本發明涉及草果油在制備治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染疾病的藥物中的用途，屬藥物領域。
背景技術：
金黃色葡萄球菌是臨床上常見的毒性較強的細菌，自從上世紀40年代青霉素問世后，金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病受到較大的控制，但隨著青霉素的廣泛使用，有些金黃色葡萄球菌產生青霉素酶，能水解β-內酰胺環，表現為對青霉素的耐藥。科學家研究出一種新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲氧西林(methicillin)。1959年應用于臨床后曾有效地控制了金黃色葡萄球菌產酶株的感染，自1961年jevons在英國首次發現耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus,mrsa)以來，mrsa在上世紀70年代遍布全球，是目前院內感染和社區獲得性感染最常見、最重要的多重耐藥致病菌，可引起肺炎、心內膜炎和敗血癥等嚴重感染，mrsa具有明顯遺傳多樣性，可在動物之間、動物和人群之間廣泛傳播。據報道，mrsa對現有β-內酰胺類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類等多種抗生素耐藥，其中，mrsa對最有效也是使用最廣泛的所有β-內酰胺類抗生素幾乎呈交叉耐藥，又被稱為“超級細菌”，mrsa感染與乙型肝炎、艾滋病被列為世界三大最難解決感染性疾病。據報道，美國每年mrsa侵襲性感染患者約9.5萬人，死亡1.9萬人，血流感染死亡率較高，平均約30％，部分地區可達65％，高于艾滋病、病毒性肝炎、結核和流感死亡率的總和，嚴重威脅著人類健康，成為全球的公共安全衛生問題。
目前，萬古霉素和利奈唑胺等少數藥物是臨床抗mrsa感染的一線藥物，隨著臨床耐萬古霉素和利奈唑胺耐藥菌株的不斷增加，以及萬古霉素嚴重的耳/腎毒性和靜脈炎等不良反應導致其在臨床用藥的局限性，臨床抗mrsa感染正面臨“用藥難”和“難用藥”的嚴峻挑戰，新型抗mrsa感染藥物研發迫在眉睫。相對于抗生素新藥研發周期長、易產生耐藥性和明顯毒副作用等不足，傳統藥物具有資源廣、毒副作用小和逆轉細菌耐藥性等優點，在控制感染性疾病，尤其是多重耐藥菌引起的感染性疾病方面具有化學合成抗菌藥物所不可比擬的優勢。草果(amomumtsao-kocrevostetlemaire)為姜科豆蔻屬植物，主產于廣西、云南、貴州等地，是藥食兩用大宗中藥材，常用于治療瘧疾寒熱、胸滿腹脹、惡心嘔吐等癥。此外，草果也是常用的調味品，用于糕點，食物，火鍋等食品的加香。
目前，已有草果油用于細菌感染性疾病的報道，如專利申請號：201010622746.8，發明名稱：草果油在制備治療細菌感染性疾病的藥物中的用途，該申請公開了草果油在制備治療細菌感染性疾病的藥物中的用途，提供了一種治療細菌感染性疾病的藥物組合物。本發明藥物對革蘭氏陽性菌和陰性菌具有抗菌活性,對其中的耐藥株也有較強的抑菌作用,并且在體內同樣具有良好的抗菌作用,能有效治療臨床革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中的各類菌株所致的感染性疾病。針對“超級”耐藥菌，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染疾病的治療，沒有相關文獻報道。
技術實現要素：
本發明的目的是提供了草果油的新用途，具體是在制備治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染疾病的藥物中的用途。
本發明還提供了草果油在制備治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染疾病的藥物中的用途。
本發明還提供了草果油與β-內酰胺類抗生素聯合使用在制備治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染疾病的藥物中的用途。
其中，所述的草果油來源于姜科豆蔻屬植物草果amomumtsa-kocrevostetlemaire的成熟果實提取的揮發油。
其中，所述的草果油是通過如下方法制備得到的：取草果，粉碎成粗粉，加入10～14倍重量的蒸餾水，浸泡1～5小時后，采用水蒸氣蒸餾法提取2～6小時，即得草果油。
本發明還提供了一種治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染疾病的藥物組合物，它含有草果油為活性成分，加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。
其中，所述的活性成分還包括β-內酰胺類抗生素。
本發明藥物組合物是由下述重量配比的原料藥制備而成的制劑：
草果油0.1－0.9份、β-內酰胺類抗生素0.9－0.1份。
其中，所述的草果油是通過如下方法制備得到的：取草果，粉碎成粗粉，加入10～14倍重量的蒸餾水，浸泡1～5小時后，采用水蒸氣蒸餾法提取2～6小時，即得草果油；所述的β-內酰胺類抗生素為阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢吡肟。
其中，所述的藥劑是外用制劑、口服制劑或注射制劑。
本發明原料草果在當代主要用作食物香料，不僅具有自身兼有抗mrsa活性和逆轉mrsa多重耐藥活性，還具有資源廣、安全無毒和不易產生耐藥性等優點，在抗mrsa感染性疾病新藥研發中具有廣泛的開發與應用前景。
本發明草果油具有明顯體外抗mrsa活性和體內抗mrsa感染療效，且具有增強β-內酰胺類抗生素體外抗mrsa活性，說明草果油不僅具有單獨作為抗感染藥物新藥的開發與應用前景，還具有與β-內酰胺類抗生素聯合使用，恢復其抗mrsa活性，逆轉mrsa多重耐藥活性中藥新藥的開發與應用前景。
顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
具體實施方式
實施例1本發明藥物草果油的制備
取草果，粉碎過20-40目篩，加入10-14倍重量的蒸餾水，浸泡1-5小時后，采用水蒸氣蒸餾法提取2-6小時，即得本發明草果油。
本發明草果油也可按照藥典(2005年版)附錄xd揮發油測定法提取，還可采用有機溶劑提取、超臨界co2萃取等現有技術進行提取，或者通過購買市售產品的方式獲得。
以下通過具體藥效學試驗證明本發明的有益效果。
試驗例1本發明藥物藥效試驗
1材料與方法
1.1實驗菌株
mrsa標準株atcc43300和atcc33591均購自美國典型菌種保藏中心；mrsa臨床分離株25株來源于四川省婦幼保健院；所有菌株均保存于成都醫學院醫學檢驗實驗教學示范中心，菌株編號和來源見表1。
表1：受試菌株的編號和來源
1.2實驗藥物
實驗藥物：本發明藥物；
抗生素：阿莫西林(amoxicillinhydrochloridetrihydrate)，批號b326ba3634，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；頭孢氨芐(cephalexinmonohydrate)，批號ba14ba0016，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；頭孢吡肟(cefepime)，批號rk9y-dn25，購自中國食品藥品檢定研究院。vancomycin，購自sigma公司。
1.3實驗動物
km小鼠，spf級，體重(20±2)g，由四川省成都生物制品研究所有限責任公司提供，動物生產許可證號scxk(川)2016-08。
1.4培養基
mueller-hintonbroth(mhb)，批號583507，購自英國oxoid公司；mueller-hintonagar(mha)，批號1376993，購自英國oxoid公司；營養瓊脂，批號20150810，購自北京奧博星生物技術有限責任公司。
1.5主要試劑
大豆油，浙江田雨山藥用油有限公司，批號20140702；0.5麥氏比濁管，購自biomerieuxsa公司；tween-80，批號20150429，購自國藥集團化學試劑有限公司；0.9％氯化鈉注射液，批號b16051903，購自四川科倫藥業股份有限公司；96-孔板，批號160805-078，購自加拿大jetbiofil公司。
1.6主要儀器
生物安全柜(biosafe12)，上海力申科學儀器有限公司；自動高壓滅菌鍋(hiclavehve-50)，日本hirayama公司；隔水式恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱(gzx-9240mbe),上海博迅實業有限公司醫療設備廠；優普uph-ii-10t純水系統；分析天平(me104)，美國mettlertoledo公司；血細胞分析儀：法國horibaabx公司。
2實驗方法
2.1草果油提取
按照中華人民共和國藥典標準，采用水蒸氣蒸餾法提取草果揮發油，并用無水十二烷基磺酸鈉進行去水處理，測其密度(ρ＝929mg/ml)，存放于棕色瓶中，4℃冰箱保存備用。
2.2本發明藥物體外抗mrsa活性
2.2.1最低抑菌濃度(mic)測定藥液稀釋
藥液配置：以tween-80對草果油進行乳化，制備成185.80mg/ml乳劑，二倍稀釋法對乳化液進行系列稀釋，共稀釋成12個不同濃度梯度的稀釋液，用于測定mic、mbc和fic；以無菌水為溶劑，將抗生素溶解和稀釋，配制成濃度為4096μg/ml的母液，4℃冰箱保存備用。采用二倍稀釋法對抗生素母液進行系列稀釋，共稀釋成12個不同濃度梯度的稀釋液，用于測定mic、mbc和fic。
菌液制備：取各受試菌進行活化，挑取單克隆菌落于0.9％生理鹽水中，將菌液配置成0.5麥氏濃度(1.5×108cfu/ml)，后用mueller-hinton無菌肉湯稀釋50倍備用。
mic測定：用96-孔板微量稀釋法分別測定本發明藥物和阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢吡肟的mic。具體方法如下：在96-孔板中每孔分別加入100μlmhb，50μl稀釋后不同濃度的藥液，50μl制備的受試菌液，使本發明藥物在每孔中的終濃度為0.023mg/ml～46.45mg/ml，抗生素的終濃度為1μg/ml～2048μg/ml，37℃恒溫培養18h-24h，觀察其受試菌的生長情況，以無生長的藥物最低濃度為該藥對該受試菌的mic。以不加藥物為受試菌的陽性對照，以不加菌液為藥物陰性對照，以僅含培養液的為空白對照，每株受試菌進行三個平行實驗，實驗重復三次。
2.2.2最低殺菌濃度(mbc)測定
藥液稀釋和菌液配制同mic測定。首先用96-孔板微量稀釋法測定本發明藥物對不同受試菌的mic值(方法同上)，37℃恒溫培養18h-24h后，將培養板中未見細菌生長的肉湯接種于mha瓊脂平板上，37℃恒溫培養18-24h，觀察受試菌生長情況，以未見菌落生長的最小藥物濃度，即引起大多數細菌裂解的最低濃度為該藥物mbc。以不加藥物為受試菌的陽性對照，以不加菌液為藥物陰性對照，以僅含培養液的為空白對照，每株受試菌進行三個平行實驗，實驗重復三次。
2.3發明藥增強β-內酰胺類抗生素抗mrsa體外活性
藥液稀釋和菌液制備同mic測定。
聯合抑菌指數(fic)測定：根據發明藥和β-內酰胺類抗生素(阿莫西林、頭孢氨芐和頭孢吡肟)的mic結果，用棋盤法測量草果油與β-內酰胺類抗生素聯合使用的fic。具體方法如下：將96孔板橫排(1-12)，豎列(a-e)分別加上不同濃度梯度(2mic～1/16mic)的發明藥(甲藥)和抗生素(乙藥)各50ul，再加上100μl受試菌液，使其總濃度為1.5×106cfu/ml)，37℃恒溫培養18-24h，觀察細菌生長情況，統計兩藥聯合使用的mic。以不加藥物為受試菌的陽性對照，以不加菌液為藥物陰性對照，以僅含培養液的為空白對照，每株受試菌進行三個平行實驗，實驗重復三次。
統計分析：fic＝甲藥聯用的mic/甲藥單用的mic+乙藥聯用的mic/乙藥單用的mic。其中fic≤0.5為協同作用，0.5<fic≤1為相加作用，1<fic≤2為無關作用，fic>2為拮抗作用。
2.4本發明藥物體內抗mrsa感染活性
2.4.1mrsa感染小鼠模型制備
細菌毒力(mld)測定：適應性飼喂后，按體重將km小鼠(spf級)隨機分為6組，每組10只，分為5個實驗組和空白組。37℃恒溫培養mrsa標準株atcc43300至對數期，用生理鹽水將菌液稀釋成五個不同濃度梯度的菌液，腹腔注射km小鼠。在空白對照組小鼠不死亡的前提下，記錄實驗組小鼠72h內的死亡率，測定spf小鼠全部死亡的最低細菌量，即為atcc43300的最小致死量(minimumlethaldose,mld)。
mrsa全身感染模型小鼠制備：以mld菌液腹腔注射km小鼠(spf級)，制備mrsa感染小鼠模型。
2.4.2實驗分組及給藥
肌內注射預防給藥：km小鼠(spf級)適應性飼喂后，雌雄各半，按體重隨機共分7組，每組小鼠10只。其中分為空白對照組(n＝10)，模型對照組(n＝10)，溶劑對照組(n＝10)，陽性藥物對照組(n＝10)，實驗組分高、中、低3個劑量組(n＝30)。其中空白組和模型組肌內注射生理鹽水，溶劑對照組肌內注射大豆油，陽性對照組肌內注射萬古霉素，實驗組分別按不同劑量注射草果油，1次/d，連續給藥5d，給藥劑量詳見表6。除空白組不攻毒外，其余各組小鼠均在第5d給藥后，用最小致死量mrsa菌液腹腔注射小鼠進行攻毒，觀察小鼠存活情況。
肌內注射治療給藥：km小鼠(spf級)適應性飼喂后，按體重隨機共分8組，每組小鼠10只。其中分為空白對照組(n＝10)，模型對照組(n＝10)，陽性藥物對照組(n＝10)，實驗藥物5組(n＝50)。其中空白組和模型組肌內注射生理鹽水，陽性對照組肌內注射萬古霉素，實驗組注射發明藥，給藥劑量詳見表7。小鼠用mld菌液量腹腔注射mrsa后，立即給藥，1次/d，連續給藥3d，觀察小鼠的存活情況。
灌胃預防給藥：km小鼠(spf級)適應性飼喂后，按體重隨機共分9組，每組小鼠10只。其中分為空白對照組(n＝10)，模型對照2組(n＝20)，溶劑對照組(n＝10)，陽性藥物對照組(n＝10)，實驗組分為高、中、低3個劑量組((n＝10)。其中空白組和模型組灌胃生理鹽水，溶劑對照組灌胃吐溫-80，陽性對照組口服萬古霉素，實驗組灌胃草果油，1次/d，連續給藥5d，給藥劑量詳見表8。除空白組不攻毒外，其余各組小鼠均在第5d給藥后，用最小致死量mrsa菌液腹腔注射小鼠進行攻毒，觀察小鼠存活情況。
2.4.3數據統計
統計分析小鼠攻毒感染后7d內的存活和體內保護率，采用寇氏法統計分析發明藥體內抗mrsa感染的半數有效量(50％effectivedose,ed50)。
3結果與分析
3.1發明藥抗mrsa體外活性
采用96-孔板微量稀釋法分別測定了草果油和3種β-內酰胺類抗生素(阿莫西林、頭孢氨芐和頭孢吡肟)的mic和mbc，結果見表2。
表2：發明藥和3種β-內酰胺類抗生素對mrsa的體外活性
由上表可知，本發明藥物對mrsa的mic為0.36mg/ml～2.90mg/ml，mbc為1.45mg/ml～11.61mg/ml，說明草果油具有明顯抗mrsa體外活性。臨床常用3種β-內酰胺類抗生素(阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢吡肟)對mrsa的mic分別為4μg/ml～128μg/ml、4μg/ml～512μg/ml、4μg/ml～512μg/ml，mbc分別為32μg/ml～1024μg/ml、256μg/ml～1024μg/ml、256μg/ml～1024μg/ml，多表現為高水平耐藥。
3.2發明藥增強β-內酰胺類抗生素抗mrsa體外活性
采用棋盤法分別測定了發明藥和3種β-內酰胺類抗生素(阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢吡肟)聯合使用對mrsa的fic指數，分析了發明藥與β-內酰胺類抗生素聯合使用對2株mrsa標準株的活性變化，結果見表3；統計分析了發明藥和β-內酰胺類抗生素聯合使用對27株mrsa受試菌的相互作用，結果見表4。
表3：發明藥與β-內酰胺類抗生素聯合運用對mrsa標準株的mic比較分析
由上表可知，3種β-內酰胺類抗生素(阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢吡肟)在單獨使用和聯合發明藥使用時，mic明顯降低，說明發明藥能有效逆轉mrsa標準株atcc33591和atcc43300的多重耐藥活性。
表4：發明藥與β-內酰胺類抗生素聯合使用抗mrsa活性
由上表可知，草果油分別與3種β-內酰胺類抗生素聯合使用，主要表現為協同作用，其次為相加作用，僅有1株(3.33％)表現為無關作用。其中與阿莫西林、頭孢氨芐和頭孢吡肟的協同率分別為81.48％、81.48％和77.78％，說明草果油與3種β-內酰胺類抗生素(阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢吡肟)對80％左右的mrsa菌株具有協同作用，可有效增強β-內酰胺類抗生素治療mrsa作用，具有逆轉mrsa對β-內酰胺類抗生素的多重耐藥活性。
3.3發明藥體內抗mrsa感染療效
3.3.1mrsa的最小致死量
采用5種不同劑量對mrsaatcc43300進行腹腔注射感染攻毒，測得金黃色葡萄球菌的最小致死量為3.0×1010cfu/kg。
3.3.2本發明藥物體內抗mrsa感染療效
(1)本發明藥物肌內注射預防給藥的體內療效
用發明藥肌內注射小鼠，采用預防給藥方式，即1次/d，連續給藥5d，最后一次給藥后用mrsa菌株攻毒，實驗結果見表5。
表5：發明藥肌內注射(預防給藥)體內抗mrsa感染療效
由上表可知，發明藥注射預防給藥對由mrsa誘導的感染模型小鼠有很好的體內抗菌活性，高、中、低劑量對mrsa感染模型小鼠的體內保護率分別為100％、70％和40％，呈明顯量效關系。
(2)發明藥肌內注射治療給藥的體內療效
用發明藥0.46g/kg肌內注射治療mrsa感染模型小鼠，采用治療給藥方式，即攻毒小鼠后立即給藥治療，1次/d，連續給藥3d，觀察草果油的治療用藥情況，實驗結果見表6。
表6：草果油肌內注射(治療給藥)體內抗mrsa感染療效
由上表可知，草果油肌內注射治療給藥對mrsa感染模型小鼠有明顯體內抗感染療效，保護率達100％，且呈明顯量效關系。寇氏法計算發明藥治療mrsa感染的ed50為0.18g/kg。
(3)發明藥灌胃預防給藥
用發明藥灌胃小鼠，1次/d，連續給藥5d，最后一次給藥后，立即用mrsa攻毒小鼠，實驗結果見表7。
表7：發明藥灌胃(預防給藥)體內抗mrsa感染療效
由上表可知，發明藥灌胃，高、中、低劑量對mrsa感染模型小鼠的體內保護率分別為100％、80％和60％，呈明顯量效關系。
總之，發明藥具有明顯體外抗mrsa活性和體內抗mrsa感染療效，且具有增強β-內酰胺類抗生素體外抗mrsa活性，說明發明藥不僅具有單獨作為抗mrsa感染性疾病藥物新藥的開發與應用前景，還具有與β-內酰胺類抗生素聯合使用，恢復其抗mrsa活性，逆轉mrsa多重耐藥活性中藥新藥的開發與應用前景。