本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及增強免疫的無花果根的黃酮提取物的制法。
背景技術：
無花果根為桑科植物無花果樹ficuscaricalinn.的根。具有清熱解毒，散瘀消腫的作用。肺熱咳嗽，咽喉腫痛，痔瘡，瘰疬，筋骨疼痛。無花果中含有多種化學成分，主要為酚類化合物、類黃酮化合物和多糖類化合物。目前對于無花果的研究多集中在其果實上，對于無花果根的研究鮮有報道。
免疫力是人體抵御外界致病因子和維持體內環境穩定的能力，也就是人體免疫系統進行自我保護的一種能力。免疫力的主要任務是抵抗細菌或病毒等的感染，維系生命的正常生長發育和健康。使免疫系統不能正常發揮保護作用的原因多種多樣。隨著人們生活節奏的加快和工作壓力的增強，心理失衡、營養不全、生活沒有規律、鍛煉不得法、亂用藥品等等，都會導致免疫力低下。免疫力低下，會直接影響人們的身體健康，導致發生影響日常生活、工作和學習的機體障礙免疫力低下，人體容易生病。現有技術中，增強人體免疫力藥物存在不良反應明顯，效果不確切的問題。
現有技術中無花果黃酮類物質的提取純化存在提取率不高，純度低，操作復雜，對環境不友好，難以實現工業化的問題。
技術實現要素：
本發明的目的在于針對以上問題，提供增強免疫的無花果根的黃酮提取物的制法，該方法工藝簡單，操作簡便，提取率高，對環境友好。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：
本發明所述的增強免疫的無花果根的黃酮提取物的制法，包括以下步驟：
步驟1：取無花果根，粉碎成粗粉，加入纖維素酶溶液，溫浸24－72小時，過濾，取濾渣，備用；
步驟2：將所述濾渣中加入堿性稀乙醇，溫浸24－72小時，過濾，濾液回收乙醇，濃縮，得濃縮液；
步驟3：一次吸附分離：將所述濃縮液中加入大孔吸附樹脂，室溫攪拌吸附，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱，依次用水、15-30％堿性乙醇水溶液、40-55％堿性乙醇水溶液、65-80％堿性乙醇水溶液、90-95％堿性乙醇水溶液作為洗脫液進行洗脫，收集90-95％堿性乙醇洗脫液；將所述80-95％乙醇洗脫液濃縮，得濃縮洗脫液；
步驟4：二次吸附分離：將步驟3所得濃縮洗脫液加入大孔吸附樹脂，室溫攪拌吸附，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱，依次用水、32-48％乙醇水溶液、54-68％乙醇水溶液、76-88％乙醇水溶液作為洗脫液進行洗脫，收集76-88％乙醇洗脫液；
步驟5：將步驟4所得的76-88％乙醇洗脫液揮干乙醇，調節ph值呈弱酸性，靜置48－72小時，過濾，濾液濃縮，低溫干燥，即得。
進一步地，所述步驟1中纖維素酶溶液加入量為無花果根質量的3－5倍，所述纖維素酶溶液ph值為3－5，酶活為5－8萬u/g，所述溫浸的溫度為35－50℃。
進一步地，所述步驟2中堿性稀乙醇為ph值8-14的10-50％乙醇水溶液，其用量以每克無花果根計為3－5ml。
進一步地，所述步驟3和步驟4中的大孔吸附樹脂的型號均為d-101，其用量按每克無花果計為分別為0.3-0.5g和0.02-0.08g。
進一步地，所述步驟3中依次用水、25％堿性乙醇水溶液、48％堿性乙醇水溶液、70％堿性乙醇水溶液、92％堿性乙醇水溶液作為洗脫液進行洗脫，每個洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱柱體積的6-8倍，收集92％堿性乙醇洗脫液。
進一步地，所述步驟4中依次用水、40％乙醇水溶液、58％乙醇水溶液、79％乙醇水溶液作為洗脫液進行洗脫，每個洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱柱體積的6-8倍，收集79％乙醇洗脫液。
進一步地，所述步驟5中調節ph值為5－6.5。
進一步地，所述低溫干燥為冷凍干燥。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
本發明無花果根的黃酮提取物制備工藝簡單，操作簡便，所得黃酮提取物純度高，增加免疫作用確切，安全有效。
本發明利用纖維素酶將無花果根中的細胞壞，再采用堿性稀乙醇提取，利于有效成分的溶出，增加提取率。采用兩次大孔吸附樹脂吸附分離的方法，第一次采用堿性乙醇水溶液洗脫，第二次采用乙醇水溶液洗脫，有效地實現了與雜質的分離。最后采用酸化溶液的方法，其黃酮與酸不溶成分分離，進一步對其純化。最后黃酮含量達到了94.8％。
本發明方法簡單，操作簡便，條件溫和，對環境友好，能夠實現規模化生產。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明，本發明的方式包括但不僅限于以下實施例。
本發明所述的增強免疫的無花果根的黃酮提取物的制法，包括以下步驟：
步驟1：取無花果根，粉碎成粗粉，加入纖維素酶溶液，溫浸24－72小時，過濾，取濾渣，備用；
步驟2：將所述濾渣中加入堿性稀乙醇，溫浸24－72小時，過濾，濾液回收乙醇，濃縮，得濃縮液；
步驟3：一次吸附分離：將所述濃縮液中加入大孔吸附樹脂，室溫攪拌吸附，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱，依次用水、15-30％堿性乙醇水溶液、40-55％堿性乙醇水溶液、65-80％堿性乙醇水溶液、90-95％堿性乙醇水溶液作為洗脫液進行洗脫，收集90-95％堿性乙醇洗脫液；將所述80-95％乙醇洗脫液濃縮，得濃縮洗脫液；
步驟4：二次吸附分離：將步驟3所得濃縮洗脫液加入大孔吸附樹脂，室溫攪拌吸附，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱，依次用水、32-48％乙醇水溶液、54-68％乙醇水溶液、76-88％乙醇水溶液作為洗脫液進行洗脫，收集76-88％乙醇洗脫液；
步驟5：將步驟4所得的76-88％乙醇洗脫液揮干乙醇，調節ph值呈弱酸性，靜置48－72小時，過濾，濾液濃縮，低溫干燥，即得。
所述步驟1中纖維素酶溶液加入量為無花果根質量的3－5倍，所述纖維素酶溶液ph值為3－5，酶活為5－8萬u/g，所述溫浸的溫度為35－50℃。
所述步驟2中堿性稀乙醇為ph值8-14的10-50％乙醇水溶液，其用量以每克無花果根計為3－5ml。
所述步驟3和步驟4中的大孔吸附樹脂的型號均為d-101，其用量按每克無花果計為分別為0.3-0.5g和0.02-0.08g。
所述步驟3中依次用水、25％堿性乙醇水溶液、48％堿性乙醇水溶液、70％堿性乙醇水溶液、92％堿性乙醇水溶液作為洗脫液進行洗脫，每個洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱柱體積的6-8倍，收集92％堿性乙醇洗脫液。
所述步驟4中依次用水、40％乙醇水溶液、58％乙醇水溶液、79％乙醇水溶液作為洗脫液進行洗脫，每個洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱柱體積的6-8倍，收集79％乙醇洗脫液。
所述步驟5中調節ph值為5－6.5，所述低溫干燥為冷凍干燥。
實施例1
增強免疫的無花果根的黃酮提取物的制法，包括以下步驟：
步驟1：取無花果根，粉碎成粗粉，加入無花果根質量的5倍的纖維素酶溶液，35℃溫浸72小時，過濾，取濾渣，備用。所述纖維素酶溶液ph值為3，酶活為5萬u/g。
步驟2：將所述濾渣中加入ph值8的50％乙醇水溶液，60℃溫浸72小時，過濾，濾液回收乙醇，濃縮，得濃縮液；50％乙醇水溶液用量以每克無花果根計為3ml。
步驟3：一次吸附分離：將所述濃縮液中加入d101大孔吸附樹脂，室溫攪拌吸附，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱。大孔吸附樹脂的用量按每克無花果計為分別為0.3g。依次用水、25％堿性乙醇水溶液、48％堿性乙醇水溶液、70％堿性乙醇水溶液、92％堿性乙醇水溶液作為洗脫液進行洗脫，每個洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱柱體積的6倍，收集92％堿性乙醇洗脫液。將所述92％乙醇洗脫液濃縮，得濃縮洗脫液；
步驟4：二次吸附分離：將步驟3所得濃縮洗脫液加入d101大孔吸附樹脂，室溫攪拌吸附，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱，大孔吸附樹脂的用量按每克無花果計為分別為0.02g。大孔吸附樹脂柱依次用水、40％乙醇水溶液、58％乙醇水溶液、79％乙醇水溶液作為洗脫液進行洗脫，每個洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱柱體積的6倍，收集79％乙醇洗脫液。
步驟5：將步驟4所得的79％乙醇洗脫液揮干乙醇，調節ph值為5，靜置48小時，過濾，濾液濃縮，冷凍干燥，即得。
本實施例所得無花果根的黃酮提取物中黃酮含量為93.5％。
實施例2
增強免疫的無花果根的黃酮提取物的制法，包括以下步驟：
步驟1：取無花果根，粉碎成粗粉，加入無花果根質量的3倍的纖維素酶溶液，50℃溫浸24小時，過濾，取濾渣，備用。所述纖維素酶溶液ph值為5，酶活為8萬u/g。
步驟2：將所述濾渣中加入ph值14的10％乙醇水溶液，40℃溫浸24小時，過濾，濾液回收乙醇，濃縮，得濃縮液；10％乙醇水溶液用量以每克無花果根計為5ml。
步驟3：一次吸附分離：將所述濃縮液中加入d101大孔吸附樹脂，室溫攪拌吸附，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱。大孔吸附樹脂的用量按每克無花果計為分別為0.5g。依次用水、15％堿性乙醇水溶液、40％堿性乙醇水溶液、80％堿性乙醇水溶液、95％堿性乙醇水溶液作為洗脫液進行洗脫，每個洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱柱體積的8倍，收集92％堿性乙醇洗脫液。將所述92％乙醇洗脫液濃縮，得濃縮洗脫液；
步驟4：二次吸附分離：將步驟3所得濃縮洗脫液加入d101大孔吸附樹脂，室溫攪拌吸附，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱，大孔吸附樹脂的用量按每克無花果計為分別為0.08g。大孔吸附樹脂柱依次用水、32％乙醇水溶液、55％乙醇水溶液、76％乙醇水溶液作為洗脫液進行洗脫，每個洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱柱體積的8倍，收集76％乙醇洗脫液。
步驟5：將步驟4所得的76％乙醇洗脫液揮干乙醇，調節ph值為5，靜置24小時，過濾，濾液濃縮，冷凍干燥，即得。
本實施例所得無花果根的黃酮提取物中黃酮含量為94.8％。
實施例3
增強免疫的無花果根的黃酮提取物的制法，包括以下步驟：
步驟1：取無花果根，粉碎成粗粉，加入無花果根質量的4倍的纖維素酶溶液，40℃溫浸48小時，過濾，取濾渣，備用。所述纖維素酶溶液ph值為5，酶活為9萬u/g。
步驟2：將所述濾渣中加入ph值10的30％乙醇水溶液，40℃溫浸48小時，過濾，濾液回收乙醇，濃縮，得濃縮液；30％乙醇水溶液用量以每克無花果根計為4ml。
步驟3：一次吸附分離：將所述濃縮液中加入d101大孔吸附樹脂，室溫攪拌吸附，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱。大孔吸附樹脂的用量按每克無花果計為分別為0.4g。依次用水、30％堿性乙醇水溶液、55％堿性乙醇水溶液、65％堿性乙醇水溶液、90％堿性乙醇水溶液作為洗脫液進行洗脫，每個洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱柱體積的7倍，收集90％堿性乙醇洗脫液。將所述90％乙醇洗脫液濃縮，得濃縮洗脫液；
步驟4：二次吸附分離：將步驟3所得濃縮洗脫液加入d101大孔吸附樹脂，室溫攪拌吸附，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱，大孔吸附樹脂的用量按每克無花果計為分別為0.08g。大孔吸附樹脂柱依次用水、46％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液、88％乙醇水溶液作為洗脫液進行洗脫，每個洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱柱體積的8倍，收集88％乙醇洗脫液。
步驟5：將步驟4所得的88％乙醇洗脫液揮干乙醇，調節ph值為6，靜置48小時，過濾，濾液濃縮，冷凍干燥，即得。
本實施例所得無花果根的黃酮提取物中黃酮含量為92.3％。
實施例4
增強免疫作用試驗，試驗方法如下：
取實施例2制備所得樣品進行增強免疫作用實驗。人口服推薦用量為每人(成人)每日3次，每次50mg，成人體重按60kg計算，每日折合給藥劑量為2.5mg/kg。
劑量選擇與受試物給予方式：根據人口服用推薦用量，設樣品低、中、高劑量組分別為12.5、25、50mg/kg(分別相當于人體推薦用量的5、10、20倍)，同時設一個陰性對照組，每組10只動物。
分別稱取樣品，加水制成不同濃度的混懸液。分別給予相應劑量組動物灌胃，灌胃體積為0.2ml/10gbw(體重)，陰性對照組給予等體積的蒸餾水，每天灌胃一次，連續灌胃30天。
實驗動物：昆明種小鼠，雌雄各半，體重25g。
1對小鼠抗體生成細胞的影響
采用抗體生成細胞檢測測試本品對小鼠體液免疫的影響。
每只小鼠腹腔注射2％壓積srbc0.2ml，將免疫5天后的小鼠頸椎脫臼處死，取出脾臟放在盛有hank’s的平皿內，磨碎脾臟，制成細胞懸液，經200目篩網過濾，離心(1000r/min)10min，用hank’s液洗2遍，最后將細胞懸浮在5mlrpmi1640培養液中，臺酚蘭染色計數(應在95％以上)，并將細胞濃度調整為5×106個/ml，制成脾細胞懸液。將瓊脂糖配制成1％水溶液，水浴煮30分鐘，與等量雙倍濃度hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5ml，再向管內加10％(用sa緩沖液配制)壓積srbc50μl，脾細胞懸液各20μl做兩個平行樣，迅速混勻后，傾倒于瓊脂糖薄層玻片上，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培養箱中孵育1.5h，然后將補體加入到玻片架凹槽內，繼續溫育1.5h，計數溶血空斑數。補體制備是采集豚鼠血，分離出血清(至少5只豚鼠的混合血清)，將1ml壓積srbc加入到5ml豚鼠血清中，4℃冰箱放置30min，經常振蕩，離心取上清液，分裝，-70℃保存。用時以sa緩沖液按1:1.5稀釋。試驗結果，見表1。
表1對小鼠抗體生成細胞的影響
由表1可見，連續灌胃30天后，本發明3個濃度組動物的溶血空斑數與陰性對照組相比，經統計學處理，均有顯著性差異(p<0.05)。
2對小鼠血清溶血素的影響
采用血清溶血素測定(血凝法)測試本發明對小鼠體液免疫的影響。
每只小鼠腹腔注射2％srbc0.2ml免疫，繼續灌胃5天后，摘除眼球取血于離心管內，放置1小時，剝離，2000r/min離心10分鐘，收集血清，用生理鹽水將血清作倍比稀釋，每份稀釋12孔，將不同稀釋度的血清置于血凝板中，每孔100μl，再加入0.5％srbc懸液100μl，混勻，置濕盒37℃3小時后觀察結果，記錄每孔的凝集程度。計算抗體積數。
試驗結果，見表2。
表2對小鼠血清溶血素的影響
由表2可知，連續灌胃30天后，本發明3個濃度組動物的抗體積數與陰性對照組相比，經統計學處理，均有顯著性差異(p<0.05)。
3結論
表1、表2的結果表明，本發明對小鼠體液免疫試驗結果呈陽性。
將連續灌胃本發明30天后的小鼠進行解剖，其臟器重量及外觀與陰性對照組相比，均無明顯差異。且飼喂期間，無異常行為。說明要發明對小鼠無明顯不良反應。
上述實施例僅為本發明的優選實施方式之一，不應當用于限制本發明的保護范圍，但凡在本發明的主體設計思想和精神上作出的毫無實質意義的改動或潤色，其所解決的技術問題仍然與本發明一致的，均應當包含在本發明的保護范圍之內。