本發明涉及d-色氨酸在抑制銅綠假單胞菌產彈性蛋白酶中的應用，屬于生物醫學技術領域。

背景技術：

d-色氨酸(d-tryptophan，d-trp)是一種淺褐色的晶體，分子式是c11h12n2o2，分子量204.23g/mol，熔點是282-285℃。d-色氨酸的分子結構圖如圖1所示。

銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa，pa)是臨床常見的多重耐藥菌，除了頑強的耐藥性，銅綠假單胞菌自身還能產生產生多種毒力因子，包括綠膿菌素、彈性蛋白酶、鼠李糖脂、凝集素等，對患者有明顯的毒副作用。其中彈性蛋白酶主要由基因lasb編碼合成，其毒性作用主要體現在降解免疫系統中的蛋白成分物質，包括補體c3、激肽原、抗菌肽、細胞因子、免疫球蛋白、表面活性蛋白、蛋白多糖、細菌鞭毛蛋白等，大大破壞機體的免疫機制；能損傷組織細胞，抑制纖維母細胞的生長，導致pa的感染患者慢性潰瘍的產生；可通過降解調理素來抵抗表面活性蛋白-a介導的自噬作用。

技術實現要素：

本發明的目的之一，是提供d-色氨酸在抑制銅綠假單胞菌產彈性蛋白酶中的應用。d-色氨酸可有效降低銅綠假單胞菌彈性蛋白酶的產生，降低銅綠假單胞菌感染的毒性作用，這將為臨床上治療銅綠假單胞菌感染性疾病提供新的有效途徑。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：d-色氨酸在抑制銅綠假單胞菌產彈性蛋白酶中的應用。

發明的申請人經過試驗發現，d-色氨酸對銅綠假單胞菌產彈性蛋白酶抑制率：d-色氨酸濃度為5mm時的抑制率>20％，d-色氨酸濃度為10mm時的抑制率>23％。由此可見，d-色氨酸可有效降低銅綠假單胞菌彈性蛋白酶的產生，降低銅綠假單胞菌感染的毒性作用，為臨床上治療銅綠假單胞菌感染性疾病提供新的有效途徑。

本發明的目的之二，是提供一種輔助抗銅綠假單胞菌的藥物。d-色氨酸可用于輔助抗銅綠假單胞菌的藥物中，可以廣泛應用于創傷、燒傷、供皮區以及其它的銅綠假單胞菌感染治療，且安全性高，應用人群廣。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種輔助抗銅綠假單胞菌的藥物，所述藥物中含有d-色氨酸。

在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。

進一步，所述藥物的劑型為乳劑、膏劑或溶液劑。

采用上述進一步的有益效果是：將d-色氨酸制成更多劑型，并應用在醫用材料上，能更廣泛的發揮d-色氨酸抑制銅綠假單胞菌感染后彈性蛋白酶的產生，減少銅綠假單胞菌的毒性作用，為銅綠假單胞菌感染更優選的治療方法。

本發明的有益效果是：

1.d-色氨酸可有效降低銅綠假單胞菌彈性蛋白酶的產生，降低銅綠假單胞菌感染的毒性作用。

2.d-色氨酸對銅綠假單胞菌產彈性蛋白酶抑制率：d-色氨酸濃度為5mm時的抑制率>20％，d-色氨酸濃度為10mm時的抑制率>23％。

3.d-色氨酸可作為一種抗菌輔劑起效劑量小，安全性高。

4.d-色氨酸可用于輔助抗銅綠假單胞菌的藥物中，可以廣泛應用于創傷、燒傷、供皮區以及其它的銅綠假單胞菌感染治療，且起效劑量小，安全性高，應用人群廣。

附圖說明

圖1是本發明d-色氨酸的分子結構圖。

圖2是本發明d-色氨酸對銅綠假單胞菌pao1產彈性蛋白酶的影響。

圖3是彈性蛋白酶的標準工作曲線。

圖4是本發明d-色氨酸對銅綠假單胞菌pao1中lasb基因表達的影響。

具體實施方式

以下結合具體附圖對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。

實施例1

將-80℃保存的銅綠假單胞菌pao1劃板接種至lb固體培養基，37℃培養24h。挑取約1mm²的單克隆菌落至lb液體培養基中，200r/min，37℃培養6-8h。用新鮮ptsb液體培養基(胰蛋白胨50g、tsb培養基2.5g，加超純水定容至1000ml，調節ph至7.2-7.4，121℃高溫滅菌30min),將d-色氨酸溶至10mm，再用培養基依次稀釋。將含不同濃度的d-色氨酸10、5、1、0.1、0mm的lb培養基分別取2ml于12孔細胞培養板中，每孔加入2μl0.5麥氏濁度的銅綠假單胞菌pao1菌液，各濃度做3個復孔。37℃培養24h。吸取待測菌液，4℃、12000rpm離心5min，吸取200μl上清液于新的ep管，加入800μl彈性蛋白酶反應緩沖液(tris-hcl0.1m，cacl21mm)及2mg剛果紅底物。30℃振蕩培養24h后離心去除多余的剛果紅底物，取200μl液體測od495。按上述操作進行彈性蛋白酶標準品工作曲線的測定(圖3)，經濃度換算后，d-色氨酸對銅綠假單胞菌pao1產彈性蛋白酶的影響見圖2，d-色氨酸濃度為5mm時的pao1產彈性蛋白酶的抑制率>20％，d-色氨酸濃度為10mm時的抑制率>23％。

實施例2

將銅綠假單胞菌pao1按實施例1中步驟培養，收集菌液后離心，所得沉淀按照rneasyminikit提取試劑盒的標準操作流程提取各組的rna，測定各組rna濃度后，按體系配比(20μl體系：primescriptrtmastermix4μl、cdna1μg、超純水添至20μl)進行cdna逆轉錄。經普通pcr驗證cdna能擴增彈性蛋白酶編碼基因lasb(具體序列見表1)，下一步進行熒光定量pcr。配制20μl體系包括：premixextorqⅱ10μl，上下游引物各0.8μl，cdna稀釋10倍后取2μl，超純水6.4μl。反應條件為：95℃5s，(95℃5s，61℃30s，72℃20s)×40個循環。擴增產物用管家基因rpsl的量歸一化后再進行比較，實驗重復三次。結果見圖4，發現d-色氨酸能下調銅綠假單胞菌中彈性蛋白酶編碼基因lasb及其上游控制基因lasi和lasr的表達。

表1pcr相關引物匯總表

由此可見，d-色氨酸可有效降低銅綠假單胞菌綠膿菌素及彈性蛋白酶的產生。

實施例3

一種輔助抗銅綠假單胞菌的藥物，所述藥物中含有d-色氨酸。

所述藥物的劑型為乳劑、膏劑或溶液劑。

以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。