本發明涉及一種cdk4/6抑制劑與芳香化酶抑制劑聯合在制備治療乳腺癌的藥物中的用途。

背景技術：

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，具有發病率高，頗具侵襲性，但病程進展緩慢，中國人口協會2010年2月1日在北京發布了《中國乳腺疾病調查報告》，報告顯示，我國城市地區乳腺癌的死亡率增長了38.91％，乳腺癌已經成為對婦女健康威脅最大的疾病，目前在研和上市的乳腺癌藥物至少有156種，其中68％為靶向治療藥物，大量研究發現腫瘤與細胞周期反常相關，腫瘤細胞中有絲分裂信號蛋白的大量突變和抗有絲分裂信號蛋白缺陷導致增殖紊亂；同時大部分腫瘤都存在基因組不穩定性(gin)和染色體組不穩定性(cin)，這三種基本的細胞周期缺陷都直接或間接由cdks的失控引起。周期素依賴性蛋白激酶(cdk，cyclindependentkinase)抑制劑日益成為熱門靶標。

目前開發的一代二代cdk抑制劑很多，最受關注的二代藥物包括pfizer公司和onyx公司共同開發的cdk4/6抑制劑pd-0332991，其通過抑制cdk4/6的活性，抑制rb的磷酸化，使e2f-rb復合物留滯在胞漿中，阻斷細胞周期的啟動。臨床試驗結果(nct00721409)顯示，來曲唑單藥治療的患者的無進展存活期(progression-freesurvival,pfs)為7.5月，而來曲唑和pd-0332991藥物聯用治療的患者其無進展存活期則延長至26.1月，這一顯著優勢獲得了廣泛關注。

wo2014183520公開了與pd-0332991結構相似的一系列滿足式(i)通式的cdk4/6抑制劑，具有顯著的cdk4/6的抑制活性和高度選擇性，并預期這些化合物可能用于一系列腫瘤，并且可以與一系列現有的抗腫瘤劑聯合使用，其中包括如下所示的式a化合物，其化學名為6-乙酰基-8-環戊基-5-甲基-2-((5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮：

然而上述文獻并沒有具體公開哪一個化合物與哪一種抗腫瘤劑聯用時可以取得較好的效果，更沒有預期一些特定的聯用方式可以取得協同作用。

技術實現要素：

本發明驚奇地發現，化合物a或其可藥用鹽與芳香化酶抑制劑聯合使用時取得了顯著的協同作用，從而完成了本發明。

本發明一方面提供了化合物a或其可藥用鹽與芳香化酶抑制劑聯合在制備治療乳腺癌的藥物中的用途。所述的芳香化酶抑制劑可以是福美坦、依西美坦、法倔唑、來曲唑、伏氯唑、阿那曲唑，優選來曲唑。

其中所述的乳腺癌優選為雌激素受體陽性(er+)、和/或人表皮生長因子受體2陰性(her2-)的乳腺癌；更優選為上述表型的局部晚期或轉移性乳腺癌。

在本發明中，化合物a在實際使用時，優選其可藥用鹽的形式，可以是各種有機酸或者無機酸的加成鹽，其中特別優選羥乙基磺酸鹽，其結構如下所示：

更優選地，本發明的化合物a的羥乙基磺酸鹽以i型結晶的形式存在，使用cu-ka輻射，得到以2θ角度和晶面間距表示的x-射線粉末衍射圖譜，所述i型結晶具有如圖1所示的x-射線粉末衍射圖譜，其中在約4.17(21.17)，8.26(10.69)，9.04(9.77)，10.78(8.20)，12.38(7.14)，14.01(6.32)，18.50(4.79)，18.89(4.70)，20.69(4.29)，21.58(4.11)，23.87(3.73)和28.15(3.17)有特征峰。

所述的i晶型經光照、高溫和高濕條件下測試，穩定性良好，且溶解性、生物利用度優于化合物a本身。

在本發明中，化合物a或其可藥用鹽的每日用量(以化合物a計)范圍可以是0.1mg/kg～1000mg/kg，優選0.5～10mg/kg，更優選0.5～5mg/kg。對于成年人類，優選以化合物a計，每日用量1mg～1000mg，優選10～500mg，最優選30至300mg。

在本發明中，對于成年人類，芳香化酶抑制劑的每日用量為1～100mg，優選1～10mg，更優選1～5mg。

在本發明一個優選的實施方案中，化合物a或其可藥用鹽與芳香化酶抑制劑以特定的重量比例聯合使用，例如1～1000：1，優選10～100：1，更優選20～80：1。

本發明中所述的聯合使用，并不限定化合物a或其可藥用鹽與芳香化酶抑制劑同時施用，也可以二者先后施用；另外，為了用藥方便，還可將化合物a與芳香化酶抑制劑制成藥物組合物。

附圖說明

圖1：顯示化合物a的羥乙基磺酸鹽的i晶型的xrd圖譜；

圖2：顯示化合物a的羥乙基磺酸鹽的i晶型的dsc圖譜圖；

圖3：pd-0332991、化合物a單用或與來曲唑合用對人乳腺癌mcf-7/aro裸小鼠皮下移植瘤的療效；

圖4：pd-0332991、化合物a單用或與來曲唑合用對荷瘤裸小鼠體重的影響；

圖5：pd-0332991、化合物a單用或與來曲唑合用對人乳腺癌mcf-7/aro裸小鼠皮下移植瘤的療效(腫瘤照片)。

具體實施方式

以下結合實施例用于進一步描述本發明，但這些實施例并非限制本發明的范圍。

實驗所用的測試儀器

1、dsc譜

儀器型號：mettlertoledodsc1stareesystem

吹掃氣：氮氣

升溫速率：10.0℃/min

溫度范圍：40-400℃

2、x-射線衍射譜

儀器型號：brukerd8focusx-射線粉末衍射儀

射線：單色cu-kα射線(λ＝1.5406)

掃描方式：θ/2θ，掃描范圍：2-40°

電壓：40kv，電流：40ma

實施例1：6-乙酰基-8-環戊基-5-甲基-2-((5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮羥乙基磺酸鹽的制備

步驟1：6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-環戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-5',6'-二氫-[3,4'-聯吡啶]-1'(2'h)-甲酸叔丁酯的制備

氬氣保護下，將(10g，29.06mmol)2-氨基-6-(1-丁氧乙烯基)-8-環戊基-5-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮(按wo2014183520公開方法制備)、碳酸銫(14.22g，43.75mmol)、pd2(dba)3(2.12g，2.31mmol)、4,5-雙二苯基膦-9,9-二甲基氧雜蒽(2.69g，4.69mmol)和125.00g二氧六環投入三口反應瓶中，攪拌均勻后加熱至回流，緩慢滴加原料4-(6-氯吡啶-3-基)-5,6-二氫吡啶-1(2h)-羧酸叔丁酯(10.34g，35.00mmol,購自鹽城市瑞康醫藥化工有限公司)和二氧六環(65.62g，0.74mol)的混合液(滴加時間約5h)。滴畢繼續回流攪拌反應1～1.5h，tlc監控原料2-氨基-6-(1-丁氧乙烯基)-8-環戊基-5-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮反應完全(展開劑：石油醚：乙酸乙酯＝2:1，原料rf＝0.6，產物rf＝0.7)，終止反應。反應液冷卻至室溫，過濾，濾餅用二氯甲烷17.19g×3洗滌。將濾液于65℃減壓濃縮干。殘留物加入137.50g二氯甲烷溶解，加入56.25g純化水，分液，水相再用68.75g二氯甲烷萃取。合并有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾餅用23.44g二氯甲烷洗，濾液于45℃減壓濃縮至油狀液體。加入150g丙酮溶解，室溫攪拌約2h，冰水浴攪拌約3h。過濾，濾餅用冷丙酮25g×4洗滌，室溫減壓干燥8～10h，得固體約14.84g，收率：80～92％，hplc檢測純度不低于90％。esi/ms:[m+h]＝601.43。

步驟2：4-(6-((6-乙酰基-8-環戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯的制備

將6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-環戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-5',6'-二氫-[3,4'-聯吡啶]-1'(2'h)-甲酸叔丁酯(14.84g，24.69mmol)和75g乙酸投入三口反應瓶中，通氬氣保護。加入10％pd/c(5g)，氫氣置換三次，攪拌下于50～60℃常壓加氫反應30～32h。hplc法監測中間態剩余量(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-環戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-5',6'-二氫-[3,4'-聯吡啶]-1'(2'h)-甲酸叔丁酯脫掉正丁基保護但雙鍵未被還原的中間體)＜0.3％，終止反應。反應液冷卻至室溫，體系氬氣置換后過濾，濾餅用37.50g二氯甲烷洗滌。將濾液于65℃減壓濃縮至干。殘留物氬氣保護用50g無水乙醇回流打漿0.5h，攪拌下自然冷卻至室溫，冰浴攪拌約4h。過濾，濾餅用冷無水乙醇12.50g×2洗滌。所得濕品加入二氯甲烷31.25g攪拌，過濾不溶物，濾液攪拌下緩慢加入異丙醇118.75g，冰浴攪拌約3h，過濾后減壓干燥8～10h得固體約8.75g，產率：60～72％，hplc檢測純度不低于98％。esi/ms:[m+h]＝547.26。

步驟3：6-乙酰基-8-環戊基-5-甲基-2-((5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮羥乙基磺酸鹽的制備

將4-(6-((6-乙酰基-8-環戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(8.75g，15.94mmol)和56.25g無水甲醇投入三口反應瓶中，攪拌均勻。將80％羥乙基磺酸(8.81g，55.94mmol)和水0.94g溶于13.75g無水甲醇中，滴加到上述溶液中，溶液變澄清。滴畢加熱回流攪拌反應3～3.5h，tlc檢測原料反應完全(石油醚：乙酸乙酯＝1:1，原料rf＝0.3，產物rf＝0)，終止反應，趁熱過濾。濾液攪拌下滴加三乙胺(4.00g，39.38mmol)，滴畢繼續攪拌約1h，冰浴攪拌約3h。過濾，濾餅用冷無水甲醇7.19g×2洗滌，40℃減壓干燥6～8h得固體約7.97g，收率：82～93％，hplc檢測純度不低于98％。tof-ms:[m+h]＝447.2503(6-乙酰基-8-環戊基-5-甲基-2-((5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮結合一個氫離子的離子峰)。該結晶樣品的x-射線衍射譜圖見圖1。該結晶在約4.17(21.17)，8.26(10.69)，9.04(9.77)，10.78(8.20)，12.38(7.14)，14.01(6.32)，18.50(4.79)，18.89(4.70)，20.69(4.29)，21.58(4.11)，23.87(3.73)和28.15(3.17)處有特征峰。dsc譜圖見圖2，在324℃附近有熔融吸熱峰，將此晶型定義為i晶型。經光照、高溫和高濕條件下測試，該晶型的穩定性良好。

實施例2：化合物a和pd-0332991單用或與來曲唑合用對人乳腺癌mcf-7/aro裸小鼠皮下移植瘤療效的比較研究。

1受試藥物

藥物名稱：pd-0332991的羥乙基磺酸鹽為黃色結晶性粉末，根據cn1835951b公開的方法制備；化合物a的羥乙基磺酸鹽為白色粉末，由實施例1制備得到；來曲唑為白色粉末，由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司提供。

配制方法：化合物a的羥乙基磺酸鹽用50mm檸檬酸+0.5％cmc+0.5％tween80配制；pd-0332991的羥乙基磺酸鹽用含0.1％tween80的蒸餾水配制；來曲唑用含20％peg400的蒸餾水配制并稀釋。

2實驗動物

balb/ca-nude裸小鼠，6-7周，♀，購自上海靈暢生物科技有限公司。生產許可證號：scxk(滬)2013-0018；動物合格證號2013001811147。飼養環境：spf級。

3實驗步驟

裸小鼠皮下接種人乳腺癌mcf-7/aro細胞，待腫瘤生長至100-250mm3后，將動物隨機分組(d0)。給藥劑量和給藥方案見表1。溶劑組灌胃50mm檸檬酸+0.5％cmc+0.5％tween80溶液；每周測2-3次瘤體積，稱鼠重，記錄數據。腫瘤體積(v)計算公式為：

v＝1/2×a×b2其中a、b分別表示長、寬。

t/c(％)＝(t-t0)/(c-c0)100其中t、c為實驗結束時的腫瘤體積；t0、c0為實驗開始時的腫瘤體積。

4試驗結果

乳腺癌mcf-7細胞表達雌激素受體，但不表達芳香化酶，mcf-7細胞穩定轉染人芳香化酶后命名為mcf-7/aro細胞。pd-0332991、化合物a(100mg/kg,po,qd×21)對mcf-7/aro裸小鼠皮下移植瘤的生長有一定抑制作用，抑瘤率分別為32％和31％，但均沒有達到統計學顯著性差異(p>0.05，與溶劑相比)；來曲唑對mcf-7/aro的抑瘤率為29％；pd-0332991、化合物a與來曲唑合用，抑瘤率均有提高，分別提高到46％和54％，并且有統計學顯著性差異(p<0.05，與溶劑相比)。荷瘤小鼠對以上藥物均能很好耐受，沒有體重下降等癥狀發生；pd-0332991、化合物a與來曲唑合用毒性也沒有明顯增加。結果說明，pd-0332991、化合物a與來曲唑合用對于與治療雌激素受體陽性、且表達芳香化酶的mcf-7/aro皮下移植瘤均有增效作用；在與來曲唑聯用后，化合物a的抑瘤率提升的更為明顯，由單藥的31％提高到54％；而pd-0332991的抑瘤率由32％僅提高到46％。