本發明涉及漁藥
技術領域：
，屬于殺滅寄生蟲藥物
技術領域：
，涉及大黃素的新用途，具體涉及一種大黃素在制備殺滅魚類體外寄生纖毛蟲藥物中的應用。
背景技術：
：寄生纖毛蟲病是危害水產養殖最為嚴重的病害之一，特別是多子小瓜蟲病。該病分布范圍廣、無寄主專一性、發病快，死亡率高，對水產養殖造成巨大的經濟損失。長期以來，多子小瓜蟲病的防治主要以孔雀石綠和汞制劑等化學藥物為主。由于這些化學藥物有毒性大、殘留高、致癌、致畸、致突變以及污染環境等危害，已經在食用魚生產中禁用。因此，迫切需要開發新的環保、高效的防治藥物。我國中草藥資源豐富，其成分易降解、殘留低，已有研究表明部分中草藥殺滅多子小瓜蟲的效果較好，這為我們尋找高效、安全的殺小瓜蟲藥物開辟了新途徑。大黃素是一種來自于多種藥用植物中的蒽醌類化合物，其結構式為：大黃素分子式：c15h10o5，分子量：269.2，為黃色粉末。有研究報道，大黃素具有利尿，血管舒張，止咳，抗細菌，抗病毒，抗潰瘍，抗炎和抗癌等作用。技術實現要素：為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的在于提供一種大黃素在制備殺滅魚類體外寄生纖毛蟲藥物中的應用，特別是在制備殺滅多子小瓜蟲藥物中的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現：大黃素在制備殺滅魚類體外寄生纖毛蟲藥物中的應用。所述的魚類體外寄生纖毛蟲指多子小瓜蟲(ichthyophthiriusmultifiliis)。所述的藥物制成藥液或粉劑。所述的藥物含有一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑。所述的大黃素有效且安全的濃度為0.5～0.85mg每升魚類養殖用水。本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果：(1)本發明首次將大黃素應用于制備殺滅魚類體外寄生蟲藥物，特別是用于殺滅多子小瓜蟲。(2)大黃素來源于天然植物，無殘留、無污染、無公害，對人體無毒，所以在環境中易降解，并能在有效劑量范圍內實現一次性全部殺滅寄生蟲，達到防治小瓜蟲病的效果；具有開發成新型環保防治魚類體外寄生纖毛蟲漁藥的廣闊應用前景。(3)大黃素對魚的半致死濃度分別為殺滅多子小瓜蟲幼蟲和成蟲半有效濃度的17.8倍和7.0倍，在殺蟲有效劑量范圍內對魚安全。(4)大黃素來源豐富，其提取制備工藝簡單，具有廣闊的應用前景。具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例中用到的寄主模型魚為草魚(ctenopharyngodonidellus)，來源于廣州市花都區五星村魚苗場。寄生蟲模型為多子小瓜蟲(ichthyophthiriusmultifiliis)，來源于廣州市花地灣花鳥魚蟲市場。實施例1：大黃素對多子小瓜蟲感染性幼蟲的殺滅作用(1)藥物的配制：稱取大黃素粉末1.5mg，用20μl無水乙醇促溶，加入蒸餾水配制成濃度為1280mg/l的儲備液，用二倍梯度稀釋法依次稀釋至64、32、16、8、4、2、1、0.5和0mg/l(對照)。以實驗用最高濃度藥液中無水乙醇的含量(0.08％)為標準，配制含0.08％無水乙醇的對照組處理液。(2)取96孔板，各孔中加入100μl約含200只幼蟲的蟲液，接著在各孔中加入100μl不同濃度的藥液，使最終藥物濃度依次為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0mg/l(對照)，各藥物濃度5個重復。實驗溫度保持為23±0.5℃，在4倍物鏡下記錄不同藥物濃度中幼蟲的致死時間和4h各孔的幼蟲數，并計算致死率和半數有效濃度ec50(見表3)，計算公式如下：致死率(％)＝(1-實驗后各孔幼蟲個數/實驗前各孔幼蟲個數)×100％結果表明：大黃素濃度為1mg/l時，能在4h內100％殺滅多子小瓜蟲幼蟲。隨著濃度的增加，殺幼蟲時間縮短。實施例2：大黃素對多子小瓜蟲成蟲的殺滅作用(1)大黃素藥物的配制：同實施例1。(2)取24孔板，將含有大約60個成蟲的200μl水溶液加入到各孔中，并在4倍顯微鏡下準確計數各孔成蟲數量，隨后向各孔中加入200μl不同濃度的藥液，使藥液的終濃度依次為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0mg/l，每個濃度設置3個平行。實驗溫度為23±0.5℃。在4倍顯微鏡下觀察記錄5h內成蟲的死亡時間和第5h的死亡率，計算出5h致死率和5h半數有效濃度(ec50)(見表3)。未死亡的成蟲將形成包囊繼續孵化，在實驗的第22h，包囊完全孵化后，在4倍顯微鏡下統計各孔中的幼蟲數，并計算平均每個包囊孵出的幼蟲數計算公式如下：死亡率(％)＝各孔實驗后死亡的成蟲數/各孔實驗前總成蟲數×100％平均每個包囊孵出幼蟲數＝各孔幼蟲總數/各孔的包囊數。結果表明：2mg/l大黃素能在255.3±10.2min殺死所有成蟲。雖然1mg/l的大黃素不能在5h內殺死所有成蟲，殺蟲率為92.6±2.1％，但可以完全抑制包囊孵化，從而阻斷多子小瓜蟲的傳播。在0.5和0.25mg/l濃度下，5h內的殺蟲率分別為62.3±4.5％和34.7±3.1％，并能顯著降低每個存活包囊釋放幼蟲的平均數量。實施例3：大黃素藥物對多子小瓜蟲包囊的殺滅作用(1)大黃素藥物的配制：同實施例1。(2)將200μl含有大約40個成蟲的蟲液加入24孔板各孔中，隨后將24孔板靜置于23±0.5℃溫度下6h，待形成包囊后，準確計數各孔包囊數，然后向各孔中加入200μl不同濃度的藥液，使藥液的終濃度依次為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0mg/l，每個濃度設置3個平行。再繼續在23±0.5℃下靜置16h，待包囊完全孵化后，統計每個包囊平均孵出幼蟲的數，計算公式如下：平均每個包囊孵出幼蟲數＝各孔幼蟲數/各孔的包囊數結果表明：大黃素的濃度在大于或等于2mg/l條件下可以殺死包囊，包囊無感染性幼蟲釋放。另外，隨著藥液濃度的降低，平均每個包囊釋放的感染性幼蟲數增加。實施例4：低濃度大黃素藥物對多子小瓜蟲幼蟲感染力的影響(1)大黃素藥物的配制：方法同實施例1。藥液配置成1、0.8、0.4、0.2、0.1和0mg/l(對照)。(2)剛孵化的感染性幼蟲，用蒸餾水把蟲液的濃度調整為40000個幼蟲每毫升，各取5ml蟲液(大約含200000個幼蟲)加入50ml的燒杯中，再加入5ml藥液，混勻，使感染性幼蟲在終濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.4和0.5mg/l的大黃素試液中處理2h。將180尾未感染多子小瓜蟲的健康草魚苗，隨機平均地分配到18個含5l曝氣自來水的水族箱中(每個水族箱10尾魚)，將經過各濃度大黃素藥液處理2h的幼蟲倒入各水族箱中，讓其感染草魚(平均每尾魚20000只幼蟲)，每一處理濃度設置3個平行。感染2h后，向每個水族箱中再加入5l曝氣自來水(每個水族箱共10l水)，實驗溫度為23±0.5℃，由供氧泵供氧。在實驗的第5天，用150mg/l的麻醉劑(ms222，sigma)麻醉草魚后，統計草魚體表小白點的總數，并統計草魚的感染率和感染強度(表1)。表1低濃度大黃素對多子小瓜蟲幼蟲感染力的影響濃度(mg/l)每缸幼蟲數每缸魚數感染率(％)感染強度0(對照)20000010100±0.0a243.9±11.1a0.0520000010100±0.0a206.7±49.5b0.120000010100±0.0a61.9±18.3c0.22000001040.0±10.0b13.8±6.1d0.42000001026.7±5.8c4.4±2.7d0.5200000100.0±0.0d0.0±0.0e感染率＝(體表有白點的魚數/總魚數)×100％；感染強度＝體表白點總數/體表有白點的魚數。同一縱欄內個數值右上角標有相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，標有不同字母表示差顯著(p<0.05)。結果表明：0.5mg/l大黃素處理幼蟲2h后，幼蟲喪失感染草魚的能力。處理濃度為0.4mg/l和0.2mg/l時，草魚的感染率和感染強度與對照相比差異顯著。因此，低濃度的大黃素能降低多子小瓜蟲幼蟲的感染力。實施例5：大黃素對多子小瓜蟲病的防治實驗(1)大黃素藥物的配制：根據實施例1方法，配制成5000、3000和0(對照組)mg/l的藥液。(2)將45尾草魚苗剪去一部分背鰭做標記，然后放入到20l含感染性多子小瓜蟲幼蟲的水中(每升大約10000只感染性幼蟲)，持續4小時，以確保每尾魚都感染上多子小瓜蟲。將感染上多子小瓜蟲的草魚隨機分到9個裝有10l曝氣自來水的玻璃缸(體積15l)中，每缸5尾。再選取90尾健康的草魚苗，隨機分配到各個缸中，使每缸10尾健康魚，與已感染小瓜蟲的草魚混養。隨后向各缸中加入不同劑量的藥液，混勻，使藥液的終濃度分別為0.5、0.3和0mg/l，每個濃度設置3個平行。每天加入與第一天相同劑量的原藥液，持續加藥10天后停藥，之間在第5天更換50％無藥液的新鮮曝氣自來水。在第10天，用150mg/l的麻醉劑(ms222，sigma)麻醉草魚，隨后記錄草魚體表白點的個數，并把藥液更換成無藥液的新鮮曝氣自來水。然后再放置20天，在第20天和第30天時，再次記錄草魚體表的白點數，期間仍不加藥。統計各組的感染率、感染強度和存活率(表2)。表2大黃素對小瓜蟲病的在體預防與治療效果“i”表示被感染草魚；“n”表示未感染草魚；感染強度＝體表白點總數/體表存在白點的魚數；感染率(％)＝(體表存在白點的魚數/總魚數)×100％存活率(％)＝(實驗后存活魚數/實驗前總魚數)×100％；同一縱欄內個數值右上角標有相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，標有不同字母表示差異顯著(p<0.05)。結果表明：大黃素在0.5mg/l的濃度下，藥物累加治療10天，感染魚的感染率降到20±20％，未感染魚的感染率為0；實驗持續第20天時，感染魚和未感染魚的感染率都為0。大黃素在0.3mg/l濃度下，藥物累加治療10天，感染魚和未感染魚的感染強度分別為95.0±21.2和75.3±12.9，顯著低于對照組。由此可見，0.5mg/l的大黃素藥液可以治療和預防多子小瓜蟲病。實施例6：大黃素對草魚的急性毒性實驗(1)藥液配制：方法同實施例1。(2)預實驗：測定大黃素使實驗草魚在24h內全部死亡的濃度為4mg/l，96h不發生死亡的濃度2mg/l。(3)向18個水族箱(體積：15l)中分別加入10l曝氣自來水，和10尾健康草魚，溫度控制在23±0.5℃，并由充氧泵供氧。在預實驗的基礎上設置0(對照)、2、2.5、3、3.5和4mg/l六個濃度組，進行急性毒性實驗。實驗期間隨時觀察各濃度下實驗魚的中毒情況，如果發現草魚中毒死亡，及時撈出，以免破壞水質，影響實驗結果。統計草魚的死亡時間和死亡魚數，計算96h的半致死濃度(lc50)和95％置信區間(使用spss軟件probit程序計算)，結果見表3。藥物對試驗魚的安全濃度(sc)，可按下面的公式進行計算得知：sc＝0.3×48hlc50/(24hlc50/48hlc50)2。表3大黃素半數有效濃度(ec50)及半數致死濃度(lc50)結果表明：大黃素對草魚96h的lc50為3.149mg/l，大約是其4h殺滅幼蟲ec50的17.8倍，是5h殺滅成蟲ec50的7倍。可見大黃素在殺蟲有效范圍內，對魚安全。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁12