本發明屬于生物材料技術領域，具體涉及一種以脾臟細胞外基質為原料的水凝膠及其制備方法。

背景技術：

水凝膠(hydrogel)是一種以水為分散介質,通過共價鍵、氫鍵或范德華力等作用相互交聯構成的具有三維網絡結構的高分子材料。因其特有的粘彈性、高含水性和環境響應性等特性而在組織工程、藥物緩釋以及生物傳感器等生物醫學領域具有廣泛的應用前景。

傳統水凝膠可分為合成高分子水凝膠和天然高分子水凝膠。合成水凝膠以丙烯酰胺(aam)及其衍生物的均聚物和共聚物、丙烯酸(aa)及其衍生物的均聚物和共聚物居多。其次，還有聚乙烯醇(ppa)、聚磷腈(ppz)等。天然高分子材料如殼聚糖(cs)、葡聚糖(dex)、瓜膠(gg)、膠原、蛋白質等。由于傳統水凝膠存在生物相容性、響應速度、機械強度等性能問題，研究者一直致力于通過各種方式對傳統水凝膠進行改性來接近細胞外基質。然而這些改性后的傳統水凝膠，無論是超微結構還是生物學功能，仍和天然的細胞外基質相差甚遠。

細胞外基質(extracellularmatrix,ecm)是細胞微環境的重要組成部分，在體內可以調節細胞的生存和功能狀態。由于細胞外基質不僅具有良好的生物相容性，同時還具有多重生物學功能，因此被廣泛應用于組織工程學領域。目前，已經有很多種組織來源的細胞外基質被制備成水凝膠用于治療一些心血管疾病或修復組織的缺損，從而改善組織和復雜器官的功能。不同組織來源的細胞外基質具有不同的組成成分和結構。如心臟細胞外基質、小腸細胞外基質、胎盤細胞外基質等，它們含有不同的生物學成分和具有不同的結構，因此它們在用于治療心血管疾病，用作輔料修復組織缺損，或者用于改善組織器官功能的過程中，具有各自的優勢特點，但是也存在各自的不足之處。

技術實現要素：

為了解決傳統凝膠和其它組織細胞外基質存在的不足，本發明提供了一種以脾臟細胞外基質為原料的水凝膠及其制備方法。

為了實現上述目的，本發明采用了如下的技術方案：一種以脾臟細胞外基質為原料的水凝膠制備方法，包括以下步驟：

(1)制備生物基質材料：取同種或異種來源的脾臟組織進行處理制備成生物基質材料；處理方法是將取材的脾臟去除脾臟組織中的脂肪組織，剪成1～3mm³的組織小塊浸泡在生理鹽水中漂洗，然后經脫細胞處理，得到脫細胞的脾臟細胞外基質。

(2)消化：用去離子水清洗步驟(1)獲得的脾臟細胞外基質去除殘留的脫細胞試劑，真空冷凍干燥，稱重，加入0.01～0.2m的鹽酸溶液并研磨成勻漿，加入胃蛋白酶，恒溫攪拌進行消化，得到均勻粘稠的脾臟細胞外基質溶液。

(3)孵育成膠：在冰浴條件下，用1m的氫氧化鈉溶液調節脾臟細胞外基質溶液ph至中性，然后加入pbs溶液，置于37℃孵育成膠，于4℃保存。

步驟(1)中所述脫細胞處理包括：將脾臟組織小塊浸泡在脫細胞液中，置于37℃，80r/min條件下震蕩20～40小時，更換脫細胞液，置于25℃，60r/min條件下震蕩30～50小時。脫細胞液為0.05％～0.3％sds+1.5％～4％egta，并調節ph至中性。

步驟(2)中所述真空冷凍干燥中凍干溫度為-80～-60℃，真空度為0.1～0.2mbar，時間為24～48h。

步驟(2)中所述胃蛋白酶的濃度為1mg/ml，攪拌溫度為25℃，攪拌頻率為100rmp，攪拌時間為24～48h。

本發明還提供了一種由上述方法制備的水凝膠。

脾臟是人體中最大的免疫器官和造血細胞池，并且脾臟組織的細胞外基質在造血細胞、免疫細胞、淋巴生成、免疫平衡等功能過程中起著重要作用。本發明由脾臟組織的細胞外基質經過脫細胞而來的溫敏性水凝膠，當注射到體內時，它可以表現出自組裝的特點，并有效形成干細胞巢，促進干細胞遷移到病變部位并促進干細胞生存促進血管生成，從而發揮功能。同時，脾臟特異水凝膠可以有效改善病變部位的免疫微環境，促進免疫細胞的生長和淋巴管的生成，從而對病變部位進行有效的修復。

本發明制備的脾臟特異水凝膠具有良好的生物相容性和明顯的生物學功能。在多種重大疾病的臨床治療中具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1為脾臟特異性水凝膠的特征性描述圖；圖中a.未處理的豬的脾臟組織；b.脫細胞后的脾臟組織；c.脫細胞前的h&e染色切片；d.脫細胞后的h&e染色切片；e.脾臟特異性水凝膠成膠；f.電泳定性檢測脫細胞前后組織中的dna；g.脾臟特異性水凝膠的掃描電鏡圖；h.巨噬細胞接種于脾臟水凝膠48h后的掃描電鏡圖；i.巨噬細胞接種于心肌水凝膠48h后的掃描電鏡圖；

圖2為超聲心動圖評價心臟功能圖；如圖標注依次為對照組、心臟水凝膠組、脾臟水凝膠組的超聲心動圖；折線圖依次為ef(射血分數)、fs(短軸縮短率)、e/a(e峰值與a峰值比率)，其中，黑色方塊是未處理的空白對照組，空心圓圈為脾臟水凝膠注射組，黑色三角為生理鹽水對照組；

圖3為缺血再灌注心臟原位注射后表型圖；其中a,b,c,d分別為心肌梗死后注射生理鹽水3天、7天、21天、42天的心臟表型；e,f,g,h分別為心肌梗死后注射脾臟特異性水凝膠3天、7天、21天、42天的心臟表型；

圖4為組織學和免疫組化分析圖；圖中a.脾臟特異水凝膠的h&e染色；b,c分別表示脾臟特異水凝膠組和對照組中m2巨噬細胞的滲透情況；d,e,f分別表示心肌缺血條件下脾臟水凝膠組、心臟水凝膠組、生理鹽水組中微淋巴管密度；g,h,i分別表示心肌梗死注射脾臟水凝膠、心臟水凝膠、生理鹽水后心肌細胞群增加的平均面積；柱狀圖分別為微淋巴管密度和心肌細胞群面積的定量分析。

具體實施方式

本發明提供了一種以脾臟細胞外基質為原料的特異性水凝膠及其制備方法。該脾臟特異性水凝膠具有自組裝的特點并且可以有效改善組織病變部位的免疫微環境，促進免疫細胞的生長和淋巴管的發育，以及提供干細胞生存，促進血管生成，從而對組織起到修復作用。下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述。

實施例1本發明脾臟特異水凝膠的制備

(1)脫細胞：將冰箱保存的同種或異種來源的(如豬)脾臟組織緩慢復溫5～8小時，去除脾門等脂肪組織，剪成1～3mm³的組織小塊浸泡在生理鹽水中漂洗，然后將脾臟組織小塊浸泡在脫細胞液(0.05％～0.3％sds+1.5％～4％egta，并調節ph至中性)中，置于37℃，80r/min條件下震蕩20～40小時，更換脫細胞液，置于25℃，60r/min條件下震蕩30～50小時，得到脫細胞的脾臟細胞外基質。

(2)酶消化：用去離子水在25℃，80rpm條件下震蕩漂洗步驟(1)的脫細胞的脾臟細胞外基質(每隔40～60分鐘換一次水，共15～25次)，去除殘留的脫細胞液，真空凍干(凍干溫度為-80～-60℃，真空度為0.1～0.2mbar，時間為36～48h)，在0.01～0.2m的鹽酸溶液中研磨成勻漿，加入胃蛋白酶(濃度為1mg/ml)，置于25℃，100rmp條件下攪拌消化24～48h，得到均勻粘稠的乳白色脾臟細胞外基質溶液。

(3)孵育成膠：在冰浴條件下，用1m的氫氧化鈉溶液調節脾臟細胞外基質(ecm)溶液ph至中性，然后加入ecm溶液的10％的pbs溶液，置于37℃孵育成膠，于4℃保存。

通過以上步驟即可得到脾臟特異水凝膠。以下通過實施例來說明脾臟特異水凝膠的檢測和應用。

實施例2本發明脾臟特異水凝膠的性質檢測

1.脫細胞脾臟ecm組織檢測

1.1組織包埋切片

(1)取經過實施例1脫細胞處理的脾臟細胞外基質和未處理的脾臟組織，用4％的多聚甲醛固定48小時，流水沖洗過夜。

(2)用梯度酒精進行脫水處理，etc透明過夜。

(3)用tissueteko.c.t.進行冷凍包埋，切割成10μm左右的薄片。

1.2h&e染色

(1)將上述切片37℃烘烤恒長，染色前于65℃烘烤2h以上。

(2)etc脫蠟10min，梯度酒精復水，流水沖洗。

(3)蘇木素染15min，流水洗3次；鹽酸分色10s，流水洗3次；氨水促藍1min，流水洗3次；過75％酒精，伊紅染4min，流水洗3次。

(4)烤干，etc透明5min，中性樹脂封片，采圖。

2.dna定量檢測

樣品中的dna的提取純化：

(1)取經過實施例1脫細胞處理的脾臟細胞外基質和未處理的脾臟組織，研磨成粉末，各取10mg左右。

(2)100μg/ml蛋白酶k在60℃消化48h。

(3)10000g，4℃離心10min，取上清液。

(4)加入等體積的苯酚-氯仿溶液，上下震蕩10min，10000g離心30min，取上層液。

(5)加入十分之一上清液體積的3mol/l的醋酸鈉，2.5倍體積的無水乙醇，4℃靜置過夜沉淀dna。

(6)10000g離心10min，棄去上清，揮干液體，即得dna樣品。

dna檢測：

(1)取上述5～12μgdna樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，定性分析dna片段的長度。

(2)用分光光度計測定上述dna的濃度，計算dna的含量。

3.sds含量的檢測

(1)干燥的脫細胞脾臟組織被剪碎并在液氮中研磨成粉末。

(2)脾臟ecm粉末被溶解在蒸餾水中，加入5ml的氯仿和2ml的甲醇(5％)，混勻靜置。

(3)加入0.6ml亞甲基藍溶液(1％)混合1min。

(4)靜置10分鐘后，用分光光度計測量在660nm處的氯仿含量的吸收峰。

(5)制作標準曲線，然后計算脾臟組織水洗前后的sds殘留含量。

檢測結果(參見圖1)：

1.組織觀察

脾臟組織經過脫細胞處理之后，h&e染色結果顯示細胞外基質中的細胞被明顯去除并且是無核酸物質。而在未經脫細胞處理的脾臟組織中可見大量的細胞成分和核酸物質(如圖1c和d所示)。這說明脫細胞試劑可以有效去除細胞外基質中的細胞。

2.dna定量檢測

dna含量的分析結果表明天然脾臟組織和脫細胞的脾臟組織之間存在著顯著差異。脫細胞脾臟組織中的dna含量(85.01±3.1％＝96.1±28.2ng/mgtissue；p<0.001)與天然脾臟樣品中的dna含量(100％＝6,468.11±646.9ng/mgtissue)相比顯著降低(如圖1中左下方柱狀圖)。凝膠電泳結果分析顯示(如圖1f所示，黑色尖頭所指表示天然脾臟樣品中dna條帶，白色尖頭所指表示天然脾臟樣品中dna條帶，中間為marker)，脫細胞處理后的細胞外基質中仍有比較多的dna殘留，經過胃蛋白酶進一步消化處理，可進一步有效降低組織中的dna含量。

3.sds含量檢測

檢測結果顯示，經過連續不斷地水洗后，脾臟組織中的sds含量比水洗之前有顯著的降低(如圖1中右下方柱狀圖)。脾臟組織在用蒸餾水洗之后的sds濃度(0.006±0.01mg/gtissue)與水洗之前的sds濃度(8.449±0.43mg/gtissue)相比，大約減少了99.93％。

實施例3巨噬細胞接種于脾臟水凝膠的培養

1.外周血中巨噬細胞的分離培養和分化

(1)取大鼠的外周血，通過梯度離心法分離得到大鼠的巨噬細胞。

(2)巨噬細胞接種到培養基(成分為10％的fbs，1％的青霉素或鏈霉素，2mm的左旋谷酰胺和1mm的丙酮酸鈉)中，置于37℃的濕潤環境中，并通入5％的co2培養7天，每隔48小時更換一次培養基。

(3)培養7天后，離心去除上述培養基，用基礎培養基(10％的fbs，100ug/ml的鏈霉素，100u/ml的青霉素組成)繼續培養。

2.脾臟特異水凝膠的掃描電鏡

(1)取上述實施例1制備的脾臟特異水凝膠在37℃條件下溫育1h。

(2)將上述分離培養的巨噬細胞離心去除培養基，用10％的pbs懸浮制備成巨噬細胞懸浮液。

(3)將巨噬細胞懸浮液和脾臟特異水凝膠溶液混合制備成細胞終濃度為2.0x10⁷cells/ml，ecm水凝膠濃度為10mg/ml的混合液。

(4)上述混合液置于20℃培養一段時間后，首先用2.5％的戊二醛固定2h，然后用一系列梯度濃度乙醇沖洗(30～100％)進行脫水處理。

(5)樣品用emitechk575x噴涂機進行銥涂層，然后用掃描電鏡觀察水凝膠的微觀結構。

結果分析(如圖1g、h和i所示)：

掃描電鏡分析表明脾臟細胞外基質由一個納米纖維和多孔材料構成，重組裝的納米材料直徑在40～100nm。巨噬細胞被分別接種在脾臟特異水凝膠和心肌水凝膠中。48小時后，掃描電鏡觀察到與心肌水凝膠相比，在脾臟特異水凝膠中有更多的巨噬細胞生長。這表明脾臟特異水凝膠可以有效促進免疫細胞的生長。

實施例4本發明脾臟特異水凝膠用于注射治療心梗模型

1.大鼠心肌梗死模型和凝膠注射治療

(1)取重量在250～300g的雄性大鼠，用水合氯醛(10g/kg)和阿托品(1mg/kg)通過腹腔注射麻醉并固定在無菌環境中。

(2)用靜脈插管留針和使用動物呼吸機進行60次/分鐘和3毫升/100克體重的呼吸容量進行機械呼吸。

(3)在無菌條件下，打開左胸腔，切除心包。左冠狀動脈用脯氨酸阻塞45分鐘來使心臟局部缺血。

(4)脾臟特異ecm水凝膠(75μl,10mg/ml)，心臟特異ecm水凝膠(75μl,10mg/ml)和生理鹽水對照(75μl)分別用31g的針注射進缺血的心機衰弱組織中。出現明顯的腫脹表明注射成功。用沒有阻塞冠狀動脈的大鼠作為空白對照。

(5)將處理后的大鼠放回恒溫動物房中并提供飼料和水進行喂養。

2.通過超聲心動圖來評價心臟功能

(1)將上述心梗模型大鼠分別在3天、1周、2周、3周和4周時通過腹腔注射麻醉，用超聲系統在13mhz的頻率和100mm/s的速率下測試其左心室的lvdd(左心室舒張末內徑)和lvsd(左心室收縮末內徑)。

(2)計算左室短軸縮短率，計算公式為(lvdd-lvsd)/lvdd]×100％，其中lvdd為左心室舒張末內徑，lvsd為左心室收縮末內徑。

(3)計算ef(左室射血分數)，計算公式為ef＝(edv-esv)/edv]×100％，其中edv為左心室舒張末期容量，esv為左心室收縮末期容量，ef值反映心室的收縮功能。

(4)通過多普勒脈沖波測量二尖瓣口血流速度，分別測量左室舒張早期快速充盈的充盈峰(e峰)和舒張晚期(心房收縮)充盈的充盈峰(a峰)，e/a的比率反映心室舒張功能。

注：上述所有的測量值都是三個連續心臟循環的平均值。

結果分析：(如圖2所示)：

通過心臟超聲來評價心臟功能。分別在3天、1周、2周、3周和4周時測量脾臟特異水凝膠組，心臟水凝膠組，生理鹽水組和空白對照組心梗模型大鼠的lvsd，lvdd，edv和esv等參數，測量結果顯示四組數據之間存在顯著的差異。計算結果表明與心臟水凝膠組和生理鹽水組相比，脾臟水凝膠組的fs(左室短軸縮短率)和ef(射血分數)等指標具有顯著的恢復，這表明脾臟水凝膠可以有效改善心肌梗死后的心臟功能。

3.組織學與免疫組化分析

組織學分析：

(1)將上述經過不同處理的心肌梗死模型大鼠分別在3天，1周，2周，3周和4周的時候用過量麻醉的方法進行處死。

(2)立即取出心臟(如圖3)置于4％的多聚甲醛溶液中浸泡24小時，然后進行冷凍包埋切成10μm左右的薄片(方法同實施例2中1.1)。

(3)將上述切片進行h&e染色(方法同實施例2中1.2)，用光學顯微鏡進行觀察拍照。

免疫組化分析：

(1)用上述方法(方法同實施例2中1.1)制備心肌組織切片。

(2)加入1:100稀釋度的小鼠抗大鼠lyve-1多克隆抗體孵育48小時，然后加入1:200稀釋度的cd206抗體過夜，再加入1:100稀釋度的心肌肌鈣蛋白抗體過夜。

(3)加入1:800稀釋度的驢抗小鼠抗體孵育1個小時，置于室溫1小時對樣品進行染色。

(4)將上述樣品用熒光顯微鏡進行觀察拍照。

結果分析：(如圖4所示)

通過組織切片h&e染色可以看出，在脾臟水凝膠組的心肌梗死區域有適度的單核細胞滲透浸入(如圖4a)，這些單核細胞主要由淋巴細胞和巨噬細胞組成。而且，脾臟水凝膠組中的m2巨噬細胞的滲透水平明顯要高于對照組(如圖4b,c)。通過組織切片免疫熒光染色可以看出，脾臟水凝膠組缺血心肌中的為淋巴管密度(如圖4d)明顯要高于對照組(如圖4e,f)，經計算可得脾臟水凝膠組中的淋巴管密度為24.4+3.3，對照組為5.6+2.5。同時，觀測到活性心肌細胞群在脾臟水凝膠組中的面積(如圖4g)要明顯高于對照組(如圖4h,i)，經計算可得脾臟水凝膠組中的活性心肌細胞群的面積為0.08+0.01mm²，生理鹽水對照組為0.03+0.01mm²。這表明，脾臟水凝膠有助于改善心肌梗死區域的微環境，從而促進淋巴管和心肌細胞的生成。

實施例5本發明脾臟特異水凝膠敷料用于燒傷模型的傷口治療

(1)用1cm直徑的不銹鋼桿在沸水中加熱5分鐘至100℃，在剃毛的大鼠背部生成一致的中度二度燒傷，每只大鼠燒傷三處。

(2)對每只大鼠(n＝9)施加的三處損傷分別用脾臟水凝膠、硅樹脂水凝膠進行敷料，其中一處損傷不做處理作為對照。放置敷料后，用防水粘膜、紗布和彈性繃帶固定敷料。

(3)每隔一天使用數字化測面積法定量測定傷口的大小、肉芽的形成和再上皮化，共14天。

(4)在7天后開始收集處理不同時間的皮膚樣品，樣品用石蠟包埋，切片染色，用顯微鏡進行組織學評估。

結果分析：

脾臟特異性水凝膠組在第8天時觀察到傷口的清創開始，而對照組在第10天才開始。這表明脾臟特異水凝膠可以加速壞死組織的自溶性去除，促進組織再生。在14天時，觀察到脾臟水凝膠組傷口面積愈合大約80％～90％，這明顯高于對照組的60％～70％。這表明脾臟特異水凝膠可以促進傷口的愈合。組織學分析顯示，在14天時，脾臟特異性水凝膠處理的傷口，表皮的再生幾乎完成，在表皮和真皮界面處的基底細胞也已開始穿透真皮，開始形成毛干囊前體。而對照組中傷口中的表皮組織還很薄很脆弱。這表明脾臟水凝膠可以有效促進皮膚創傷后的修復，誘導皮膚組織再生。

實施例6本發明脾臟特異水凝膠用于視網膜損傷修復

(1)破壞小鼠的視網膜致小鼠失明，獲得小鼠視網膜損傷模型。

(2)將上述實施例1中制備的脾臟特異水凝膠注射到失明小鼠的眼部，對照組注射同等體積的生理鹽水。

(3)將處理后的小鼠放回恒溫動物房中飼養，定期對小鼠的瞳孔反應和光敏感性進行檢測。

結果分析：

檢測結果顯示注射脾臟特異水凝膠的小鼠在飼養一段時間后，它們的瞳孔反應恢復了近15％，眼睛開始能探測到光源并有所反應。而注射生理鹽水的對照組瞳孔反應沒有任何恢復，對光源也不敏感。這表明脾臟特異水凝膠可以有效修復視網膜損傷。

實施例7本發明脾臟特異水凝膠用于腦損傷修復

(1)利用線栓法制備小鼠缺血性腦梗死模型。

(2)將上述實施例1中制備的脾臟特異水凝膠注射到腦梗小鼠模型的腦部，對照組注射同等體積的生理鹽水。

(3)將處理后的小鼠放回恒溫動物房中飼養，定期對小鼠進行觀察。

結果分析：

檢測結果顯示注射脾臟特異水凝膠的腦梗小鼠在飼養一段時間后，它們的運動能力有明顯恢復，運動協調性開始有所提高。而注射生理鹽水的腦梗小鼠無明顯變化。這表明脾臟水凝膠能有效對腦損傷進行修復，促進大腦功能的恢復。

實施例8本發明脾臟特異水凝膠用于子宮內膜損傷修復

(1)取成年雌性新西蘭白兔，用戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉。

(2)取下腹部正中切口暴露子宮，沿子宮長軸剪開，剪去子宮內膜凸起部分，生理鹽水紗布止血，將剪開的子宮切口對合整齊并用尼龍線間斷縫合。

(3)分兩組進行不同的處理，自然修復組：縫合子宮切口，關閉宮腔，逐層縫合腹壁，讓受損的子宮內膜自然修復；脾臟水凝膠治療組：關閉子宮腔后，向腔內注射脾臟特異性水凝膠至飽和，隨后逐層縫合腹壁。

(4)將術后的動物置于動物房中飼養，在術后7d和28d分別取各組的子宮標本進行組織學檢測，檢測方法同上述實施例2。

結果分析：

手術剪去了大部分子宮內膜，術后內膜非常薄。術后28d，組織切片he染色顯示自然修復組宮腔內無上皮樣細胞出現，宮腔完全閉塞，內壁相互粘連；而脾臟水凝膠治療組出現連續的上皮樣細胞覆蓋宮腔。術后7d，免疫熒光染色顯示，在脾臟水凝膠治療組中觀察到有mscs細胞歸巢至再生內膜組織，而自然修復組沒有出現此現象。這表明脾臟特異水凝膠可以促進干細胞歸巢，對子宮內膜修復具有重要的作用。

實施例9本發明脾臟特異水凝膠用于脊髓損傷修復

(1)取成年sd大鼠，用戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉。

(2)取背部剪開，暴露脊柱，生理鹽水紗布止血，將脊髓橫斷和半橫斷，制備脊髓損傷模型。

(3)分三組進行不同的處理，自然修復組：注射生理鹽水；單獨細胞組：注射含有細胞(mscs)的培養液；細胞加脾臟水凝膠組：注射脾臟水凝膠和細胞(mscs)混合液。

(4)將術后的動物置于動物房中飼養，在術后每周進行觀察并對其運動功能進行評價，術后5周時取標本進行組織學檢測和免疫組化檢測，檢測方法同上述實施例2。

結果分析：

脊髓損傷是一種嚴重的中樞神經系統損傷，因其較高的發生率和致殘率，常給患者、家庭和社會帶來沉重的負擔。近年來研究發現，局部注射骨髓間質干細胞(mscs)可促進脊髓損傷修復。本實驗通過建立大鼠脊髓損傷模型，分別設置自然修復組、單獨細胞組、細胞加脾臟水凝膠組對脊髓損傷大鼠進行注射治療，并對術后的恢復情況和組織學進行評價。檢測結果顯示：在術后的1～5周，各組動物的運動功能均有不同程度的恢復，其中細胞加脾臟水凝膠組的大鼠運動功能恢復最明顯且持續時間最長，單獨細胞組的大鼠運動功能恢復次之，且在3周后無明顯變化，自然修復組的大鼠只在1周時有很輕微的恢復，1周后無明顯變化。組織學檢測顯示：與自然修復組相比，單獨細胞組和細胞加脾臟水凝膠組的脊髓組織結構較清晰，灰質中壞死區較小，可見白質存在，膠質瘢痕少。與單獨細胞組相比，細胞加脾臟水凝膠組脊髓損傷組織中骨髓間質干細胞(mscs)的數量要多，并且微血管再生和神經再生明顯。結果表明：骨髓間質干細胞(mscs)可有效修復脊髓損傷，但是細胞衰亡較快，修復效果有限。脾臟水凝膠可以為骨髓間質干細胞(mscs)提供適宜的生長微環境，促進細胞生長和發揮功能，從而更加有效修復脊髓損傷。

實施例10本發明脾臟特異水凝膠用于癌癥術后修復

(1)模型建立：取h22腫瘤細胞，3000轉離心5分鐘，再用無菌生理鹽水洗滌腫瘤細胞3次，并做適當稀釋，取40微升細胞懸液加入10微升0.4％臺酚藍染色并鏡檢計數，制成濃度為3×10個/ml的腫瘤細胞懸液，每只小鼠右腋皮下接種腫瘤細胞懸液0.2毫升。

(2)記錄：接種完成后，逐日觀察接種部位腫瘤的生長情況，并稱量小鼠體重。

(3)實驗分組：接種兩周后，取體重和腫瘤大小一致的小鼠進行試驗，小鼠麻醉后，手術切除腫瘤，隨機分為兩組。自然修復組：腫瘤切除后，不做任何處理，直接將傷口進行縫合；水凝膠治療組：腫瘤切除后，用注射器在切除處噴涂一層脾臟特異性水凝膠，然后將傷口縫合。

(4)將上述實驗處理后的小鼠置于恒溫動物箱中飼養，定期觀察小鼠傷口處的恢復情況。飼養兩周后，處死小鼠，將傷口處制備成組織切片并進行h&e染色，觀察免疫細胞生長情況。

結果分析：

檢測結果顯示，腫瘤切除后，自然修復組中的小鼠傷口愈合速度比水凝膠治療組要慢，并且在自然修復組中有腫瘤復發的情況出現，而水凝膠組中無腫瘤復發。組織切片h&e染色結果顯示，水凝膠治療組的腫瘤切除部位的免疫細胞數量要比自然修復組中多。這表明，脾臟水凝膠不僅能夠促進傷口的愈合，抑制腫瘤的復發，還有利于改善腫瘤部位的免疫微環境，促進免疫細胞的生長，有助于腫瘤的術后修復。