本發明提供一種竹節參總皂苷在制備治療腫瘤惡病質的藥物上的應用。屬于生物醫藥領域。

背景技術：

惡病質是一種復雜的代謝綜合征，涉及到全身多個臟器和系統，常繼發于腫瘤、心力衰竭、急性腎衰竭、慢性阻塞性肺病等疾病。惡病質的主要臨床表征為短期內體重急劇下降、骨骼肌和脂肪的流失，同時伴有厭食、乏力、貧血、衰竭等癥狀。統計顯示，高達一半的癌癥患者死亡時伴有惡病質發生，且20%的患者直接死于惡病質。惡病質不僅會影響手術、化療和放療的實施，同時會造成患者嚴重的營養不良，降低患者的生活質量。研究表明，惡病質的發生機制與代謝異常、促炎細胞因子、全身慢性炎癥反應、氧化應激和神經肽等諸多因素有關。其中，腫瘤發生發展過程中，免疫細胞和腫瘤細胞分泌的促炎細胞因子增多，機體慢性炎癥反應，在腫瘤惡病質的發生機制中起著十分重要的作用。

竹節參（panacisjaponicirhizoma）系五加科人參屬植物竹節參（panaxjaponicusc.a.mey.）的干燥呈竹鞭狀根莖，是我國西南地區土家族、苗族民間常用中草藥。研究表明，竹節參具有抗衰老、鎮痛與免疫調節等藥理活性，其主要活性組分為竹節參總皂苷。近期研究發現，竹節參總皂苷具有良好的抗炎活性，有效改善弗氏完全佐劑誘導的佐劑大鼠關節炎，顯著抑制lps誘導的raw264.7細胞上清液中tnf-α和il-1β的含量升高，下調nf-κb蛋白的表達。

技術實現要素：

針對上述背景技術，本發明提供一種竹節參在腫瘤惡病質的治療上的藥物，發現竹節參總皂苷通過抑制nf-κb介導的炎性反應在制備治療腫瘤惡病質的藥物上的應用。為進一步開發腫瘤惡病質的治療藥物提供實驗基礎。

材料與方法

實驗材料

spf級balb/c小鼠40只，雄性，6-8周齡，體重20-22g，購自湖北省實驗動物研究中心（動物質量合格證許可證號：scxk（鄂）2008-0005）；竹節參購于湖北恩施州竹節參種植基地，經三峽大學藥學系曾建紅教授鑒定確認；小鼠結腸癌細胞株ct26來自上海交通大學附屬第六人民醫院郭澄教授饋贈；蛋白預染marker、ripa裂解液、bca蛋白定量試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；流式微球試劑盒、tnf-α，il-1β抗體購自bd公司，nf-κbp65抗體購自cst；β-actin、murf1、pax7抗體購自abcam。

實驗方法

小鼠結腸癌腫瘤惡病質模型的建立

按照文獻報道成熟方法建立小鼠腫瘤惡病質模型，具體方法如下：balb/c小鼠32只，適應性喂養1周后，隨機取24只小鼠前肢側翼背部皮下注射0.2ml（約1×10⁶個）ct26細胞懸液，剩余的8只小鼠作為正常對照，接種4天后，捫及小結節。每天定時監測各組小鼠的攝食量、精神狀態、毛發及體重。若荷瘤小鼠較對照小鼠出現活動減少、進食量下降，虛弱、精神不振等表現，即進入惡病質期。

藥物干預與標本采集

接種4天后，將接種小鼠隨機分為模型組、竹節參總皂苷低劑量組和高劑量組，每組8只。各組給藥方式為：正常組：生理鹽水，（0.1ml/10g，p.o.，q3d×9）；模型組：生理鹽水，（0.1ml/10g，p.o.，q3d×9）；低劑量組：竹節參總皂苷，（20mg/kg，p.o.，q3d×9）；高劑量組：竹節參總皂苷，（60mg/kg，p.o.，q3d×9）。末次給藥24h后，小鼠眼球采血，分離血清，于-80℃凍存，用于檢測炎性因子。采血后頸椎脫臼處死小鼠，剝離皮下腫瘤稱重，取脾臟、脛骨前肌、腓腸肌和附睪脂肪組織并稱重，部分腓腸肌組織置于10%福爾馬林溶液中固定，其余組織于-80℃凍存。

觀察指標

（1）小鼠一般狀態觀察

每日定時觀察小鼠毛發、精神狀況以及體質量情況。

（2）腓腸肌纖維橫切面積的檢測

將經福爾馬林溶液固定的腓腸肌組織采用常規方法包埋成石蠟塊，以4μm厚度連續橫切片，常規蘇木素-伊紅（he）染色后，光鏡觀察，采集圖片。

（3）流式微球檢測血清中tnf-ɑ與il-1β水平

微球法檢測血清中炎性因子tnf-ɑ和il-1β的水平，按試劑盒說明書操作：cba分析試劑盒里的每一種捕獲微球表面包被一種特異性抗體，檢測試劑是pe標記的抗體混合物，其熒光強度與微球上捕獲的細胞因子的量成正比。當捕獲微球、檢測抗體和待測樣本共同孵育后，三者即形成雙抗夾心復合物（捕獲微球+分析物+檢測抗體）。通過流式細胞儀分析捕獲微球和微球上結合抗體的熒光強度，從而得到待測樣本的數據。

（4）westernblot檢測腓腸肌與脛骨前肌中nf-κbp65、pax7與murf1蛋白表達水平

提取各組小鼠腓腸肌總蛋白和核蛋白，bca法測定蛋白濃度。蛋白樣品經10%sds-page分離后，電轉移至pvdf膜上，加入5％脫脂牛奶，于37℃封閉1.5h，分別加入β-actin、nf-κbp65抗體、murf1抗體、pax7抗體，4℃孵育過夜。次日以tbst洗膜3次，再加入hrp標記的二抗，37℃避光孵育1h，tbst洗膜3次，ecl化學發光法顯影。

統計學分析

應用spss17.0軟件進行統計學分析，實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，以p<0.05認為差異有統計學意義。

附圖說明

圖1為各組小鼠去除腫瘤后體重（x±s，n=8），**，與正常組相比p＜0.01；#，與模型組相比p＜0.05。

圖2為各組小鼠腓腸肌、脛骨前肌、附睪脂肪與脾臟質量圖（x±s，n=8）；*，與正常組相比p＜0.05；***，與正常組相比p＜0.001；#，與模型組相比p＜0.05

圖3為竹節參總皂苷對惡病質小鼠腓腸肌纖維橫切面積的影響，其中，a為正常組；b為模型組；c為竹節參總皂苷組（20mg/kg）；d為竹節參總皂苷組（60mg/kg）

圖4為竹節參總皂苷對惡病質小鼠血清中il-1β與tnf-α含量的影響；*，與正常組相比p＜0.05；#，與模型組相比p＜0.05。

圖5為竹節參總皂苷對腓腸肌中nf-κb、pax7與murf1的蛋白表達的影響。

圖6為竹節參總皂苷對脛骨前肌中nf-κb、pax7與murf1的蛋白表達的影響。

具體實施方式

小鼠一般情況及體重變化

荷瘤小鼠較正常組小鼠，食欲明顯下降，活動減少，皮毛顏色暗淡，精神萎靡。竹節參總皂苷干預后，低劑量組與高劑量組小鼠體質量與自發性活動均增加，且高劑量組變化更為明顯。去瘤后荷瘤小鼠體重較正常組明顯下降，且模型組下降最為明顯（p<0.01），低劑量組與高劑量組小鼠體重較模型組升高（p<0.05），見圖1。

腓腸肌、脛骨前肌、附睪脂肪與脾臟質量

與正常組相比，惡病質模型組小鼠腓腸肌和脛骨前肌重量顯著降低（p<0.05）。竹節參總皂苷干預后，與模型組相比，高劑量組肌肉重量明顯增加（p<0.05）。模型組小鼠附睪脂肪重量與正常組相比明顯減少（p<0.05），不同劑量竹節參總皂苷干預后附睪脂肪重量無明顯變化。惡病質小鼠脾臟重量均顯著增大（p<0.001），竹節參干預后，脾臟的腫大情況無顯著改善，見圖2。

腓腸肌纖維橫切面積

與正常組相比，惡病質小鼠腓腸肌纖維變細，肌肉束橫切面積顯著減小。竹節參總皂苷干預后，顯著改善惡病質導致的肌肉降解，且呈劑量依賴性，見圖3。

血清中il-1β與tnf-α含量

與正常組相比，腫瘤惡病質小鼠血清中il-1β與tnf-α的含量均顯著上升（p<0.05），竹節參總皂苷干預可顯著改善惡病質導致的機體炎性反應，見圖4。

腓腸肌與脛骨前肌中nf-κb、pax7與murf1的蛋白表達

與正常組相比，模型組nf-κb與murf1的表達水平顯著上升，而pax7在腓腸肌中有所下降。竹節參總皂苷干預后，nf-κb與murf1的含量下降明顯，但pax7表達變化不明顯，見圖5、圖6。