本發(fā)明屬于復(fù)合生物材料合成技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于觀察骨細胞與骨科藥物相互作用的光學(xué)平臺的制作技術(shù)。

背景技術(shù)：

羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）是人體骨骼的最主要組成部分。水熱法合成的羥基磷灰石不但具有納米級的晶型針狀結(jié)構(gòu)，同時又具有非常好的生物相容性，在醫(yī)學(xué)支撐材料領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用價值。人工合成的羥基磷灰石粉末樣品具有特殊的表面性能、生物活性、生物降解性、骨傳導(dǎo)性、非免疫原性等優(yōu)點，植入人體后，在體液的作用下，鈣和磷游離出材料表面，并與人體骨組織形成化學(xué)鍵合，參與新組織的形成，并且其在各種磷酸鈣中是熱力學(xué)最穩(wěn)定的形態(tài)，故使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景，已成為國內(nèi)外生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的主要課題之一。

如今科研領(lǐng)域用到的細胞培養(yǎng)的容器大多數(shù)在追求細胞后期生長觀察的時候，忽略了細胞培養(yǎng)板對細胞生長的促進作用。很多人都在考慮通過在細胞生長表面涂抹一層羥基磷灰石來提高細胞的生長活性。羥基磷灰石的涂膜技術(shù)有很多種，如電鍍噴涂技術(shù)，溶膠凝膠法涂膜和水熱法涂膜等。其中以水熱法為比較常用的涂膜手段，通過調(diào)節(jié)pH，反應(yīng)濃度和水熱溫度來控制羥基磷灰石薄膜性能。特別是一些光學(xué)基底在涂膜過羥基磷灰石薄膜后，不僅能使細胞在基底表面快速生長，同時也有利于光學(xué)顯微鏡的觀察。

現(xiàn)在醫(yī)療植入材料領(lǐng)域主要是以合金材料為主，但是這些材料的生物相容性很差，如果和羥基磷灰石結(jié)合在一起后，可獲得生物相容性和機械性能都兼得的植入材料。專利文獻 CN 100356991C 介紹了一種在醫(yī)用材料上進行涂膜羥基磷灰石薄膜的方法，先配好的羥基磷灰石懸濁液，然后通過提拉法，溶膠凝膠法和噴涂法等方法將羥基磷灰石均勻的涂抹到基底上。但是這個材料在實驗初期沒法用光學(xué)顯微鏡觀察細胞的長勢和狀態(tài)等，在材料應(yīng)用前期的檢驗階段，產(chǎn)生了很大的不便利。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在介紹一種用于觀察骨細胞的光學(xué)平臺的制備方法，以方便觀察細胞在羥基磷灰石表面生長分化的情況。

本發(fā)明包括步驟如下：

1）在磁力攪拌下，將磷源溶解在去離子水中，制得磷源溶液；

2）在磁力攪拌下，將鈣鹽溶解于去離子水中，制得鈣源溶液；

3）磁力攪拌條件下，將磷源溶液和鈣源溶液混合進行反應(yīng)，獲得羥基磷灰石懸濁液；

4） 將光學(xué)基底放于聚四氟乙烯內(nèi)襯中，并向內(nèi)襯中加入所述羥基磷灰石懸濁液；然后放入高壓反應(yīng)釜中，在180℃的溫度環(huán)境下進行水熱反應(yīng)12～36h，水熱反應(yīng)完成后冷卻至室溫，取得用于觀察骨細胞的光學(xué)平臺。

本發(fā)明在光學(xué)基底上通過水熱法涂膜羥基磷灰石薄膜的方法，這些涂膜后的基底材料可以用來方便地觀察細胞在羥基磷灰石表面生長分化的情況，同時可以觀察人類骨細胞與骨科藥物的相互作用。

進一步地，本發(fā)明所述磷源為磷酸二氫銨，或磷酸氫銨鈉。該磷源可溶于水，方便反應(yīng)的進行。

所述鈣鹽為硝酸鈣。用硝酸鈣作為本發(fā)明工藝中的鈣鹽可溶于水，方便反應(yīng)的進行。

所述磷源溶液和鈣源溶液混合時，鈣源和磷源的摩爾比為1.67∶1。該投料比可節(jié)約原料，盡量減少造成的污染和浪費。

步驟3）中混合反應(yīng)時，以氨水調(diào)節(jié)體系的pH值為9～11，可使反應(yīng)體系呈堿性，可以形成羥基磷灰石。

另外，采用氨水調(diào)節(jié)體系的pH值優(yōu)點是：氨水易揮發(fā)，易溶解，方便后期樣品洗滌的工作。

本發(fā)明還以超聲水洗冷卻至室溫的水熱反應(yīng)樣品，然后置于40～45℃條件下烘干。超聲水洗可去除表面附著不穩(wěn)的羥基磷灰石，40～45℃條件下烘干可以降低能耗，且不改變納米粒子的晶型。

附圖說明

圖1為涂布和未涂布羥基磷灰石的光學(xué)平臺的透明度水平比較圖片。

圖2為在玻璃基板上稀釋4倍下合成的羥基磷灰石膜的低倍和高倍率顯微照片。

圖3為在原始濃度為0,1 / 2,1 / 4,1倍的平板玻璃上的羥基磷灰石超薄膜在300?600nm波長處的透射率。

圖4為羥基磷灰石結(jié)構(gòu)的紅外圖譜。

圖5為羥基磷灰石結(jié)構(gòu)的XRD圖譜。

圖6為羥基磷灰石結(jié)構(gòu)的拉曼圖譜。

圖7為在玻璃表面培養(yǎng)3天并在白光下觀察的MG-63細胞的活性圖。

圖8為在玻璃系表面培養(yǎng)4天的MG-63細胞的ALP活性圖。

圖9為具有HA涂層的玻璃增強的成骨細胞礦化現(xiàn)象圖。

圖10為HA涂層玻璃化增強的骨細胞樹突狀網(wǎng)絡(luò)形成現(xiàn)象圖。

圖11為HA涂層玻璃促進破骨細胞形成和引發(fā)破骨細胞吸收現(xiàn)象圖。

具體實施方式

一、制備工藝：

實施案例1

稱取0.5968g 四水硝酸鈣用50mL去離子水完全溶解，得到硝酸鈣溶液。

稱取0.1996g 磷酸氫二銨同樣用50mL去離子水完全溶解，得到磷酸二氫銨溶液。

磁力攪拌條件下，將磷酸二氫銨溶液緩慢加入到硝酸鈣溶液中進行反應(yīng)，在加入的過程中通過氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH=10，得到的白色羥基磷灰石懸濁液。

將處理好的玻璃基底放于聚四氟乙烯反應(yīng)內(nèi)襯中后，向內(nèi)襯中加入羥基磷灰石懸濁液。

將高壓反應(yīng)釜放于烘箱中在180℃溫度條件下水熱反應(yīng)24h，待反應(yīng)結(jié)束冷卻到室溫后，樣品超聲水洗5min洗去表面附著不穩(wěn)的羥基磷灰石，最后水洗，并且在45℃條件下烘干即可。

實施案例2

稱取0.2984g 四水硝酸鈣用去50mL去離子水完全溶解，得到硝酸鈣溶液。

稱取0.0998g 磷酸氫二銨同樣用50mL去離子水完全溶解，得到磷酸二氫銨溶液。

磁力攪拌條件下，將磷酸二氫銨溶液緩慢加入到硝酸鈣溶液中進行反應(yīng)，在加入的過程中通過氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH=10，得到的白色羥基磷灰石懸濁液。

將處理好的玻璃基底放于聚四氟乙烯反應(yīng)內(nèi)襯中后，向內(nèi)襯中加入羥基磷灰石懸濁液。

將高壓反應(yīng)釜放于烘箱中在180℃溫度條件下水熱反應(yīng)24h，待反應(yīng)結(jié)束冷卻到室溫后，樣品超聲水洗5min洗去表面附著不穩(wěn)的羥基磷灰石，最后水洗，并且在45℃條件下烘干即可。

實施案例3

稱取0.1492g四水硝酸鈣用去50mL去離子水完全溶解，得到硝酸鈣溶液。

稱取0.0449g 磷酸氫二銨同樣用50mL去離子水完全溶解，得到磷酸二氫銨溶液。

磁力攪拌條件下，將磷酸二氫銨溶液緩慢加入到硝酸鈣溶液中進行反應(yīng)，在加入的過程中通過氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH=10，得到的白色羥基磷灰石懸濁液。

將處理好的玻璃基底放于聚四氟乙烯反應(yīng)內(nèi)襯中后，向內(nèi)襯中加入羥基磷灰石懸濁液。

將高壓反應(yīng)釜放于烘箱中在180℃溫度條件下水熱反應(yīng)24h，待反應(yīng)結(jié)束冷卻到室溫后，樣品超聲水洗5min洗去表面附著不穩(wěn)的羥基磷灰石，最后水洗，并且在45℃條件下烘干即可。

實施案例4

稱取0.1492g四水硝酸鈣用去50mL去離子水完全溶解，得到硝酸鈣溶液。

稱取0.0449g 磷酸氫銨鈉同樣用50mL去離子水完全溶解，得到磷酸氫銨鈉溶液。

磁力攪拌條件下，將磷酸氫銨鈉溶液緩慢加入到硝酸鈣溶液中進行反應(yīng)，在加入的過程中通過氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH=10，得到的白色羥基磷灰石懸濁液。

將處理好的玻璃基底放于聚四氟乙烯反應(yīng)內(nèi)襯中后，向內(nèi)襯中加入羥基磷灰石懸濁液。

將高壓反應(yīng)釜放于烘箱中在180℃溫度條件下水熱反應(yīng)24h，待反應(yīng)結(jié)束冷卻到室溫后，樣品超聲水洗5min洗去表面附著不穩(wěn)的羥基磷灰石，最后水洗，并且在50℃條件下烘干即可。

注：以上各例中玻璃基底的預(yù)處理方法是通過柔和洗滌劑和純水的反復(fù)沖洗，以得到潔凈的玻璃基底。

二、本發(fā)明的方法獲得的涂膜后的基底材料效果分析：

從圖1的涂布和未涂布羥基磷灰石的光學(xué)平臺的透明度水平比較圖片可以看出：涂覆羥基磷灰石的玻璃基底透光性良好。

如圖2所示，在180℃，4倍稀釋濃度下水熱反應(yīng)24小時后，通過SEM圖像清楚地顯示在基材上形成的羥基磷灰石膜的表面形態(tài)。在圖2中，在視圖中用羥基磷灰石顆粒在玻璃表面上均勻地制備了羥基磷灰石涂層，并且發(fā)現(xiàn)合成的羥基磷灰石涂層由直徑在80nm至100nm之間的羥基磷灰石顆粒組成。

合成后使用不同濃度的溶液形成羥基磷灰石涂層，通過紫外分光光度計研究樣品的波長在300nm和600nm之間的透射率；結(jié)果如圖3所示。在圖3中，顯示沒有羥基磷灰石涂層的片狀玻璃具有最高的透射率，而隨著溶液濃度的增加，在300nm和600nm之間的波長的透射率逐漸降低，并且在初始濃度時透射率降低到70％。

通過紅外表征分子結(jié)構(gòu)，表征結(jié)果如圖4所示。羥基磷灰石涂層的FTIR光譜如圖4所示。在圖4中，963cm^-1處的吸收峰是磷酸根的對稱伸縮振動峰，1030cm^-1和1088cm^-1處的峰歸屬于磷酸根的不對稱伸縮振動峰，而563cm^-1和603cm^-1為磷酸根的反對稱伸縮振動峰。在圖5中，在1500-1400cm^-1區(qū)域的峰歸因于C-O（υ3）的反對稱伸縮振動。總體上，這些峰基本上符合羥基磷灰石的標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜。關(guān)于羥基磷灰石薄膜的進一步研究通過拉曼（圖5），磷酸根的特征峰出現(xiàn)在959.4cm^-1，以及出現(xiàn)在3568.3cm^-1的峰歸屬于OH-。

合成的超薄羥基磷灰石涂層的XRD圖案示于圖6中。通過水熱合成的羥基磷灰石涂層的衍射峰包括（200），（111），（002），（102），（210），（211），（300），（202），（310） ，（213），（004）。并且羥基磷灰石涂層的所有這些衍射峰可以在純HAp的標(biāo)準(zhǔn)圖譜中找到，其表明涂層是羥基磷灰石，合成的HA也具有良好的晶體結(jié)構(gòu)。

三、采用本發(fā)明的方法獲得的涂膜后的基底材料用來觀察骨細胞在羥基磷灰石表面生長分化的情況：

圖7至8中通過倒置顯微鏡觀察在片材上培養(yǎng)的MG-63是為了研究羥基磷灰石超薄涂層對由不同材料制成的片材的透明度的影響。使用倒置顯微鏡可以清楚地觀察到細胞的形態(tài)，其中細胞生長良好并且在制備或不制備羥磷灰石超薄涂層的情況下在片材上保持良好的形態(tài)。這表明羥基磷灰石超薄涂層不降低玻璃板的透明度。

如圖9所示，在顯微鏡下觀察到更多的ALP陽性結(jié)節(jié)。統(tǒng)計分析顯示HA涂層增強的成骨細胞礦化4%。成骨細胞相關(guān)基因表達的進一步qPCR證實HA包被的玻璃組中成骨細胞基因表達的倍數(shù)增加。

如圖10所示，HA涂覆的玻璃上的骨細胞形成比未涂覆的玻璃上的骨細胞更多和更長的樹突過程。

如圖11所示，在HA涂覆的玻璃中觀察到的TRAP陽性破骨細胞比未涂覆的玻璃多。 在未包衣組中有約100個TRAP陽性破骨細胞，但在HA包衣組中有150個TRAP陽性破骨細胞。 此外，破骨細胞特異性基因的表達也在HA包被組中增強。我們注意到很多針狀HA顆粒被吸收到破骨細胞中。 另外的共聚焦圖像也證實了這些HA顆粒被成熟破骨細胞吸收。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)，對以上實施例所作的任何簡單的修改、等同替換與改進等，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍之內(nèi)。