本發明屬于生物醫藥技術領域，更具體的，涉及姜黃素(curcumin)在制備防治豬傳染性胃腸炎病毒藥物中的應用。

背景技術：

豬傳染性胃腸炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus,tgev)屬冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，是導致以嚴重腹瀉、嘔吐和脫水為臨床特征的豬傳染性胃腸炎(transmissiblegastroenteritis,tge)的病因。由tgev引起的豬傳染性胃腸炎（tge）是危害世界養豬業的重要疾病之一。不同年齡和品種的豬對本病均易感，其中兩周齡以內的仔豬致死率可達100%，5周齡以上豬的病死率很低，成年豬幾乎沒有死亡。該病1946年由doyle和hutchings在美國首次報道，此后世界上許多國家和地區(日本、英國、法國、荷蘭、德國、意大利、前蘇聯等)都相繼報道。我國最早是1956年在廣東省揭陽、惠來和汕頭市發現該病。自此以后，山東、天津、遼寧、甘肅、河北、山西、陜西等各地陸續發現該病。1976年后該病發病率平均每年以萬分之六、七的速度逐年上升，到1987年發病率達1.69％。1987～l989年全國疫病普查，tge在全國各地普遍存在，發病數仍居高不下。據21個省、市、自治區的統計，共發病豬2350.61萬頭，死亡36.14萬頭，平均發病率為1.61％，死亡率為0.025％。且近年來發病率呈上升趨勢，疫區也更為擴大，并與豬輪狀病毒病、豬流行性腹瀉混合感染，給養豬業造成了嚴重的經濟損失。疫苗接種雖可在一定程度上預防該病，但不能徹底控制疫情的發生。tgev的防控仍是目前我國乃至世界的難題。

眾所周知，病毒感染性疾病是嚴重危害人類健康的常見病和多發病，尋找和開發無污染、低毒副作用的新的、安全有效的，特別是具有我國自主知識產權的抗病毒藥物具有十分重要的理論、經濟和社會意義。我國地大物博，有豐富的中草藥資源，而用中藥治療疾病在我國有上千年的歷史，積累了豐富的經驗。近年來，國內外有關抗病毒中藥的研究日益增多，從中篩選其有效成分已成為當前抗病毒新藥研發的一個熱點。

姜黃為我國常用傳統中藥，是姜科姜黃屬植物姜黃（curcumalongal）的干燥根莖。姜黃根莖中含有姜黃素、脫甲氧基姜黃素和脫二甲氧基姜黃素三種姜黃色素。其中姜黃素是一種低分子量的酸類物質，是姜黃制品中最具活性的成分。長期以來，姜黃素一直被用作藥物、食品調味劑和著色劑?，F代藥理學的研究發現，姜黃素具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗誘變和抗病毒等多方面的藥理作用。姜黃素因其隨處可見，價格低廉而又安全無毒成為了一種極具前景的新型藥物（前體）。

近年來，姜黃素的抗病毒作用研究受到國際上的廣泛關注，已有的研究表明，姜黃素對多種病毒，包括乙型肝炎病毒（hbv）、丙型肝炎病毒（hcv）、日本腦炎病毒（jev）、艾滋病病毒（hiv）、病毒性出血性敗血癥病毒（vhsv）、呼吸道合胞病毒（rsv）、流感病毒(iav)及人單純皰疹病毒i型（hsv-1）等都具有明顯的抑制效果。姜黃素是否也具有抗tgev的活性，至今還未有相關的研究或報道。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是克服現有豬傳染性胃腸炎防治技術和藥物的不足，提供一種能夠防治豬傳染性胃腸炎的物質——姜黃素(curcumin)。所述姜黃素對tgev有很好的抗病毒作用，且其已廣泛用于食品添加劑中，生物安全性好，有望在豬傳染性胃腸炎的防治中取得很好的應用前景。

本發明的目的通過以下技術方案實現：

第一方面，提供姜黃素(curcumin)在制備防治豬傳染性胃腸炎藥物中的應用。

第二方面，提供姜黃素在制備防治豬傳染性胃腸炎病毒藥物中的應用。

優選的，所述姜黃素(curcumin)的使用劑量范圍為10-50μg/ml。

更優選的，所述姜黃素(curcumin)的使用劑量范圍為10-30μg/ml。

第三方面，提供一種抗tgev藥物，其包括有效量的姜黃素。

優選的，所述藥物制劑為注射制劑或口服制劑。

優選的，所述口服制劑為顆粒劑、散片劑或膠囊劑。

優選的，所述注射制劑為凍干粉針劑。

在本發明的具體實施例中，首先確定了姜黃素對pk-15細胞的安全濃度范圍，并以此為依據在pk-15(豬腎上皮細胞)細胞中通過tcid50實驗和real-timert-pcr等多種方法證實了姜黃素在不同作用方式下（先加藥后接毒、先接毒后加藥和藥物與病毒混合感作）對tgev都有很好的抗病毒效果，并闡明了姜黃素在tgev吸附過程中的作用；進一步的，運用雙熒光素酶報告系統分析姜黃素對tgev感染細胞的細胞因子表達的影響，初步闡明其是通過抑制nf-κb通路來抗tgev增殖。

本發明具有以下有益效果：

本發明首次證明了姜黃素(curcumin)的抗tgev的作用，姜黃素能夠顯著降低病毒滴度和n基因的表達，且隨著姜黃素濃度的升高，抑制效果越明顯；姜黃素還能抑制病毒的吸附過程。姜黃素在先加藥后接毒方式下對病毒的抑制效果最好，提示姜黃素對tgev具有一定的預防作用。由于姜黃素在食品添加劑中已有廣泛應用，對細胞及機體幾乎無毒性，故在豬傳染性胃腸炎的防治工作中具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1為mtt實驗檢測姜黃素對pk-15的毒性試驗結果統計圖。

圖2為姜黃素抗病毒試驗中，先加藥后接毒作用方式下的病毒滴度圖。

圖3為姜黃素抗病毒試驗中，先接毒后加藥作用方式下的病毒滴度。

圖4為姜黃素抗病毒試驗中，混合作用方式下的病毒滴度圖。

圖5為姜黃素抗病毒試驗中，三種作用方式處理細胞后經real-timert-pcr試驗檢測的n基因mrna表達水平。

圖6為mtt法檢測姜黃素對病毒吸附過程的影響。

圖7為real-timert-pcr試驗檢測姜黃素對ifn-αmrna表達水平的影響。

圖8為real-timert-pcr試驗檢測姜黃素對ifn-βmrna表達水平的影響。

圖9為雙熒光素酶報告系統檢測姜黃素對nf-κb活化信號的影響。

具體實施方式

通過以下詳細說明結合附圖可以進一步理解本發明的特點和優點。所提供的實施例僅是對本發明方法的說明，而不以任何方式限制本發明揭示的其余內容。

除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。

除非特別說明，以下實例所用試劑和材料均為市購。

本發明以下實施例的統計學分析：所有試驗至少3次重復，結果采用平均值和標準差表示，使用單因素方差分析和t檢驗分析。所有統計分析均采用以p<0.05作為具有顯著統計學差異的檢驗標準。

實施例1姜黃素細胞毒性試驗

配制姜黃素母液：稱取0.1g姜黃素粉末，在超凈臺上加1mldmso溶解，使儲存濃度為100mg/ml，使用時分別用細胞維持液進行稀釋成所需要的濃度。

用含10%胎牛血清的dmem培養基培養pk-15細胞，細胞用胰酶消化后鋪至96孔板（100μl/孔），37°c5.0%co2培養箱中培養至單層，用不同濃度(0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μg/ml)的姜黃素處理pk-15細胞，每個濃度重復3組，同時設置dmso對照組。作用16-18h后，每孔加入20μlmtt溶液（5mg/ml，即0.5%mtt），繼續培養4h。終止培養后小心吸去孔內的培養液，每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速震蕩10min，使結晶物充分溶解，再使用多功能酶標儀讀取各孔吸光值，作圖分析數據。

結果如附圖1所示，低濃度（10，20，30，40或50μg/ml）姜黃素處理組細胞的od值與dmso對照組無顯著差異（p>0.05），高濃度（60，70，80，90或100μg/ml）姜黃素處理組細胞的od值顯著低于dmso對照組（p<0.05），表明姜黃素對pk-15細胞的最大無毒濃度為50μg/ml。

實施例2姜黃素抗病毒試驗

第一種作用方式：先加藥后接毒

先在24孔板內加不同濃度（0，10，20，30，40，50μg/ml）的姜黃素溶液，37℃培養1.5h后用pbs洗滌3次，加入moi=0.1的tgev感染細胞1.5h，洗滌3次后換含有姜黃素的維持液培養24h。每個濃度設置3個重復。

第二種作用方式：先接毒后加藥

先在24孔板內加入moi=0.1的tgev感染1.5h，pbs洗滌3次，加不同濃度（0，10，20，30，40，50μg/ml）的姜黃素溶液，37℃培養1.5h后用pbs洗滌3次，換不含姜黃素的維持液培養24h。每個濃度設置3個重復。

第三種作用方式：毒藥混合作用

將moi=0.1的tgev和不同濃度（0，10，20，30，40，50μg/ml）的姜黃素溶液混合37℃培養1.5h后加入細胞中，繼續培養1.5h后，pbs洗滌3次，換不含姜黃素的維持液培養24h。每個濃度設置3個重復。

以上三種方式處理的樣品均制備兩份。一份樣品（細胞+上清）反復凍融三次后分裝凍存于-80℃，用于后續的tcid50試驗；另一份細胞樣品用pbs洗3遍，每孔加800μltrizol裂解，提取rna，用于rt-pcr。

將上述步驟4中反復凍融的（細胞+上清）樣品各取100μl融化后，進行tcid50實驗：在離心管中用含2%fbs的dmem維持液將病毒液作連續10倍的稀釋，從10^-1-10^-8。將梯度稀釋好的病毒接種到96孔培養板中，每一稀釋度接種一列，共8孔，100μl/每孔。再在每孔加入細胞懸液100μl，使其細胞量達到2~3×10⁵個/ml。同時設正常細胞對照（兩列共16孔，100μl維持液+100μl細胞懸液/孔）。置37℃co2培養箱中培養，每日觀察并記錄細胞病變結果，一般觀察4-6天。按reed-muench兩氏法計算結果。

結果如附圖2（先加藥后接毒）、附圖3（先接毒后加藥）和附圖4（毒藥混合作用）所示。結果顯示，在三種作用方式中，不同濃度的姜黃素處理細胞后，病毒滴度與對照組都有顯著下降，且隨著姜黃素的濃度增大，滴度下降越明顯，呈現劑量依賴性。表明姜黃素對tgev的增殖有抑制作用，且濃度越高，抑制作用越明顯。

提取上述步驟4中trizol裂解的細胞樣品總rna，并反轉錄成cdna后作為模板，以jc-tgev-n-f（5’-ttacaaactcgctatcgcatgg-3’）和jc-tgev-n-r（5’-tgtcacatcacctttacctgca-3’）為引物，進行實時熒光定量pcr測定。

結果如附圖5所示。結果顯示，與對照組相比，tgevn基因的mrna表達水平在不同方式姜黃素處理后均呈現下調的趨勢，表明姜黃素能抑制tgev基因組復制。進一步比較上述三種作用方式下姜黃素的抑制作用，每種方式均顯示隨著姜黃素濃度的逐漸增加，tgev的mrna表達水平被抑制的效果越明顯，呈現一定的劑量依賴性。且先加藥后接毒方式對病毒的抑制效果最好，初步提示姜黃素對tgev具有一定的預防作用。

實施例3姜黃素抑制病毒吸附試驗

將pk-15細胞匯合度至80%的96孔板置于4℃預冷45min-1h后，加含有不同濃度姜黃素（0，10，20，30，40，50μg/ml）的tgev（100tcid50），每個濃度設置6個重復孔，4℃孵育2h。

預冷的pbs洗3次，將未吸附到病毒表面的病毒清洗掉，然后加入新鮮的維持液100μl/孔，置于37℃co2培養箱中繼續培養24h，以mtt法分析姜黃素對tgev吸附過程的影響。

結果如附圖6所示。細胞經過吸附實驗處理24h后，在酶聯免疫檢測儀od490nm處測量各孔的吸光值記錄并做成柱狀圖。結果顯示姜黃素濃度在0-50μl范圍內，隨著其濃度的增加，吸光值越來越高，說明姜黃素對tgev吸附pk-15細胞時有抑制作用，姜黃素具有抗病毒效果。

實施例4姜黃素對細胞因子的影響

1、在24孔板中pk-15細胞匯合至80%時，棄去培養液，pbs洗3遍，以moi=0.1的tgev感染細胞1.5h，洗滌3次后換含有姜黃素（0，30μg/ml）的維持液培養24h。每個濃度設置3個重復，同時設陰性對照和不加任何處理的空白對照。收集細胞對細胞因子ifn-α和ifn-β進行qrt-pcr檢測。

結果顯示，與tgev處理組相比，姜黃素+tgev處理組能夠抑制ifn-α（附圖7）和ifn-β（附圖8）的mrna表達量。

2、在24孔板中pk-15細胞匯合至60%時，運用脂質體轉染法共轉染nf-κb熒光素酶報告質粒（0.1μg）和內參對照質粒phrl-tk（0.05μg）。24h后棄去培養液，pbs洗3遍，以moi=0.1的tgev感染細胞1.5h，洗滌3次后換含有姜黃素（0，30μg/ml）的維持液繼續培養24h（每個濃度設置3個重復，同時設陰性對照和不加任何處理的空白對照）。

收集樣品采用雙熒光素酶檢測試劑盒（promega）和glomax20/20熒光檢測儀分析熒光素酶的活性，通過與內參的比較，確定不同處理組中轉錄因子nf-κb的活性，以分析姜黃素對nf-κb活化過程的影響。

結果顯示：與tgev處理組相比，姜黃素+tgev處理組能夠抑制nf-κb的活化（附圖9）。

以上結果表明，姜黃素通過干擾nf-κb信號通路來發揮抗病毒作用，抑制tgev的復制。

sequencelisting

<110>武漢生物工程學院

<120>姜黃素在制備防治豬傳染性胃腸炎病毒藥物中的應用

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ttacaaactcgctatcgcatgg22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tgtcacatcacctttacctgca22