻斷mir-93-5p的g-exosomes則失去了原有g(shù)-exosomes對(duì)cia小鼠發(fā)病的抑制作用。結(jié)果表明g-exosomes攜帶的mir-93-5p減輕cia模型小鼠的發(fā)病，本發(fā)明制備的過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes相對(duì)于原有的g-exosomes對(duì)cia模型小鼠的保護(hù)作用更強(qiáng)。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)g-exosomes裝載的mir-93-5p可以在體內(nèi)外抑制相應(yīng)受體細(xì)胞靶標(biāo)蛋白stat3的表達(dá)，以此發(fā)揮對(duì)th17細(xì)胞分化的抑制作用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)

(1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)g-exosomes攜帶的mir-93-5p可以通過抑制th17細(xì)胞的分化減輕cia模型小鼠的發(fā)病，為ra的治療提供了新的方法。

(2)本發(fā)明制備過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes的方法耗時(shí)短，操作方便，所含成分活性穩(wěn)定，-80℃保存時(shí)間達(dá)1年以上；室溫下結(jié)構(gòu)及活性成分也穩(wěn)定，有利于臨床上的應(yīng)用。

(3)本發(fā)明中制備的過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes相對(duì)于普通g-exosomes具有更強(qiáng)的抑制th17細(xì)胞分化以及緩解cia模型小鼠疾病嚴(yán)重程度的作用。

(4)本發(fā)明中g(shù)-exosomes裝載的mir-93-5p可以在體內(nèi)外抑制相應(yīng)受體細(xì)胞靶標(biāo)蛋白stat3的表達(dá)，作用靶點(diǎn)明確。

(5)以exosomes作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體具有免疫原性低、運(yùn)輸效率高、穩(wěn)定性好、吸收快、靶向性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明制備的過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes相對(duì)于現(xiàn)有治療ra藥物，具有無毒副作用，不影響正常肝腎代謝功能，制備過程簡(jiǎn)便，所需成本低的優(yōu)勢(shì)，此外本發(fā)明制備的過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes，藥物作用機(jī)制明確，利于藥物療效的監(jiān)測(cè)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明分選制備的g-mdsc和m-mdsc的純度鑒定結(jié)果，其中a為g-mdsc，b為m-mdsc。

圖2為本發(fā)明分選制備的g-exosomes和m-exosomes的透射電鏡圖，其中a為g-exosomes，b為m-exosomes。

圖3為本發(fā)明分選制備的g-exosomes和m-exosomes的粒徑大小頻數(shù)分布圖，其中a為g-exosomes，b為m-exosomes。

圖4為westemblot檢測(cè)g-exosomes和m-exosomes的標(biāo)志性蛋白表達(dá)結(jié)果。

圖5為g-exosomes和m-exosomes對(duì)cia模型小鼠發(fā)病過程中平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響結(jié)果。

圖6為g-exosomes和m-exosomes對(duì)cia模型小鼠足趾腫脹程度的影響結(jié)果。

圖7為g-exosomes和m-exosomes體外對(duì)于th17細(xì)胞分化的影響結(jié)果，圖中a為磷酸鹽緩沖液對(duì)照組th17細(xì)胞比例；b為n-exosomes處理組th17細(xì)胞比例；c為m-exosomes處理組th17細(xì)胞比例；d為g-exosomes處理組th17細(xì)胞比例。

圖8為g-exosomes和m-exosomes裝載的mirna含量差值的絕對(duì)值排前20位的mirna。

圖9為g-exosomes處理的th17細(xì)胞中mirna表達(dá)量的變化結(jié)果。

圖10為轉(zhuǎn)染了相應(yīng)mimics到初始t細(xì)胞后，誘導(dǎo)分化的th17細(xì)胞中mir-93-5p、mir-16-5p、mir-29a-3p的表達(dá)量變化結(jié)果。

圖11為轉(zhuǎn)染了mir-93-5p、mir-16-5p、mir-29a-3p相應(yīng)mimics到初始t細(xì)胞后，對(duì)誘導(dǎo)分化th17細(xì)胞的影響結(jié)果，圖中a為mimics-陰性對(duì)照組th17細(xì)胞比例；b為mir-16-5p-mimics處理組th17細(xì)胞比例；c為mir-29a-3p-mimics處理組th17細(xì)胞比例；d為mir-93-5p-mimics處理組th17細(xì)胞比例。

圖12為將mir-93-5p的mimics或者inhibitors轉(zhuǎn)染到g-mdsc后對(duì)其表達(dá)mir-93-5p的影響。

圖13為將mir-93-5p的mimics或者inhibitors轉(zhuǎn)染到g-mdsc后，g-exosomes表達(dá)mir-93-5p的表達(dá)量結(jié)果圖。

圖14為過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes對(duì)th17細(xì)胞分化的影響結(jié)果,圖中a為陰性對(duì)照組th17細(xì)胞比例，b為磷酸鹽緩沖液對(duì)照組th17細(xì)胞比例，c為g-exosomes處理組th17細(xì)胞比例，d為mimics-nc處理組th17細(xì)胞比例，e為mimic處理組th17細(xì)胞比例，f為inhibitors-nc處理組th17細(xì)胞比例,g為inhibitors處理組th17細(xì)胞比例。

圖15為過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes對(duì)th17誘導(dǎo)體系中細(xì)胞中mir-93-5p的表達(dá)量。

圖16為過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes對(duì)cia模型小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響程度。

圖17為過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes對(duì)cia模型小鼠足趾腫脹的影響程度直觀圖片。

圖18為過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes處理cia模型小鼠后足趾的he染色切片結(jié)果，其中a為pbs緩沖液組，b為g-exosomes組，c為mimics-nc-exosomes組，d為mimics-exosomes組，e為inhibors-nc-exosomes組，f為inhibors-exosomes組。

圖19為過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes處理cia模型小鼠后腘窩淋巴結(jié)細(xì)胞中th17細(xì)胞比例的流式結(jié)果。

圖20為過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes對(duì)cia模型小鼠引流淋巴結(jié)cd4⁺t細(xì)胞中mir-93-5p表達(dá)量的結(jié)果。

圖21為mir-93-5p與stat3的可能結(jié)合位點(diǎn)。

圖22為過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes對(duì)th17誘導(dǎo)體系中細(xì)胞總stat3的表達(dá)量，其中，a為westernblot檢測(cè)結(jié)果，b為統(tǒng)計(jì)分析圖。

圖23為過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes對(duì)cia模型小鼠引流淋巴結(jié)cd4⁺t細(xì)胞總stat3的表達(dá)量，其中，a為westernblot檢測(cè)結(jié)果，b為統(tǒng)計(jì)分析圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1：g-mdsc和m-mdsc的提取及鑒定

(1)構(gòu)建荷瘤小鼠模型：使用含有10％小牛血清(購于美國(guó)gibco公司)、ph7.3的dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)(購于美國(guó)gibco公司)，37℃、5％co2條件下培養(yǎng)小鼠lewis肺腺癌細(xì)胞系(購于上海生命科學(xué)院)。在培養(yǎng)過程中密切觀察細(xì)胞的形態(tài)、貼壁情況、密度、培養(yǎng)液顏色變化，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度達(dá)到培養(yǎng)皿底部的85％左右時(shí)，用0.25％的胰酶(購于博士德生物工程有限公司)消化并傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期lewis細(xì)胞，按每只小鼠右腹部皮下注射3.0×10⁶個(gè)細(xì)胞的方法，對(duì)6-8周齡雄性c57bl/6小鼠(購于江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)進(jìn)行移植瘤的構(gòu)建，模型構(gòu)建過程中密切觀察小鼠生活狀態(tài)和腫瘤大小。

(2)分離荷瘤小鼠脾細(xì)胞：在lewis細(xì)胞注射給小鼠后的第30天，眼球取血并頸部脫臼處死小鼠，在用75％酒精浸泡小鼠5min后，超凈臺(tái)中解剖小鼠獲取脾臟；使用0.22μm孔徑的篩網(wǎng)過濾研磨后的脾臟，用pbs(磷酸鹽緩沖液)沖洗，收集懸液在4℃、500g條件下離心5min，棄上清；在沉淀的細(xì)胞中加入5mlack紅細(xì)胞裂解液(acklysisbuffer，ack)(上海銳谷生物科技有限公司)，混勻后，裂解紅細(xì)胞5min；加含有10％小牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)液(美國(guó)gibco公司)至10ml，混勻后在4℃、500g條件下離心5min，棄上清；在細(xì)胞重懸至10ml時(shí)留取少量細(xì)胞顯微鏡下計(jì)數(shù)。

(3)磁珠分選g-mdsc：每10⁸個(gè)脾細(xì)胞用350μlpbe重懸，加入50μl的fcrblockingreagent(德國(guó)美天旎公司)，混勻后置于冰上孵育10min；每10⁸個(gè)脾細(xì)胞加入40μl的anti-ly-6gbiotin(德國(guó)美天旎公司)，混勻后置于冰上孵育30min，每10min混勻一次；加入10mlpbe，混勻后將懸液在4℃、500g離心5min，棄上清；每10⁸個(gè)脾細(xì)胞加入50μlanti-ly-6g-biotinbeads(德國(guó)美天旎公司)，混勻后置于冰上孵育30min，每10min混勻一次；加入10mlpbe，混勻后將懸液在4℃、500g條件下離心5min，棄上清；加入500μlpbe，混勻；將macs分選柱裝在variomacs分選器(德國(guó)美天旎公司)上，加3mlpbe潤(rùn)洗1次后加入脾細(xì)胞懸液，待最后一滴細(xì)胞懸液流出后，再用3mlpbe洗滌分選柱，重復(fù)3次；從分選器上撤出分選柱，將分選柱置于10ml離心管上，加入5ml預(yù)冷的pbe，推動(dòng)活塞，壓出分離柱中的細(xì)胞，重復(fù)1次，得到10ml的細(xì)胞懸液，即為g-mdsc，留取少量顯微鏡下計(jì)數(shù)。

(4)磁珠分選m-mdsc：收集分選g-mdsc時(shí)分選柱流出的細(xì)胞懸液，4℃、500g條件下離心5min，棄上清；每10⁸個(gè)脾細(xì)胞加入40μl的anti-gr-1biotin(德國(guó)美天旎公司)，混勻后置于冰上孵育30min，每10min混勻一次；加入10ml的pbe，混勻后4℃、500g離心5min，棄上清；每10⁸個(gè)脾細(xì)胞加入50μl的anti-gr-1-biotinbeads(德國(guó)美天旎公司)，混勻后置于冰上孵育30min，每10min混勻一次；加入10ml的pbe，混勻后4℃、500g條件下離心5min，棄上清；加入500μl的pbe，混勻；將macs分選柱裝在分選器(德國(guó)美天旎公司)上，加3ml的pbe潤(rùn)洗1次，然后加入上述待分選細(xì)胞懸液，待最后一滴流盡，再加入3ml的pbe洗滌分選柱，重復(fù)3次；撤出分選柱置于10ml離心管上，加入5ml的pbe，推動(dòng)活塞，壓出柱中細(xì)胞，重復(fù)1次，得到10ml的細(xì)胞懸液，即為m-mdsc，留取少量顯微鏡下計(jì)數(shù)。

(5)g-mdsc和m-mdsc的純度鑒定：分別取步驟(4)和步驟(5)得到的g-mdsc1×10⁶個(gè)和m-mdsc1×10⁶個(gè)于ep管中，1ml的pbs重懸，在4℃、500g條件下離心5min，棄上清后剩余約100μl的pbs；混勻后在g-mdsc的ep管中加0.5μl的抗ly-6g抗體(美國(guó)ebioscience公司)和0.5μl的抗cd11b抗體(美國(guó)ebioscience公司)，m-mdsc的ep管加0.5μl的抗ly-6c抗體(美國(guó)ebioscience公司)和0.5μl的抗cd11b抗體(美國(guó)ebioscience公司)；分別在4℃孵育30min；1ml的pbs重懸后4℃、500g條件下離心5min，棄上清，加200μl的pbs重懸，流式細(xì)胞儀(美國(guó)bd公司)檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示，本發(fā)明中得到的g-mdsc純度為97.6％，m-mdsc純度為95.3％。

實(shí)施例2：g-exosomes和m-exosomes的提取及蛋白濃度測(cè)定

(1)將分選的g-mdsc和m-mdsc分別重懸于含10％小牛血清(美國(guó)gibco公司，血清經(jīng)過4℃、100000g離心16h處理后，留取血清上層2/3，去除血清中外泌體)的rpmi-1640培養(yǎng)液(美國(guó)gibco公司)中，以每孔1.5×10⁶個(gè)細(xì)胞，以及每孔1ml的體積種于24孔板；在37℃、5％co2的條件下培養(yǎng)24小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清。

(2)將收集的g-mdsc和m-mdsc的培養(yǎng)上清在4℃、300g條件下離心20min，收集上清；再將上清4℃、1000g離心30min，收取上清；再將上清4℃、10000g離心30min，收取上清；將上清加入到100kda超濾管(德國(guó)milipore公司)中，4℃、1000g離心30min，收取管中濃縮液。

(3)通過exoquick-tc^tmexosome試劑盒(美國(guó)sbi公司)提取exosomes：將濃縮液與exoquick-tc^tmexosome試劑按體積比5:1混合，輕微混勻，4℃冰箱內(nèi)靜置16h以上；在4℃、1000g條件下離心30min，棄去上清，收集沉淀物，即為g-exosomes或m-exosomes。將制備獲得的exosomes用pbs溶解，分裝至ep管中，-80℃保存。

(4)exosomes的溶解液與等體積的裂解液(ripa:pmsf＝250:1)混勻后，冰上放置1小時(shí)，期間每10min在震蕩器上震蕩1min；4℃、12000g離心15min，收集上清。按bca微量蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)有限公司)說明書的方法檢測(cè)exosomes裂解上清中的蛋白濃度，以確定提取exosomes的含量。結(jié)果顯示，本發(fā)明中得到的每個(gè)g-mdsc或m-mdsc在培養(yǎng)24h后可以提取約3×10^-6μg的exosomes。

實(shí)施例3：g-exosomes和m-exosomes的鑒定

(1)透射電鏡觀察g-exosomes的形態(tài)：取20μlg-exosomes或m-exosomes懸液滴加于直徑3mm的載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置2min；用濾紙輕輕吸干液體，滴加ph6.8的2％磷鎢酸溶液(上海君瑞科技有限公司)于銅網(wǎng)上，復(fù)染lmin；濾紙吸干染液，白熾燈下烤干，透射電鏡(荷蘭飛利浦公司)下觀察，結(jié)果如圖2所示，透射電子顯微鏡下觀察到g-exosomes和m-exosomes為圓形或橢圓形的微囊結(jié)構(gòu)，有完整包膜，腔內(nèi)為低電子密度成分；圖3分別為g-exosomes和m-exosomes的粒徑大小頻數(shù)分布，結(jié)果顯示g-exosomes和m-exosomes的粒徑主要分布在20-120nm之間。

(2)westernblot檢測(cè)g-exosomes和m-exosomes包含的蛋白分子cd9、cd63和線粒體包含的鈣聯(lián)蛋白分子calnexin：配制5％的濃縮膠和12％分離膠，用ripa蛋白裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)裂解g-exosomes和m-exosomes，將裂解后的g-exosomes按250μg蛋白總量上樣，經(jīng)100v恒壓電泳后；再經(jīng)350ma恒流電轉(zhuǎn)90min后，5％脫脂牛奶封閉pvdf膜lh；用抗cd63單克隆抗體(美國(guó)ebioscience公司)和抗calnexin單克隆抗體(美國(guó)ebioscience公司)4℃孵育過夜；取出后用tbs/t(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)洗膜，10min×3次，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(美國(guó)ebioscience公司)37℃孵育30min；取出后用tbs/t(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)洗膜，10min×3次；imagequantlas4000凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)ge公司)曝光顯色，結(jié)果如圖4所示，g-exosomes、m-exosomes特異性高表達(dá)cd9、cd63分子，但g-exosomes和m-exosomes不包含定位在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣聯(lián)蛋白。鑒于提取的g-exosomes和m-exosomes的形態(tài)、大小、蛋白分子表達(dá)結(jié)果，證明本實(shí)施例成功提取了g-exosomes和m-exosomes。

實(shí)施例4：實(shí)驗(yàn)證明g-exosomes和m-exosomes的免疫抑制功能

(1)構(gòu)建cia模型小鼠：

第一次免疫：用2mg/ml的牛二型膠原(美國(guó)sigma公司)與2mg/ml的弗氏完全佐劑(美國(guó)賽默飛公司)等體積混合，冰上研磨至油包水狀態(tài)；對(duì)每只dba/1小鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)尾根部皮下注射0.1ml的上述混合液；

第二次免疫：用2mg/ml的牛二型膠原(美國(guó)sigma公司)與2mg/ml的弗氏不完全佐劑(美國(guó)賽默飛公司)等體積混合，冰上研磨至油包水狀態(tài)，在第一次免疫后的第21天對(duì)每只dba/1小鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)尾根部皮下注射0.1ml的上述混合液。

(2)制備小鼠成熟中性粒細(xì)胞來源的exosomes(n-exosomes)：

對(duì)6-8周齡雄性c57bl/6小鼠(江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)摘除眼球取血，滴加到含有edta-na2的抗凝采血管(蘇州靈巖醫(yī)療器械有限公司)中，1000rpm離心眼球血10min，吸出血漿，用500μl的pbs重懸血細(xì)胞。將1ml的單個(gè)核淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?加到10ml容量的玻璃試管中，將血細(xì)胞懸液沿管壁緩緩滴加到玻璃試管中，使用水平離心機(jī)，4℃、2000rpm離心15min。用吸管自上而下緩緩吸取除紅細(xì)胞層外的其他細(xì)胞層并棄去，加入5mlack(上海銳谷生物科技有限公司)，吹打混勻,室溫靜置5min，加入5ml的含有10％小牛血清的rpmi1640培養(yǎng)液(美國(guó)gibico公司)終止裂解，混勻后4℃，500g離心5min。棄上清，用10mlpbe洗滌2次，得到中性粒細(xì)胞。然后按照實(shí)施例2中方法提取n-exosomes。

(3)實(shí)驗(yàn)分組：

pbs對(duì)照組：分別在第一次免疫后的第18天和24天對(duì)每只小鼠尾靜脈注射pbs100μl；

n-exosomes組：分別在第一次免疫后的第18天和24天對(duì)每只小鼠尾靜脈注射100μlpbs溶解的n-exosomes，其中100μlpbs溶解100μgn-exosomes；

g-exosomes組：分別在第一次免疫后的第18天和24天對(duì)每只小鼠尾靜脈注射100μlpbs溶解的g-exosomes，其中100μlpbs溶解100μgg-exosomes；

m-exosomes組：分別在第一次免疫后的第18天和24天對(duì)每只小鼠尾靜脈注100μlpbs溶解的m-exosomes，其中100μlpbs溶解100μgm-exosomes。

(4)在第二次免疫后每3天對(duì)各組小鼠的足趾情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，記錄每只小鼠的關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)(arthriticscore,as),as代表每只小鼠所有病變關(guān)節(jié)分?jǐn)?shù)的總和，而各關(guān)節(jié)病變分?jǐn)?shù)采用5級(jí)評(píng)分法，無紅腫得0分，關(guān)節(jié)紅而不腫得1分，關(guān)節(jié)輕度紅腫得2分，關(guān)節(jié)中度紅腫得3分，關(guān)節(jié)重度紅腫并伴有功能障礙得4分。計(jì)算各組小鼠的平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)(meanarthriticindex,mai)，mai由各組小鼠as的總和除以各組小鼠的個(gè)數(shù)。如圖5所示，g-exosomes處理組小鼠的平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)相對(duì)n-exosomes處理組降低了，而pbs緩沖液、n-exosomes、m-exosomes處理組之間無明顯差異；圖6表示g-exosomes處理組小鼠的足趾只有輕度的紅腫，關(guān)節(jié)活動(dòng)正常；然而pbs緩沖液、n-exosomes、m-exosomes處理組小鼠的足趾大多紅腫明顯，關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，這些結(jié)果表明g-exosomes具有抑制cia模型小鼠發(fā)病的作用，而m-exosomes沒有明顯抑制cia模型小鼠發(fā)病的作用。

(5)建立th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系：用含有2μg/ml抗小鼠cd3單克隆抗體(美國(guó)ebioscience公司)的包被液200μl包被24孔圓底培養(yǎng)板，4℃過夜；吸出各孔中的包被液，pbs洗滌1次，通過德國(guó)美天旎公司的初始t細(xì)胞分選試劑盒分選出初始t細(xì)胞，按每孔1.5×10⁶個(gè)細(xì)胞的密度將初始t細(xì)胞接種于24孔板，每孔總體積為1ml；各孔加入終濃度為2μg/ml的抗小鼠cd28單克隆抗體(美國(guó)ebioscience公司)、終濃度為5ng/ml的小鼠重組tgf-β(美國(guó)ebioscience公司)、終濃度為30ng/ml的il-6(美國(guó)ebioscience公司)、終濃度為30ng/ml的il-23(美國(guó)ebioscience公司)、終濃度為5μg/ml的anti-il-4(美國(guó)ebioscience公司)、終濃度為5μg/ml的anti-ifn-γ(美國(guó)ebioscience公司)；用含15％胎牛血清(美國(guó)gibico公司，經(jīng)過100000g離心16h處理)、ph7.2-7.4的rpmi-1640細(xì)胞培養(yǎng)液(美國(guó)gibico公司)，37℃、5％co2條件下培養(yǎng)72h。

(6)實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組：加入100μl的pbs作為對(duì)照；其余組各孔加入終濃度為60μg/ml的n-exosomes、g-exosomes和m-exosomes，如圖7所示，g-exosomes處理組th17細(xì)胞的比例相對(duì)n-exosomes處理組降低了，而pbs緩沖液、n-exosomes、m-exosomes處理組之間無明顯差異。這些結(jié)果表明g-exosomes相比m-exosomes在cia模型小鼠中起到減輕小鼠發(fā)病的作用，體外抑制th17細(xì)胞的分化，g-exosomes相對(duì)m-exosomes而言展現(xiàn)出更強(qiáng)大的免疫抑制功能。

實(shí)施例5：g-exosomes和m-exosomes中mirna的測(cè)序結(jié)果及分析

(1)委托廣州銳博公司對(duì)g-exosomes和m-exosomes中攜帶的mirna進(jìn)行提取測(cè)序分析，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知g-exosomes和m-exosomes包含許多特定的mirna，并且在表達(dá)量上存在一定差異。根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析，結(jié)合targetscan網(wǎng)站上相關(guān)mirna的信息，確定mirna的類別；如圖8所示，g-exosomes和m-exosomes包含的相關(guān)mirna含量差值的絕對(duì)值前二十位為mir-148a-3p(mimat0000516)、mir-340-5p(mimat0004651)、mir-16-5p(mimat0000527)、mir-22-3p(mimat0000531)、mir-27a-3p(mimat0000537)、mir-92a-3p(mimat0000539)、mir-140-3p(mimat0000152)、mir-27b-3p(mimat0000126)、mir-24-3p(mimat0000219)、mir-26b-5p(mimat0000534)、mir-423-3p(mimat0000516)、let-7f-5p(mimat0000525)、mir-29a-3p(mimat0000535)、mir-7a-5p(mimat0000677)、mir-140-5p(mimat0000151)、let7g-5p(mimat0000121)、mir-26a-5p(mimat0000533)、mir-221-3p(mimat0000669)、mir-93-5p(mimat0000540)、mir-148b-3p(mimat0000580)，括號(hào)內(nèi)編號(hào)為根據(jù)mirbase網(wǎng)站分析對(duì)應(yīng)的編號(hào)信息，并以它們作為待篩選mirna。

(2)本發(fā)明對(duì)待篩選mirna進(jìn)一步篩選，由于mir-16-5p、mir-29a-3p、mir-93-5p、let7g-5p與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展和成骨細(xì)胞的增殖、分化、遷移相關(guān)；mir-22-3p和mir-26b-5p參與ra的發(fā)病；mir-29a-3p、mir-93-5p、mir-221-3p與t細(xì)胞增殖、分化、免疫應(yīng)答等有關(guān)；mir-16-5p、mir-29a-3p、let-7f-5p、mir-92a-3p的潛在靶標(biāo)smad7、smad6、fos、pik3r1、stat3、emos、pik3r1等與t細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)。由此本發(fā)明進(jìn)一步篩選出mir-16-5p、mir-29a-3p、mir-93-5p、mir-22-3p、mir-26b-5p、let-7f-5p、let7g-5p、mir-221-3p、mir-92a-3p作為候選mirna。

(3)檢測(cè)候選mirna在g-exosomes處理后th17誘導(dǎo)細(xì)胞中表達(dá)量的倍數(shù)變化：收集實(shí)施例4步驟(6)中對(duì)照組與加g-exosomes處理的th17誘導(dǎo)細(xì)胞，用1ml的trizol(美國(guó)invitrogen公司)將1×10⁶個(gè)th17誘導(dǎo)細(xì)胞溶解，用移液器充分吹打混勻，加入預(yù)冷氯仿(上海化學(xué)試劑公司)200μl，立即震蕩15～30s，常溫靜置10min；在4℃條件下，12000g離心15min；ep管中液體出現(xiàn)分層，吸取上層水相層(含有rna)至新的干凈ep管中，加入500μl的異丙醇，使用移液器輕輕混勻，常溫靜置5～10min；在4℃條件下，12000g離心15min，此時(shí)rna沉于管底，呈半透明狀；棄去上清，加1ml的75％乙醇(上海化學(xué)試劑公司)洗滌；在4℃條件下，7800g離心5min；室溫置于超凈臺(tái)中吹干至rna呈半透明狀；加5μl的depc(上海碧云天有限公司)水溶解；用美國(guó)賽默飛檢測(cè)儀檢測(cè)rna的濃度。

(4)按照日本takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求對(duì)步驟(3)中提取的rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)mirna序列設(shè)計(jì)引物，然后委托廣州銳博公司合成mir-16-5p、mir-29a-3p、mir-93-5p、mir-22-3p、mir-26b-5p、let-7f-5p、let7g-5p、mir-221-3p、mir-92a-3p的前后向引物，通過上海bio-rad公司購買的qrt-pcr試劑盒檢測(cè)候選mirna在g-exosomes處理后th17誘導(dǎo)細(xì)胞中的表達(dá)量變化，結(jié)果如圖9所示，g-exosomes處理后th17誘導(dǎo)分化細(xì)胞中，候選mirna的表達(dá)量增加最大的是mir-16-5p、mir-29a-3p和mir-93-5p。

(5)通過entrancetm-r轉(zhuǎn)染試劑(北京engreen公司)將mir-16-5p、mir-29a-3p和mir-93-5p的mimics和mimics-陰性對(duì)照(廣州銳博生物科技有限公司)分別轉(zhuǎn)染到實(shí)施例4步驟(5)分選出的初始t細(xì)胞，然后按照實(shí)施例4中方法誘導(dǎo)分化為th17細(xì)胞，通過qrt-pcr檢測(cè)，結(jié)果如圖10，轉(zhuǎn)染mimics的th17細(xì)胞中mir-16-5p、mir-29a-3p和mir-93-5p表達(dá)量相應(yīng)提高；如圖11，轉(zhuǎn)染了mir-93-5p的mimics的初始t細(xì)胞向th17細(xì)胞分化的比例明顯低于轉(zhuǎn)染了mimics-陰性對(duì)照的初始t細(xì)胞，而轉(zhuǎn)染了mir-16-5p對(duì)應(yīng)mimics和mir-29a-3p對(duì)應(yīng)mimics的初始t細(xì)胞則沒有明顯變化。這些結(jié)果表明，外源性的mir-93-5p可以抑制初始t細(xì)胞向th17細(xì)胞的分化，這提示g-exosomes可能通過其攜帶的mir-93-5p抑制th17細(xì)胞的分化。

實(shí)施例6：制備過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes

(1)將mir-93-5p的mimics、mimics-陰性對(duì)照(mimics-negitivecontrol,mimics-nc)以及inhibitors、inhibitors-陰性對(duì)照(inhibitors-negitivecontrol,inhibitors-nc)的凍干粉(廣州銳博生物科技有限公司)離心后，用無菌depc水溶解，吹打混勻成終濃度為20μm的儲(chǔ)存液，分裝保存于-80℃冰箱；

(2)接種細(xì)胞，在24孔板中每孔接種1×10⁶個(gè)g-mdsc，用10％小牛血清的rpmi1640培養(yǎng)液(美國(guó)gibico公司)補(bǔ)足體系為450μl；

(3)mimics、mimics-nc以及inhibitors、inhibitors-nc稀釋液的制備：取干凈的ep管，分別加入mimics和mimics-nc50nm，再分別加入1.25μl的mimics或mimics-nc的儲(chǔ)存液，然后用無血清的rpmi1640培養(yǎng)液(美國(guó)gibico公司)補(bǔ)足至25μl；再取干凈的ep管，分別加入inhibitors和inhibitors-nc100nm，再分別加入2.5μl的inhibitors、inhibitors-nc的儲(chǔ)存液，然后用無血清的rpmi1640培養(yǎng)液(美國(guó)gibico公司)補(bǔ)足至25μl；

(4)entrancetm-r轉(zhuǎn)染試劑稀釋液的制備：取一個(gè)干凈ep管，加入相應(yīng)量的entrancetm-r轉(zhuǎn)染試劑(北京engreen公司)，根據(jù)mimics、mimics-nc、inhibitors、inhibitors-nc的量控制轉(zhuǎn)染試劑的用量，每50nm加入1μl轉(zhuǎn)染試劑，然后用無血清的1640培養(yǎng)基(美國(guó)gibico公司)補(bǔ)足至25μl，室溫靜置5min；

(5)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備：將entrancetm-r轉(zhuǎn)染試劑(北京engreen公司)稀釋液加入到相應(yīng)mimics、mimics-nc或者inhibitors、inhibitors-nc稀釋液中，然后立即充分混勻，室溫靜置30min；

(6)將50μl的轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加到步驟(2)中的接種細(xì)胞中，輕輕混勻；

(7)轉(zhuǎn)染6個(gè)小時(shí)后觀察細(xì)胞狀態(tài)，如果細(xì)胞狀態(tài)佳，則離心收集g-mdsc；

(8)按照實(shí)施例2中方法利用轉(zhuǎn)染了mimics或者inhibitors的g-mdsc制備過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes。

實(shí)施例7：驗(yàn)證過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes

(1)收集實(shí)施例6步驟(6)中各處理組1×10⁶個(gè)g-mdsc，按照實(shí)施例5步驟(3)中的方法提取各處理組g-mdsc的總rna，并檢測(cè)其濃度；

(2)按照實(shí)施例5中的方法對(duì)各處理組g-mdsc的mir-93-5p的含量進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，結(jié)果如圖12所示mir-93-5p的mimics或者inhibitors成功轉(zhuǎn)染到了g-mdsc。

(3)收集實(shí)施例6步驟(8)中各處理組每3×10⁷個(gè)g-mdsc分泌的g-exosomes，用1ml的trizol(美國(guó)invitrogen公司)溶解。

(4)按照實(shí)施例5中操作方法對(duì)各組g-exosomes包含的mir-93-5p進(jìn)行定量分析，如圖13所示轉(zhuǎn)染了mir-93-5p的mimics的g-mdsc分泌的g-exosomes中相對(duì)于mimics-nc組mir-93-5p的表達(dá)量顯著提高(p<0.01)，而轉(zhuǎn)染了mir-93-5p的inhibitors的g-mdsc分泌的g-exosomes中相對(duì)于inhibitors-nc組mir-93-5p的表達(dá)量降低了(p<0.05)。這些結(jié)果說明本實(shí)施例成功提取了過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes，本實(shí)施例中制備的過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes相對(duì)于原有的g-exosomes相比，mir-93-5p的含量大約增加了15倍。

實(shí)施例8：g-exosomes裝載的mir-93-5p可以體外抑制th17細(xì)胞的分化

(1)在th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系中加入60μg/ml過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes，如圖14所示，過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes處理組(轉(zhuǎn)染mimics組)相對(duì)于mimics-nc組th17細(xì)胞的比例明顯降低了(p<0.01)，而阻斷mir-93-5p的g-exosomes處理組(轉(zhuǎn)染inhibitors組)相對(duì)于inhibitors-nc組th17細(xì)胞的比例增高了(p<0.05)。這些結(jié)果表明g-exosomes攜帶的mir-93-5p可以體外抑制th17細(xì)胞的分化，并且過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes對(duì)于th17細(xì)胞分化的抑制能力更強(qiáng)。本實(shí)施例中過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes相對(duì)于原有的g-exosomes相比對(duì)于th17細(xì)胞分化的抑制能力更強(qiáng)，th17細(xì)胞的比例減少了一倍。

(2)根據(jù)實(shí)施例5中操作方法檢測(cè)過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes處理后th17誘導(dǎo)體系中細(xì)胞的mir-93-5p的表達(dá)量，如圖15所示，過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes處理組與mimics-nc組相比較，可以使誘導(dǎo)細(xì)胞mir-93-5p表達(dá)水平明顯提高(p<0.01)，阻斷mir-93-5p的g-exosomes處理組mir-93-5p表達(dá)水平相對(duì)于inhibitors-nc組則顯著降低了(p<0.001)。這些結(jié)果說明g-exosomes可以將其攜帶的mir-93-5p傳遞到受體細(xì)胞，從而發(fā)揮抑制功能，并且本發(fā)明制備的過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes傳遞mir-93-5p的效率更高。

實(shí)施例9：g-exosomes裝載的mir-93-5p可以更加有效的抑制cia模型小鼠的發(fā)病，緩解疾病的嚴(yán)重程度

(1)利用實(shí)施例4中構(gòu)建的cia模型小鼠；

(2)在第一次免疫后第18天和第24天對(duì)cia模型小鼠進(jìn)行尾靜脈注射過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes。

(3)實(shí)驗(yàn)分組：

pbs緩沖液組：分別在免疫的第18天和24天對(duì)每只小鼠尾靜脈注射pbs100μl；

g-exosomes組：分別在免疫的第18天和24天對(duì)每只小鼠尾靜脈注射100μl的pbs溶解的g-exosomes；

mimics-nc-exosomes組：分別在免疫的第18天和24天對(duì)每只小鼠尾靜脈注射100μlpbs溶解的轉(zhuǎn)染mimic-nc后g-mdsc分泌的g-exosomes；

mimics-exosomes組：分別在免疫的第18天和24天對(duì)每只小鼠尾靜脈注射100μl的pbs溶解的轉(zhuǎn)染mimic后g-mdsc分泌的g-exosomes；

inhibitors-nc-exosomes組：分別在免疫的第18天和24天對(duì)每只小鼠尾靜脈注射100μl的pbs溶解的轉(zhuǎn)染inhibitors-nc后g-mdsc分泌的g-exosomes；

inhibitors-exosomes組：分別在免疫的第18天和24天對(duì)每只小鼠尾靜脈注射100μl的pbs溶解的轉(zhuǎn)染inhibitors后g-mdsc分泌的g-exosomes。

上述各組中，100μlpbs中溶解100μg不同處理組的g-exosomes。

(4)如圖16所示，mimics-exosomes處理組小鼠的平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)相對(duì)mimics-nc-exosomes處理組明顯降低(p<0.05)，inhibitors-exosomes處理組小鼠的平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)相對(duì)inhibitors-nc-exosomes處理組顯著升高(p<0.01)。如圖17所示，g-exosomes、mimics-nc-exosomes、mimics-exosomes、inhibitors-nc-exosomes組小鼠的足趾只有輕度的紅腫，關(guān)節(jié)活動(dòng)正常；然而pbs緩沖液組、inhibitors-exosomes組小鼠的足趾大多紅腫明顯，關(guān)節(jié)活動(dòng)受限。如圖18所示，g-exosomes、mimics-nc-exosomes、mimics-exosomes、inhibitors-nc-exosomes組小鼠的足趾關(guān)節(jié)處骨結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，關(guān)節(jié)間隙相對(duì)正常，少有炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)；然而pbs緩沖液組、inhibitors-exosomes組小鼠的足趾關(guān)節(jié)處骨結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，關(guān)節(jié)間隙減小，有大量炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)。這些結(jié)果表明g-exosomes攜帶的mir-93-5p可以抑制cia模型小鼠的發(fā)病，緩解疾病的嚴(yán)重程度，并且過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes對(duì)cia模型小鼠具有更強(qiáng)的保護(hù)作用。

本實(shí)施例中過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes相對(duì)于原有的g-exosomes相比對(duì)于cia小鼠的保護(hù)作用更強(qiáng)，相對(duì)于原有的g-exosomes，過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes處理小鼠的平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)下降了接近一倍，足趾腫脹程度明顯減輕，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)更加完整。

(5)分離各組小鼠腘窩淋巴結(jié)，制備單細(xì)胞懸液，如圖19所示流式細(xì)胞術(shù)分析各組小鼠腘窩淋巴結(jié)細(xì)胞中th17細(xì)胞比例，mimics-exosomes處理組小鼠的腘窩淋巴結(jié)細(xì)胞中th17細(xì)胞比例相對(duì)于mimics-nc-exosomes處理組顯著降低(p<0.01)，inhibitors-exosomes處理組相對(duì)于inhibitors-nc-exosomes處理組th17細(xì)胞比例顯著升高(p<0.001)，另外pbs處理組與mimics-nc-exosomes處理組或者inhibitors-nc-exosomes處理組相比無明顯差異(p>0.05)。如圖20所示qrt-pcr檢測(cè)各組小鼠引流淋巴結(jié)cd4⁺t細(xì)胞mir-93-5p的表達(dá)量，mimics-exosomes處理組小鼠引流淋巴結(jié)cd4⁺t細(xì)胞mir-93-5p的表達(dá)量相對(duì)于mimics-nc-exosomes處理組顯著升高(p<0.01)，inhibitors-exosomes處理組相對(duì)于inhibitors-nc-exosomes處理組mir-93-5p的表達(dá)量明顯降低(p<0.01)，另外pbs緩沖液組與mimics-nc-exosomes處理組或者inhibitors-nc-exosomes處理組相比無明顯差異(p>0.05)。這些結(jié)果說明g-exosomes可以通過運(yùn)輸mir-93-5p到受體細(xì)胞，抑制cia模型小鼠引流淋巴結(jié)致病性th17細(xì)胞的比例，緩解疾病的嚴(yán)重程度，并且本發(fā)明制備的過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes具有更高的運(yùn)輸mir-93-5p的效率，對(duì)于cia模型小鼠的保護(hù)作用也更強(qiáng)。

本實(shí)施例中過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes相對(duì)于原有的g-exosomes相比對(duì)于cia小鼠的保護(hù)作用更強(qiáng)，相對(duì)于原有的g-exosomes，過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes處理小鼠腘窩淋巴結(jié)細(xì)胞中th17細(xì)胞的比例下降了一倍，致病性th17細(xì)胞比例的減少對(duì)于抑制cia小鼠的發(fā)病至關(guān)重要。

實(shí)施例10：g-exosomes裝載的mir-93-5p可以降低靶標(biāo)蛋白stat3的表達(dá)

(1)根據(jù)targetscan網(wǎng)站分析，如圖21所示，mir-93-5p可以與靶標(biāo)基因stat3的3’utr區(qū)域的248-254、495-501兩個(gè)區(qū)域特異性結(jié)合。

(2)收集過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes處理后th17誘導(dǎo)體系中的細(xì)胞，westernblot檢測(cè)各處理組細(xì)胞stat3的表達(dá)水平，如圖22所示，過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes處理組相對(duì)于mimics-nc組stat3的表達(dá)水平降低了(p<0.05)，而阻斷mir-93-5p的g-exosomes處理組相對(duì)于inhibitors-nc組stat3的表達(dá)水平增高了(p<0.05)。這些結(jié)果表明g-exosomes攜帶的mir-93-5p可以抑制受體細(xì)胞stat3的表達(dá)，從而抑制th17細(xì)胞的分化，本發(fā)明制備的過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes具有更強(qiáng)的抑制靶標(biāo)蛋白stat3表達(dá)的作用，從而發(fā)揮更強(qiáng)的免疫抑制功能。本發(fā)明制備的過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes具有更強(qiáng)的抑制靶標(biāo)蛋白stat3表達(dá)的作用，相對(duì)于原有g(shù)-exosomes相比，stat3表達(dá)水平下降了一倍，從而發(fā)揮更強(qiáng)的抑制th17細(xì)胞分化的功能。

(3)收集過表達(dá)或阻斷mir-93-5p的g-exosomes處理后cia模型小鼠引流淋巴結(jié)cd4⁺t細(xì)胞，westernblot檢測(cè)各處理組細(xì)胞stat3的表達(dá)水平，如圖23所示，過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes處理組相對(duì)于mimics-nc組stat3的表達(dá)水平明顯降低了(p<0.01)，而阻斷mir-93-5p的g-exosomes處理組相對(duì)于inhibitorss-nc組stat3的表達(dá)水平增高了(p<0.05)。這些結(jié)果說明g-exosomes攜帶的mir-93-5p可以在cia模型小鼠體內(nèi)外降低受體細(xì)胞靶標(biāo)蛋白stat3的表達(dá)，并且本發(fā)明制備的過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes具有更強(qiáng)的抑制靶標(biāo)蛋白stat3表達(dá)的能力，從而對(duì)cia模型小鼠發(fā)揮更強(qiáng)的保護(hù)作用。本發(fā)明制備的過表達(dá)mir-93-5p的g-exosomes具有更強(qiáng)的抑制靶標(biāo)蛋白stat3表達(dá)的能力，相對(duì)于原有g(shù)-exosomes相比，stat3表達(dá)水平下降了近2倍，從而對(duì)cia模型小鼠發(fā)揮更強(qiáng)的保護(hù)作用。