一種NtHMA4基因突變體的制備方法與應用與流程

文檔序號：11145327閱讀：1029來源：國知局

本發明屬于遺傳工程技術領域，具體涉及一種NtHMA4突變體的制備方法與應用。

背景技術：

鎘( Cd)、砷( As) 、鉻( Cr) 、汞( Hg)和鉛( Pb) 等是公認的對植物和人體危害比較大的重金屬元素，植物必需微量元素鋅( Zn) 、鎳( Ni) 、銅( Cu)等如果過量也會產生危害。所以，關于作物重金屬污染及其降低方法的研究越來越引起科研人員的重視。煙草（Nicotiana tabacum）是重要的經濟作物，是茄科一年生草本植物。近年來關于煙草中重金屬的研究也逐漸成為煙草減害研究的一個熱點。

重金屬對煙草品質會產生不利影響。煙堿含量是衡量煙葉品質的一個重要指標，在一定范圍內提高煙堿有利于煙葉品質的提高，Cd 污染會降低煙葉煙堿含量，可能原因是根合成煙堿途徑或者煙堿向上部轉運過程受阻。另外，煙葉中可溶性糖對Cd、Pb極為敏感，輕度污染就會導致其含量明顯下降，這可能是由于重金屬破壞了煙草葉綠體，光合作用受阻引起的。重金屬會導致煙葉糖堿比和氮堿比升高，化學成分組成失衡，品質受到影響。

重金屬對人體的危害巨大，如過量的鎘進入人體內可能對血管造成損害；另外鎘元素對腸道吸收鐵具有抑制作用，還會干擾鈷、銅、鋅等微量元素的代謝過程，引起肺、腎、肝等人體臟器損害，最終可能導致致癌、致畸和致突變等作用。砷可以誘發許多疾病，如急性砷中毒可造成中樞神經系統障礙導致全身麻木、呼吸道和消化道病變甚至快速死亡；慢性砷中毒導致神經系統紊亂、全身乏力、食欲減退、惡心以及皮膚色素沉著和角化病等皮膚病變等，而且可以引起肺癌、皮膚癌和膀胱癌等疾病。鋅元素是人體的重要的微量元素之一，對人體的生長發育、智力、免疫功能甚至是視力都有至關重要的作用。但是人體中的鋅不是越多越好。人體攝入過量的鋅，在胃液中易轉化成氯化鋅，對胃黏膜有較強的腐蝕性，可致胃黏膜充血、水腫、甚至出血。過量的血鋅會抑制白細胞的吞噬功能，是人體抵抗力下降，易受病菌感染。過量的鋅還會影響人體其他無機鹽的吸收與代謝，如影響鐵的吸收，使肝臟中鐵代謝受損成銅/鋅比值過高；影響膽固醇代謝，形成高膽固醇血癥等。鎳及其鹽類的毒性較低，但由于它本身具有生物化學活性，故能激活或抑制一系列的酶（精氨酸酶、羧化酶、酸性磷酸酶和拓脫羧酶）而發揮其毒性。鎳可引起接觸性皮炎。直接進入血液的鎳鹽毒性較高，膠體鎳或氯化鎳毒性較大，可引起中樞性循環和呼吸紊亂，使心肌、腦、肺和腎出現水腫、出血和變性。

煙草是我國重要的經濟作物，重金屬污染不僅影響煙草本身生長發育，對吸食者的的健康也具有嚴重的威脅。減害一直是煙草科研工作的一個重要方向，其中降低重金屬含量是一個重要的公關目標。

技術實現要素：

本發明的第一目的在于提供一種NtHMA4基因的EMS突變體；第二目的在于提供所述的NtHMA4基因突變體的應用。

本發明的第一目的是這樣實現的，與野生型煙草的NtHMA4基因具有如序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列相比，突變體含有的NtHMA4基因序列152位的C突變為T，使該基因編碼蛋白序列第51位氨基酸由蘇氨酸（Thr）突變為異亮氨酸（Ile）。

所述的NtHMA4基因的EMS突變體的制備方法包括EMS誘變和TILLING篩選突變體。

EMS誘變煙草種子：

A ：利用漂白水處理煙草種子，然后旋轉離心并濾干；

B ：對種子進行漂洗，清除漂白水，使種子不受漂白劑化學成分影響，然后進行旋轉離心濾干；

C ：將種子放在10℃ ~30℃溫度下的去離子水中浸泡10~15小時，煙草種子催芽萌發，以利種子均勻誘變處理，然后進行旋轉離心濾干；

D ：將種子放在0.5%的EMS （甲基磺酸乙酯）誘變劑溶液中浸泡處理10~15個小時，然后進行旋轉離心濾干；

E ：將種子放在漂洗劑溶液中漂洗，再用去離子水沖洗，反復進行5~8 次此過程，然后布氏漏斗濾紙過濾干燥。

TILLING篩選核苷酸變化的突變體

A ：誘變處理后的種子（M1代）播種與大田，單株套袋自交收種獲得M2代，每個M1代單株收獲的M2代種子播種1粒種子。

B：取M2代突變體單株葉片利用QIAGEN DNA提取試劑盒提取突變體材料葉片DNA。

C：樣品濃度測定及建池

將樣品按照順序大小排列。分別取2ul DNA樣品16通道 Tecan infinite M200儀器上進行濃度測定。將所有的樣品濃度稀釋至40ng/ul，制作8倍DNA池用于TILLING分析。

D: 利用Primer3設計NtHMA4基因TILLING分析引物，

HMA4-F：TAGAGTGTAGAGGAAAAATAGAAAGAAGAG和

HMA4-R： ATAAGCTGAGAGCTTAAGAAAAAAGAAACT，擴增長度為500bp左右。

E:TILLING分析 M2代突變體，篩選核苷酸突變的單株，并進行測序驗證，獲得一個突變體，其CDS的152位的C突變為T，使該基因編碼蛋白序列第51位氨基酸由蘇氨酸（Thr）突變為異亮氨酸（Ile）。

F:在M3代突變體篩選突變位點純合的植株，自交收種。

G:對純合突變體進行鎘吸收試驗，具體為在煙株現蕾期，將100μmol CdCL₂溶液500mL澆于煙株根部。5天后取葉片，殺青烘干，檢測重金屬含量。

H: 含有突變序列的煙草相比含有SEQ ID NO:1序列的煙草葉片鎘含量降低50%左右；銅、鋅、鎳降低40%左右；鐵、錳降低30%左右；鉛、鉻降低20%左右。

本發明的第二目的是這樣實現的，NtHMA4基因突變體可以使煙葉鎘含量降低40~60%；銅、鋅、鎳降低30~50%；鐵、錳降低20~40%；鉛、鉻降低10~30%。即以所述的NtHMA2基因突變體獲得低重金屬含量的煙草。

附圖說明

圖1 為突變體突變位點測序峰圖；

圖2為本發明NtHMA4突變體與對照葉片鎘含量對比示意圖；

圖3為本發明NtHMA4突變體與對照葉片銅含量對比示意圖；

圖4為本發明NtHMA4突變體與對照葉片鋅含量對比示意圖；

圖5為本發明NtHMA4突變體與對照葉片鐵含量對比示意圖；

圖6為本發明NtHMA4突變體與對照葉片錳含量對比示意圖；

圖7為本發明NtHMA4突變體與對照葉片鉛含量對比示意圖；

圖8為本發明NtHMA4突變體與對照葉片鉻含量對比示意圖；

圖9為本發明NtHMA4突變體與對照葉片鎳含量對比示意圖。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基于本發明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發明的保護范圍。

與野生型煙草的NtHMA4基因具有如序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列相比，突變體含有的NtHMA4基因序列152位的C突變為T，使該基因編碼蛋白序列第51位氨基酸由蘇氨酸（Thr）突變為異亮氨酸（Ile）。

NtHMA4基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示；

NtHMA4基因突變體的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；

NtHMA4基因突變體編碼的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示；

所述的NtHMA4基因的EMS突變體的制備方法包括EMS誘變和TILLING篩選突變體。

EMS誘變煙草種子：

A ：利用漂白水處理煙草種子，然后旋轉離心并濾干；

B ：對種子進行漂洗，清除漂白水，使種子不受漂白劑化學成分影響，然后進行旋轉離心濾干；

C ：將種子放在10℃ ~30℃溫度下的去離子水中浸泡10~15小時，煙草種子催芽萌發，以利種子均勻誘變處理，然后進行旋轉離心濾干；

D ：將種子放在0.5%的EMS （甲基磺酸乙酯）誘變劑溶液中浸泡處理10~15個小時，然后進行旋轉離心濾干；

E ：將種子放在漂洗劑溶液中漂洗，再用去離子水沖洗，反復進行5~8 次此過程，然后布氏漏斗濾紙過濾干燥。

TILLING篩選核苷酸變化的突變體

A ：誘變處理后的種子（M1代）播種與大田，單株套袋自交收種獲得M2代，每個M1代單株收獲的M2代種子播種1粒種子。

B：取M2代突變體單株葉片利用QIAGEN DNA提取試劑盒提取突變體材料葉片DNA。

C：樣品濃度測定及建池

將樣品按照順序大小排列。分別取2ul DNA樣品16通道 Tecan infinite M200儀器上進行濃度測定。將所有的樣品濃度稀釋至40ng/ul，制作8倍DNA池用于TILLING分析。

D: 利用Primer3設計NtHMA4基因TILLING分析引物，

HMA4-F：TAGAGTGTAGAGGAAAAATAGAAAGAAGAG和

HMA4-R： ATAAGCTGAGAGCTTAAGAAAAAAGAAACT，擴增長度為500bp左右。

F:在M3代突變體篩選突變位點純合的植株，自交收種。

G:對純合突變體進行鎘吸收試驗，具體為在煙株現蕾期，將100μmol CdCL₂溶液500mL澆于煙株根部。5天后取葉片，殺青烘干，檢測重金屬含量。

H: 含有突變序列的煙草相比含有SEQ ID NO:1序列的煙草葉片鎘含量降低50%左右；銅、鋅、鎳降低40%左右；鐵、錳降低30%左右；鉛、鉻降低20%左右。

下面以具體實施案例對本發明做作進一步說明：

所述的NtHMA4突變體的制備方法，未突變NtHMA4突變體的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示，突變體的核苷酸序列152位的C突變為T，具體制備方法包括以下步驟：

（1）選用50% 漂白水處理云煙87種子6 分鐘，離心濾干；

（2）利用去離子對種子進行漂洗1 分鐘，離心濾干去除漂白水成分；

（3）室溫條件，去離子水浸泡煙草種子10-12 小時，離心濾干；

（4）室溫條件，0.50%EMS 甲基磺酸乙酯處理煙草種子12 小時，離心濾干；

（5）加入去離子水漂洗1 分鐘，離心濾干，共重復漂洗８次。然后布氏漏斗濾紙過濾干燥。

（6）誘變處理后的種子（M1代）播種與大田，單株套袋自交收種獲得M2代，每個M1代單株收獲的M2代種子播種1粒種子，共獲得1842個M2代單株。

（7）取M2代突變體單株葉片利用QIAGEN DNA提取試劑盒提取突變體材料葉片DNA。具體步驟如下：將樣品液氮研磨，并用1.5ml離心管收取；加入400ul的AP1溶液，4ul的RNA酶混勻；把樣品放入65℃水浴鍋水浴10min，期間搖勻3次；往樣品中加入130ul P3溶液，冰浴5mim；高速離心，13200rpm，5min；取上層液倒入紫色過濾柱，13200rpm，2min離心；將濾液轉入新的1.5mL離心管并加入675ul的AW1溶液混勻;把混勻樣品溶液分2次轉入淡黃色過濾柱并進行10000rpm，1min離心，棄除濾液；把淡黃色過濾柱放入新的2ml離心管中并加入500ul的AW2溶液，進行10000rpm，1min離心，棄濾液 (此步驟重復兩次)；再把棄除濾液的淡黃色過濾柱進行空轉（10000rpm，1min），將空轉好的淡黃色過濾柱放入新的1.5ml離心管中加入50ul AE溶液后靜置5min，放入離心機進行10000rpm，1min離心，去除淡黃色過濾柱，放入4℃冰箱保存。

（8）樣品濃度測定及建池

將樣品按照順序大小排列。分別取2ul DNA樣品16通道 Tecan infinite M200儀器上進行濃度測定。將所有的樣品濃度稀釋至40ng/ul，制作8倍DNA池用于TILLING分析。

（9）利用Primer3設計NtHMA4基因TILLING分析引物，

HMA4-F：TAGAGTGTAGAGGAAAAATAGAAAGAAGAG和

HMA4-R： ATAAGCTGAGAGCTTAAGAAAAAAGAAACT，擴增長對為500bp左右。

（10）TILLING分析 M2代突變體，擴增體系為：1.0μl 10×buffer，0.8μl dNTP(2.5mM)，0.16 μl HMA4-F primer(10μM) ，0.16μl HMA4R primer (10uM)， 6.78 μl H₂O，1.0 μl DNA模板 (20ng/ul) 。反應程序為95℃ 3min，94℃ 30s，62℃ 30s，-1℃/循環，72℃ 1min，7個循環；94℃30s，58℃30s，72℃1min，40個循環，72℃5min；99℃ 10min；70℃20s, -0.3℃/循環, 70個循環，4℃保存。擴增產物通過毛細管電泳進行分析。

（10）篩選出的核苷酸突變的單株，進行測序驗證，獲得一個突變體，其NtHMA4基因CDS的152位的C突變為T，使該基因編碼蛋白序列第51位氨基酸由蘇氨酸（Thr）突變為異亮氨酸（Ile）。

（11）在M3代突變體中經過測序篩選突變位點純合的植株（圖1），自交收種。

本發明所述的制備的NtHMA4突變體的應用為NtHMA4突變體用于降低煙葉重金屬含量。

NtHMA4突變體降低煙葉重金屬含量的方法包括以下步驟：

（1）對純合突變體進行鎘吸收試驗，具體為在溫室種植純合突變體及野生型對照，煙株現蕾期，將100μmol CdCL₂溶液500mL澆于煙株根部，5天后取葉片，殺青烘干。利用煙草行業標準YC/T380-2010的方法檢測煙葉重金屬含量。

（2）含有突變序列的煙草相比含有SEQ ID NO:1序列的煙草葉片鎘含量降低50%左右；銅、鋅、鎳降低40%左右；鐵、錳降低30%左右；鉛、鉻降低20%左右。（表1，圖2~圖9）。

表1 煙葉重金屬含量

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省煙草農業科學研究院

<120> 一種NtHMA4基因突變體與應用

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4335

<212> DNA

<213> NtHMA4基因核苷酸

<400> 1

atggtggaaa gtgagaaaat gaatgacaca aagaatctga gcaagagcta ttttgatgtt 60

ttgggaattt gctgtacttc agaagttgtt cttgttgaaa aaattctcaa gaatcttgaa 120

ggggttaaag aggtttcagt aattgtcaca acaaagactg tcattgttat tcatgattct 180

ctcctcattt ctcagcaaca aattgttaaa gcattgaatc aagcaagatt agaagcaagt 240

ataagagtga aaggagagaa aaactaccaa aagaaatggc caagtccatt tgcaattggc 300

agtggaatat tgcttggact ctcatttttg aagtactttt ttgcaccttt ccaatggtta 360

gcacttgcag ctgttgcagt tgggattcct ccaattattt ttaggggtgt ggctgccgtg 420

cgaaacctca ctcttgacat caacattctt gttttaatag cagtgacggg atcaattgtt 480

ttacacgatt attgggaagc tggtactatt gtcttcttat tcaccattgc agaatggcta 540

gagtcaaggg caagtcacaa ggctactgct gctatgtcat cactggtcaa tatagtccct 600

ccaacagcag ttttagctga aagtggagaa gtcgtaaatg ttgatgaagt caagttgaat 660

agcattcttg ctgttaaagc tggtgaaact atacctattg atggagttgt aatggaaggg 720

gaatgtgacg tggacgagaa aacactgaca ggcgagtcgt ttccagtttc taagcaaata 780

gattcaacgg tctgggctgg cactacaaat ctaaatggct atatcagtgt taagactacg 840

gctttggctg aagattgtgc ggtggctagg atggcgcagc ttgtcgaaga tgctcagaac 900

aagaaatcaa aaacccaaag atacattgac aagtgtgcta aatattatac accagcaatt 960

gtggctatat cagcttcttt ggcaatagtt cctactgcat taagagttca caatcgaaat 1020

gagtggtatc gcttggcttt ggtcacgttg gtgagtgcat gtccgtgtgc acttgtgcta 1080

tctacaccag ttgccatgtg ttgtgcactt tctaaagcag caacgtccgg tcttctgttt 1140

aaaggagcag agtaccttga gactcttgct aaaatcaaaa tcatggcttt tgacaaaaca 1200

gggactataa ctagaggaga atttatggtg accgagttca agtctctggt tgatggtctt 1260

ggtctcaata cactgcttta ctgggtttca agtattgaga gcaagtcagg tcatccgatg 1320

gcagccgctc tggttgacta tgcacaatca aattccgttg agccaaagcc tgatagagtt 1380

gagcagtttc aaaattttcc tggtgaaggg atatttggaa gaattgatgg aatggaaatc 1440

tatgtcggga ataggaaaat ttcttcaaga gctggatgta ctacagtacc agaaatagag 1500

ggtgatagtt tccaaggaaa gtctgttgga tacatatttt tgggatcatc tcccgctgga 1560

attttcggtc tttccgatgt ttgtcgaatt ggtgtaaaag aagccatgag agagctgaag 1620

cagatgggta tcaaaaccgc gatgcttact ggtgattgtt atgcagctgc caaccatgtg 1680

caggatcagt taggtggagc tatggatgaa tttcaagcgg aactcttacc agaggacaag 1740

gcaacaatca tcaagggttt tcagaaggaa gctccaacag cgatgatagg cgacggcctt 1800

aatgatgctc ctgcattagc aacagctgac attggcatct caatgggcat ctctgggtca 1860

gctctcgcga aagaaacagg ccatgttata ctaatgacaa atgacatcgg aagaatacca 1920

aaagctgcac gtcttgctag aagagttcga aggaagattg ttgagaatat gattatatca 1980

gtcgttacaa aggccgccat agttgcattg gcaatagcag gttatccatt ggtttgggct 2040

gctgtcctcg cggatactgg gacatgcttg ctagtgatct tgaacagcat gctacttcta 2100

cgagtaggca cacacagaca tgggaaaaaa tgttgtagat ctgctactcc ttcgcatgct 2160

cccaaccaca aagacaaagc ttcttgttgc aagtcggaaa atgctccgca gctgtgttgc 2220

tctgatattg agtcacaaaa gaaatgtacg agtcaatcat gctcgtccga ggtgtgtgtt 2280

ccaagatgtc aacctgtctc ctcgggatca aagtcatgtg gaaataatca gtgcccagac 2340

tccgttgaaa atagtggttt tcattctcat ccccgtcctc aatgctgctc gtcgaagatg 2400

gcttctaaag catgccaatc tgcagtttca gaatcaaagt catgtggaaa taatcagtgc 2460

ccagactccg ttgaaaatag tggttttcat tctcatcccc gccctcaatg ctgctcgtct 2520

aagatggctt ctaaagcatg ccaatctgca gtttcagaat caaagtcatg tggaaataat 2580

cagtgcccag actccgttga aaatagtggt tttcattctc atccccgtcc tcaatgctgc 2640

tcgttgaaga tggcttctaa agcatgccaa tctgcagttt cagaatcaaa gtcatgtgga 2700

aataatcagt gcccagactc cgttgaaaat agtggttttc attctcatcc ccgtcctcaa 2760

tgctgctcgt cgaagatggc tgctaaagca tgccaatctg cagtttcaga atcaaagtca 2820

tgtggaaata acaattgctc ggagtccatt tacaagagta gttgtcattc tttaacaagt 2880

tctctagtat gttcttccaa gatgtctgct ccacaatgtc attctgccac ttcaagctcc 2940

aaatcatgtg gaagtaccaa gtgctccaac ttcagtgaca aaaaatgttg ccaatatgac 3000

aaaattcctc aaacgtgctc taccaagaag tctgctccag gatgtcaatc tgcagtttct 3060

gggtctaaat catgtggaga tagcaagtgt tcagactcga aagacaatag tagccatcct 3120

tcacatcccg atcatcaaat atgcacgtct aagttgtgtg ctccacaaag ccaatctgca 3180

acttcaagct ccaggacatg tggaaatatg aagtgctcgg acaccaatag caagaattct 3240

tgttattcac ataccaactc tgaatcatgc tcttcaaaga tgtctggtcc agcatgcaaa 3300

actgctaatt caggttcaag gttatgcgga aataagaagt gcctagactc tgcaaacgag 3360

aacagttttc attcacttac taatccactc tgtgaggaaa agcttttgga gaaggaaagc 3420

ttggatttag cccgaaaaga tagggaatca aatcatgatc ttagtcatgg ttgctctgac 3480

gaggaacatg atcatctaaa tttagacaag gcacatgaca gttgtgcctt acaagaatgt 3540

tgttattctg ttcaaggcaa taaaactgat gtatcagaaa ctggaatcca ggaagctgct 3600

cattgtgaca gcatcaatca aacatgccaa actgcaattt caggatcaat gacatgcgga 3660

aataataaga gtctggactc tctaagcatc catggttgtc attcacatga tagtccactc 3720

cacaaggaga gcaacttgga gcagaaaagc ttggatgttg ctggagaagg tataaaatca 3780

cctcatgctg tcggtcaagg ctgttcggac aaggagcaca atcactcgca tccagaaaag 3840

gcgtatgaca gttgtgcaac agacgattgt tgtttttcag ttcaagtcca tggcattgac 3900

gacgtatcaa gaagtgaaat tcaagaaact gctcattgtg acagcacaaa acagagcacg 3960

gtcatcccca gcagctgcga acatgaacca aaagatcagg taaatcactg tggatctcac 4020

tctaaaagta ttccaactga tgaagaacta gccaagctgg ttagaagatg ctgcaaatac 4080

aaaccatgcc acgatgtccg ctctggctgc aggaagcatg ctgcagaatg tggtccaacc 4140

gttcgatcaa ccatcaatat cttacgggac aaccatcatc atcatctaga ctgcagtggt 4200

cgtaaggttt gttcgctgtt ggagaagaga cacattggtg gatgctgtga cagcttcaga 4260

aaagaatgtt gtgccaagaa caatcacctt ggagcaagtt ttggaggagg tttatcagaa 4320

attgtcatag agtag 4335

<210> 2

<211> 1444

<212> PRT

<213> NtHMA4基因氨基酸

<400> 2

Met Val Glu Ser Glu Lys Met Asn Asp Thr Lys Asn Leu Ser Lys Ser

1 5 10 15

Tyr Phe Asp Val Leu Gly Ile Cys Cys Thr Ser Glu Val Val Leu Val

20 25 30

Glu Lys Ile Leu Lys Asn Leu Glu Gly Val Lys Glu Val Ser Val Ile

35 40 45

Val Thr Thr Lys Thr Val Ile Val Ile His Asp Ser Leu Leu Ile Ser

50 55 60

Gln Gln Gln Ile Val Lys Ala Leu Asn Gln Ala Arg Leu Glu Ala Ser

65 70 75 80

Ile Arg Val Lys Gly Glu Lys Asn Tyr Gln Lys Lys Trp Pro Ser Pro

85 90 95

Phe Ala Ile Gly Ser Gly Ile Leu Leu Gly Leu Ser Phe Leu Lys Tyr

100 105 110

Phe Phe Ala Pro Phe Gln Trp Leu Ala Leu Ala Ala Val Ala Val Gly

115 120 125

Ile Pro Pro Ile Ile Phe Arg Gly Val Ala Ala Val Arg Asn Leu Thr

130 135 140

Leu Asp Ile Asn Ile Leu Val Leu Ile Ala Val Thr Gly Ser Ile Val

145 150 155 160

Leu His Asp Tyr Trp Glu Ala Gly Thr Ile Val Phe Leu Phe Thr Ile

165 170 175

Ala Glu Trp Leu Glu Ser Arg Ala Ser His Lys Ala Thr Ala Ala Met

180 185 190

Ser Ser Leu Val Asn Ile Val Pro Pro Thr Ala Val Leu Ala Glu Ser

195 200 205

Gly Glu Val Val Asn Val Asp Glu Val Lys Leu Asn Ser Ile Leu Ala

210 215 220

Val Lys Ala Gly Glu Thr Ile Pro Ile Asp Gly Val Val Met Glu Gly

225 230 235 240

Glu Cys Asp Val Asp Glu Lys Thr Leu Thr Gly Glu Ser Phe Pro Val

245 250 255

Ser Lys Gln Ile Asp Ser Thr Val Trp Ala Gly Thr Thr Asn Leu Asn

260 265 270

Gly Tyr Ile Ser Val Lys Thr Thr Ala Leu Ala Glu Asp Cys Ala Val

275 280 285

Ala Arg Met Ala Gln Leu Val Glu Asp Ala Gln Asn Lys Lys Ser Lys

290 295 300

Thr Gln Arg Tyr Ile Asp Lys Cys Ala Lys Tyr Tyr Thr Pro Ala Ile

305 310 315 320

Val Ala Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Val Pro Thr Ala Leu Arg Val

325 330 335

His Asn Arg Asn Glu Trp Tyr Arg Leu Ala Leu Val Thr Leu Val Ser

340 345 350

Ala Cys Pro Cys Ala Leu Val Leu Ser Thr Pro Val Ala Met Cys Cys

355 360 365

Ala Leu Ser Lys Ala Ala Thr Ser Gly Leu Leu Phe Lys Gly Ala Glu

370 375 380

Tyr Leu Glu Thr Leu Ala Lys Ile Lys Ile Met Ala Phe Asp Lys Thr

385 390 395 400

Gly Thr Ile Thr Arg Gly Glu Phe Met Val Thr Glu Phe Lys Ser Leu

405 410 415

Val Asp Gly Leu Gly Leu Asn Thr Leu Leu Tyr Trp Val Ser Ser Ile

420 425 430

Glu Ser Lys Ser Gly His Pro Met Ala Ala Ala Leu Val Asp Tyr Ala

435 440 445

Gln Ser Asn Ser Val Glu Pro Lys Pro Asp Arg Val Glu Gln Phe Gln

450 455 460

Asn Phe Pro Gly Glu Gly Ile Phe Gly Arg Ile Asp Gly Met Glu Ile

465 470 475 480

Tyr Val Gly Asn Arg Lys Ile Ser Ser Arg Ala Gly Cys Thr Thr Val

485 490 495

Pro Glu Ile Glu Gly Asp Ser Phe Gln Gly Lys Ser Val Gly Tyr Ile

500 505 510

Phe Leu Gly Ser Ser Pro Ala Gly Ile Phe Gly Leu Ser Asp Val Cys

515 520 525

Arg Ile Gly Val Lys Glu Ala Met Arg Glu Leu Lys Gln Met Gly Ile

530 535 540

Lys Thr Ala Met Leu Thr Gly Asp Cys Tyr Ala Ala Ala Asn His Val

545 550 555 560

Gln Asp Gln Leu Gly Gly Ala Met Asp Glu Phe Gln Ala Glu Leu Leu

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Pro Glu Asp Lys Ala Thr Ile Ile Lys Gly Phe Gln Lys Glu Ala Pro

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Thr Ala Met Ile Gly Asp Gly Leu Asn Asp Ala Pro Ala Leu Ala Thr

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Ala Asp Ile Gly Ile Ser Met Gly Ile Ser Gly Ser Ala Leu Ala Lys

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Lys Ala Ala Arg Leu Ala Arg Arg Val Arg Arg Lys Ile Val Glu Asn

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Met Ile Ile Ser Val Val Thr Lys Ala Ala Ile Val Ala Leu Ala Ile

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Ala Gly Tyr Pro Leu Val Trp Ala Ala Val Leu Ala Asp Thr Gly Thr

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Cys Leu Leu Val Ile Leu Asn Ser Met Leu Leu Leu Arg Val Gly Thr

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His Arg His Gly Lys Lys Cys Cys Arg Ser Ala Thr Pro Ser His Ala

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Pro Asn His Lys Asp Lys Ala Ser Cys Cys Lys Ser Glu Asn Ala Pro

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Gln Leu Cys Cys Ser Asp Ile Glu Ser Gln Lys Lys Cys Thr Ser Gln

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Ser Cys Ser Ser Glu Val Cys Val Pro Arg Cys Gln Pro Val Ser Ser

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Ser Gly Phe His Ser His Pro Arg Pro Gln Cys Cys Ser Ser Lys Met

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Ala Ser Lys Ala Cys Gln Ser Ala Val Ser Glu Ser Lys Ser Cys Gly

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Asn Asn Gln Cys Pro Asp Ser Val Glu Asn Ser Gly Phe His Ser His

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Pro Arg Pro Gln Cys Cys Ser Ser Lys Met Ala Ser Lys Ala Cys Gln

835 840 845

Ser Ala Val Ser Glu Ser Lys Ser Cys Gly Asn Asn Gln Cys Pro Asp

850 855 860

Ser Val Glu Asn Ser Gly Phe His Ser His Pro Arg Pro Gln Cys Cys

865 870 875 880

Ser Leu Lys Met Ala Ser Lys Ala Cys Gln Ser Ala Val Ser Glu Ser

885 890 895

Lys Ser Cys Gly Asn Asn Gln Cys Pro Asp Ser Val Glu Asn Ser Gly

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His Thr Asn Ser Glu Ser Cys Ser Ser Lys Met Ser Gly Pro Ala

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His Ser His Asp Ser Pro Leu His Lys Glu Ser Asn Leu Glu Gln

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Lys Ser Leu Asp Val Ala Gly Glu Gly Ile Lys Ser Pro His Ala

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Val Gly Gln Gly Cys Ser Asp Lys Glu His Asn His Ser His Pro

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Glu Lys Ala Tyr Asp Ser Cys Ala Thr Asp Asp Cys Cys Phe Ser

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Val Gln Val His Gly Ile Asp Asp Val Ser Arg Ser Glu Ile Gln

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Gly Cys Cys Asp Ser Phe Arg Lys Glu Cys Cys Ala Lys Asn Asn

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Glu

<210> 3

<211> 4335

<212> DNA

<213> NtHMA4基因突變體核苷酸

<400> 3

atggtggaaa gtgagaaaat gaatgacaca aagaatctga gcaagagcta ttttgatgtt 60

ttgggaattt gctgtacttc agaagttgtt cttgttgaaa aaattctcaa gaatcttgaa 120

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