本發明屬于生物醫藥領域，涉及達匹維林在治療膠質母細胞瘤的藥物中的應用。

技術背景

膠質母細胞瘤(glioblastoma，gbm)是惡性程度最高的膠質瘤，屬whoiv級，膠質母細胞瘤以手術、放療、化療及其他綜合治療為主，最重要的治療手段為手術治療(comprehensivegenomiccharacterizationdefineshumanglioblastomagenesandcorepathways.nature,2008.455(7216):p.1061-8)。藥物治療在惡性腫瘤的三大療法中發展速度最快。替莫唑胺(temozolomide，tmz)是目前廣泛用于臨床的膠質瘤化療藥，盡管tmz治療后，腦膠質瘤病人的生存期有了很大改變，但是同其他化療藥物一樣，腦膠質瘤對tmz的耐藥性嚴重限制了治療效果而導致腫瘤的復發，這已成為嚴重影響化療效果的主要因素(dehdashti,a.r.,etal.,newtrendsinthemedicalmanagementofglioblastomamultiforme:theroleoftemozolomidechemotherapy.neurosurgfocus,2006.20(4):p.e6)。因此，尋找新的用于術后控制膠質母細胞瘤藥物勢在必行。

根據2009年的統計，世界范圍內大約有3300萬人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)感染者，其中有大約180萬患者死于獲得性人類免疫缺陷綜合征(acquiredimmunedeficiencysyndrome，aids，艾滋病)(unaids[internet].geneva:globalreport:unaidsreportontheglobalaidsepidemic2010)。自1998年高效抗逆轉錄病毒療法(highactiveanti-retroviraltherapy，harrt)被提出并推廣后，艾滋病相關并發癥的發生率及死亡率明顯降低。harrt有效地降低了患者體內病毒載量，使艾滋病患者的平均壽命得到延長(palellafjjr,delaneykm,moormanac,etal.decliningmorbidityandmortalityamongpatientswithadvancedhumanimmunodeficiencyvirusinfection.hivoutpatientstudyinvestigators.nengljmed1998；338:853-60.)。然而與不斷下降的艾滋病相關并發癥的發生及死亡率相比，艾滋病非特異性腫瘤(non-aidsdefiningmalignancies，non-adms)的發生率仍然是逐年增長的，其中就包括膠質母細胞瘤(lohsen,hansenab,gerstoftj,obeln.improvedsurvivalinhiv-infectedpersons:consequencesandperspectives.jantimicrobchemother2007；60:461-3.)。大量流行病學調查顯示，使用免疫抑制劑會增加顱內膠質瘤的發病率(salvatim,fratia,carolie,etal.glioblastomainkidneytransplantrecipients.reportoffivecases.jneurooncol2003；63:33-7,n,-kesv,kesp,-cunkov,-baronicak.[neurologicalcomplicationsinrenaltransplantrecipients].actamedcroatica2008；62suppl1:76-81)，而hiv/aids患者體內免疫功能不全的狀態，同樣為惡性腫瘤的發生提供了可乘之機，choy等人通過分析17例hiv相關性膠質母細胞瘤，發現hiv陽性的膠質母細胞瘤患者較hiv陰性的膠質母細胞瘤患者平均年齡更低(w.choy,c.lagman,etal.impactofhumanimmunodeficiencyvirusinthepathogenesisandoutcomeofpatientswithglioblastomamultiforme.braintumorrestreat2016；4(2):77-86)。hiv/aids患者膠質瘤相對早的發病年齡，可能與hiv介導的免疫抑制有關。

對于艾滋病伴發惡性腫瘤的患者，聯合應用抗腫瘤化療及harrt已顯示出有效性。maso等通過檔案連鎖研究分析hiv/aids患者(1986年到2005年)使用harrt后，癌癥發生率的改變情況。研究表明，接受harrt的患者，中樞神經系統腫瘤的標準化發病比(standardizedincidenceratios，sir，from1986–1996and1997–2004)從3.5(95％ci:1.5–7.0)降至3.2(95％ci:1.4–6.3)(dalmasol,poleselj,serrainod,etal.patternofcancerriskinpersonswithaidsinitalyinthehaartera.brjcancer2009；100:840-7.)。shiels等對24例hiv/aids患者接受haart前后，腦腫瘤發生情況進行meta分析。分析結果表明，腦腫瘤的sir從1.9(95％ci：0.66-5.7)降至1.0(95％ci：0.63-1.7)(shielsms,colesr,kirkgd,poolec.ameta-analysisoftheincidenceofnon-aidscancersinhiv-infectedindividuals.jacquirimmunedeficsyndr2009；52:611-22.)。

目前對于艾滋病并發腫瘤的患者，其抗腫瘤化療與之間潛在的藥物相互作用了解不多，可用于安全指導和抗腫瘤化療聯合應用的研究數據非常有限，缺乏基于臨床試驗的普遍可行的詳細指南,所以現在臨床醫生和臨床研宄員只能從藥物代謝的相關知識去推測藥物間可能存在的相互作用，從而制定治療方案(marudek,cflexneretal.useofantineoplasticagentsinpatientswithcancerwhohavehiv/aids.lancetoncol.2011；12:905-12)。如果抗hiv藥物本身具有抗腫瘤細胞活性，一定程度上可以減輕藥物合用(抗hiv藥物與抗腫瘤化療藥物)帶來的潛在不確定的相互作用。前人研究發現，蛋白酶抑制劑可能有潛在的抗膠質母細胞瘤活性。利托那韋，一種hiv蛋白酶抑制劑，能夠阻斷細胞內泛素化通路，同時阻滯膠質瘤細胞周期、誘導其凋亡，從而表現出抗膠質瘤活性(guptaak,cernigliagj,mickr,mckennawg,muschelrj.hivproteaseinhibitorsblockaktsignalingandradiosensitizetumorcellsbothinvitroandinvivo.cancerres2005；65:8256-65.)。laurent等在體外實驗中發現，利托那韋對膠質瘤細胞有細胞毒性(laurentn,deboüards,guillamojs,etal.effectsoftheproteasomeinhibitorritonavirongliomagrowthinvitroandinvivo.molcancerther2004；3:129-36.)。蛋白酶抑制劑作為haart的特殊治療效果已經得到肯定，能否將其用于抗膠質瘤，還有待進一步研究證實。

達匹維林(dapivirine，tmc120)是新一代的非核苷逆轉錄酶抑制劑(non-nucleosidereversetranscriptaseinhibitor，nnrtis)，tmc120是這種化合物的別稱代號，化學式寫作c20h19n5，全稱為4-{{4-[(2,4,6-三甲苯基)-氨基]-2-嘧啶}-氨基}-苯甲腈(4-{{4-[(2,4,6-trimethylphenyl)-amino]-2-pyrimidinyl}-amino}-benzonitrile)。目前，達匹維林主要作為陰道的殺微生物劑，被制成半固體凝膠、彈性硅膠兩種劑型置于陰道環內(akil.a.,etal.,developmentandcharacterizationofavaginalfilmcontainingdapivirine,anon-nucleosidereversetranscriptaseinhibitor(nnrti),forpreventionofhiv-1sexualtransmission.drugdelivtranslres,2011.1(3):p.209-222.)。華盛頓大學全球衛生部國際臨床研究中心baeten博士等，為此開展了一項隨機、安慰劑對照、雙盲、3期臨床試驗，旨在研究含達匹維林的陰道環對女性預防hiv-1感染的作用。結果發現，該暴露前預防方法可適度降低女性hiv感染風險以陰道環的形式在體外實驗及間接體內療法中均能有效地阻止hiv-1的感染(fletcher.p.,etal.inhibitionofhumanimmunodeficiencyvirustype1infectionbythecandidatemicrobicidedapivirine,anonnucleosidereversetranscriptaseinhibitor.antimicrobagentschemother,2009.53(2):p.487-95.)。

目前為止，尚未有相關文獻證實達匹維林有抗膠質瘤活性。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種達匹維林的新應用，具體是：達匹維林在制備治療膠質母細胞瘤的藥物中的應用。

本發明采用的gbm細胞是人膠質母細胞瘤細胞株u87，體外細胞毒性實驗結果表明，達匹維林對人膠質母細胞瘤細胞株u87的半抑制濃度ic50是10.73μmol/l。

本發明檢測了達匹維林在體外對人膠質母細胞瘤細胞株u87的生長抑制作用，達匹維林的有效藥物濃度是4μmol/l。

本發明檢測了達匹維林對u87遷移侵襲能力的影響，達匹維林的有效藥物濃度是4μmol/l。

本發明檢測了達匹維林對u87細胞增殖、凋亡、自噬、上皮-間質轉化相關蛋白表達的影響，達匹維林的有效藥物濃度是8μmol/l。

在達匹維林調節u87細胞內信號通路的實驗中，達匹維林的藥物濃度是16μmol/l。

本發明還利用裸鼠體內移植瘤模型檢測達匹維林體內抗腫瘤活性，所用達匹維林濃度為16mg/kg(溶解于含5％dmso的生理鹽水中)，每3天腹腔注射給藥1次。

在sd大鼠藥物毒性試驗中，達匹維林組給藥劑量為16mg/kg，腹腔注射給藥，0、3d各給藥1次，共2次，設3w恢復期。

通過上述實驗，本發明首次證實了達匹維林具有體外抗膠質瘤細胞的效果；也首次證實了達匹維林具有體內抗膠質瘤細胞的效果，能夠延緩腫瘤增長、介導腫瘤凋亡；同時首次證實了達匹維林能夠誘導膠質母細胞瘤細胞產生應激反應，通過激活jnk通路和pi3k/akt通路，解除原本腫瘤細胞內凋亡的抑制狀態，激活自噬通路，從而抑制膠質母細胞瘤細胞增殖，促進膠質母細胞瘤細胞遷移。

附圖說明

圖1顯示cck-8試驗檢測達匹維林對gbm細胞u87的細胞毒作用。

圖2顯示cck-8試驗檢測達匹維林體外條件下對gbm細胞的增殖抑制作用。

圖3顯示transwell小室試驗檢測達匹維林體外條件下對gbm細胞的遷移促進作用。

圖4顯示westernblotting分析達匹維林作用于gbm細胞，細胞增殖、凋亡、自噬、上皮-間質轉化相關蛋白表達變化情況。

圖5顯示流式細胞術檢測達匹維林在體外對gbm細胞的凋亡誘導作用。

圖6顯示patnscanintracellularsignalingarraykit檢測達匹維林體外條件下對gbm細胞內信號通路的影響。

圖7顯示裸鼠皮下成瘤試驗檢測達匹維林的體內抗腫瘤活性。

圖8顯示免疫組化ki67染色檢測達匹維林體內條件下對gbm細胞的增殖抑制作用。

圖9顯示腫瘤組織切片tunel染色檢測達匹維林體內條件下對gbm細胞的凋亡誘導作用。

圖10顯示體內毒性試驗檢測達匹維林有效抗腫瘤劑量下對肝、腎功能的影響。

具體實施方式

以下是本發明的實施例，但不以任何形式限制本發明。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。

本發明進行了以下實驗方法來驗證達匹維林可以用于制備治療膠質母細胞瘤藥物：

(1)cck8法，檢測達匹維林在體外對膠質母細胞瘤細胞株u87的細胞毒作用；

(2)transwell試驗，檢測達匹維林在體外影響腫瘤細胞遷移侵襲能力；

(3)westernblotting蛋白印跡法，檢測達匹維林在體外對u87細胞增殖、凋亡、自噬、上皮-間質轉化相關蛋白表達的影響；

(4)流式細胞術，檢測達匹維林在體外誘導細胞凋亡情況；

(5)pathintracellularsignalingarraykit(path細胞內信號通路抗體芯片試劑盒)，檢測達匹維林在體外對u87細胞內信號通路的影響；

(6)裸鼠體內移植瘤模型，研究達匹維林的體內抗膠質母細胞瘤活性；

(7)大鼠毒性試驗模型，研究達匹維林在抗腫瘤作用濃度下，生物體對其有無明顯毒性反應。

1.檢測達匹維林體外條件下對gbm細胞的細胞毒性作用

cck8試驗用于檢測dapivirine對u87細胞增殖的影響。將處于對數生長期的u87制成細胞懸液后接種于96孔板并培養24h.換為含dapivirine不同濃度(4、8、16、32、64μm)的培養液。以dmso作為陰性對照并每組設5個復孔。孵育48h后加入cck8溶液37℃孵育2h后全自動酶聯免疫檢測儀上避光振蕩混勻并測各孔吸光值(od值)，波長490nm，實驗重復三次取平均值。采用數據分析軟件spss20.0計算分析各組細胞生長抑制率(inhibitionrate，ir)和ic50，采用oneway-anova方法,各組分別與對照組比較采用dunnett檢驗；p＜0.05具有統計學顯著性差異。

細胞毒性試驗結果顯示，ir(％)隨dapivirine濃度而增加(p<0.001)，ic50計算得10.73μmol/l(圖1)。

2.檢測達匹維林體外條件下對gbm細胞活力的影響

cck8試驗用于檢測dapivirine對u87細胞增殖的影響。將處于對數生長期的u87制成細胞懸液后接種于96孔板并培養24h.換為含dapivirine不同濃度(4、8、16μmol/l)的培養液，以dmso作為陰性對照并每組設5個復孔，分別培養24,48,72,96，120小時后，加入cck8溶液37℃孵育2h后全自動酶聯免疫檢測儀上避光振蕩混勻并測各孔吸光值(od值)，波長490nm，實驗重復三次取平均值。采用數據分析軟件spss20.0計算分析各組細胞活力，采用oneway-anova方法,各組分別與對照組比較采用dunnett檢驗；p＜0.05具有統計學顯著性差異。

細胞活力試驗結果如圖2所示，16μmol/l濃度的達匹維林作用下，gbm細胞u87的增殖能力受到明顯抑制。

3.檢測達匹維林體外條件下對gbm細胞遷移的影響

transwell小室試驗用于檢測細胞遷移能力。在transwell小室(corning公司)的下室中加入含10％fbs的dmem培養基600ul。體外培養u87細胞，待細胞饑餓處理12h以后，加入含不同濃度達匹維林的無血清dmem培養基(藥物終濃度分別為0、8、16μmol/l)制成10⁵/ml單細胞懸液，每個上室加入200μl細胞懸液，37℃，5％co2,95％濕度培養箱中培養12h后取出小室，棄去小室內培養液，濕棉簽擦去上面未穿過微孔的細胞，甲醇固定1h，pbs洗3遍后置于dapi中染色2min，再用pbs洗3遍后倒置顯微鏡下觀察。隨機取5個視野，計數每個視野內的穿過微孔的細胞數，以遷移細胞的相對數目來表示腫瘤細胞的侵襲能力，遷移抑制率(％)＝(1－實驗組侵襲細胞數/對照組侵襲細胞數)×100％。

結果如圖3所示，8μmol/l和16μmol/l濃度的達匹維林作用下，gbm細胞的遷移能力有所增強。

4.檢測達匹維林體外條件下對gbm細胞增殖、凋亡、自噬、上皮-間質轉化相關蛋白表達的影響

4.1.蛋白樣品的提取和制備：將u87細胞培養在25cm²培養瓶中，待細胞生長達60％左右，加入達匹維林終濃度為16μmol/l的dmem培養基(對照組為dmso)，孵箱培養0h、12h、24h或48h后分別提取細胞總蛋白。用預冷的pbs輕輕清洗培養瓶2次，每次2ml。用吸引器小心吸出殘留瓶中的液體，到吸干為止。每瓶加入150μl細胞裂解液，均勻搖晃，冰上裂解15min后，用細胞刮將細胞刮下，移液器將細胞懸液移入1.5ml離心管，再用1ml注射器對細胞懸液進行反復抽吸20次，利用剪切力切斷大片段核酸。4℃，12000rpm離心30min，收集上清液，即為所需蛋白樣品。預留10μl用于蛋白定量，其余樣品立即凍存于-80℃保存或者加入1/4體積的5×上樣緩沖液，沸水中煮5min，保存于-20℃。

4.2.蛋白定量：配制bca工作液使用bca試劑盒(solarbio公司)，取適量a液和b液，按50:1的比例將a液和b液混合均勻。稀釋標準品(5mg/ml)取20μl標準品，用pbs稀釋至100μl，使終濃度為0.5mg/ml，按0、4、8、12、16、20μl分別加入8孔中(96孔板)，并用pbs補足每孔至20μl。使每孔蛋白濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1mg/ml。將2μl提取的蛋白樣品加入96孔板中，并加入18μlpbs。每孔加入200μlbca工作液，37℃放置30min。冷卻至室溫，用酶標儀測定a562吸光度，根據標準曲線計算樣品蛋白濃度。

4.3.sds-page電泳與轉膜：認真清洗玻璃板，避免殘留膠粒，組裝好玻璃板，用去離子水確定無滲漏。配制10％分離膠，混合均勻，將溶液平緩地注入兩層玻璃板中，高度為距玻璃板上緣1.5cm左右，再在液面上小心注入1ml去離子水，靜置20～30min后，待下層膠凝固，將上層液體側倒出來。配制5％上層膠，混合均勻，以連續平穩的液流注入玻璃板中，隨即小心插入成孔器，靜置30min，待上層膠凝固完畢。配制電泳緩沖液，稱取tris堿3.03g，甘氨酸14.4g，sds1.0g，去離子水定容至1000ml。組裝電泳裝置、上樣、電泳上層膠采用80v，下層膠120v，待藍色線條移動至玻璃板底端，電泳結束，關閉電源。

轉膜：配制轉移緩沖液稱取tris堿3.03g，甘氨酸14.4g，去離子水定容至800ml溶解，加入甲醇200ml。

組裝轉膜夾子：將夾子在轉移液中展開，向夾子黑面依次放置襯墊，雙層濾紙，電泳完畢的凝膠，pvdf膜，雙層濾紙，襯墊，小心合上夾子。將組裝好的轉膜夾子裝入轉移槽中，夾子黑面在轉移槽黑面一側，白面在轉移槽紅色一側。將轉移槽倒滿轉移液，并放入一個冰袋，連接導線，注意正負極，設定電流300ma，，120min。

4.4.免疫反應：配制tbst緩沖液先配制10×tbs500ml(tris堿12.1g；nacl40g；去離子水定容至500ml)，取100ml10×tbs用去離子水稀釋至1000ml，加入tween-201ml后混勻。根據marker標記剪取目的條帶，并用圓珠筆作好標記。在搖床上，用tbst緩沖液洗去膜上殘留的轉膜液，80rpm，5min×3次，再用tbst配制的5％脫脂奶粉封閉條帶1h，設定搖床60rpm。將tbst緩沖液配制的適當濃度的一抗緩沖液和條帶置入封口的干凈塑料袋子中，搖床60rpm，室溫封閉1h后，平整放置于4℃冰箱中過夜。將條帶取出，用tbst洗滌，搖床80rpm，5min×3次。再用tbst配制的二抗緩沖液室溫封閉1h，搖床60rpm。

4.5顯影、定影：已標記上不同蛋白的膜，用ecl發光液覆蓋，反應后，于暗室內顯影、定影。

結果如圖4顯示，n-cadherin，間質細胞的標志物之一，表達量隨達匹維林作用時間增加而升高,如圖4(a)?？俢aspase-3，細胞凋亡的重要調節蛋白，表達量隨達匹維林作用時間增加而降低，同時caspase-3的降解產物，cleavedcaspase-3，表達量隨達匹維林作用時間增加而升高，見圖4(b)。自噬主要標志物之一的lc3a/b，westernblotting結果顯示lc3a/b-ii與lc3a/b-i比值隨達匹維林作用時間增加而升高。atg7以及beclin-1，同樣作為自噬的標記物，表達量隨達匹維林作用時間增加，呈現先升高后降低的表現，作用時間24h時表達量最高,如圖4(c)所示。與細胞增殖相關的蛋白akt、p-akt、p-snk/jnk表達量隨達匹維林作用時間增加而呈現先升高后降低的表現，akt與p-akt在作用時間24h時表達量最高，p-snk/jnk表達量隨達匹維林作用時間增加而升高，結果如圖4(d)所示。

5.檢測達匹維林在體外誘導細胞凋亡情況

流式細胞儀檢測達匹維林在體外誘導細胞凋亡情況：u87細胞在dmem培養基含體積分數為10％胎牛血清，100ku/l青霉素和100mg/l鏈霉素，37℃，5％co2飽和濕度培養箱中培養，0.25％胰酶消化傳代，以2×10⁵/孔接種6孔板，24h后細胞貼壁生長狀態良好時開始實驗操作。藥物設計：設計藥物濃度0、8、16μmol/l的達匹維林處理u87細胞，藥物處理：棄細胞培養板中原有的培養基，按藥物設計的濃度加入含藥培養基處理細胞。將上述細胞板置于5％co237℃培養箱內，繼續培養12h、24h、48h后停止培養。用不含的胰蛋白酶消化細胞，離心后細胞用pbs洗2次，再將細胞分別轉移至流式管。將fitcannexinvapoptosisdetectionkit中的緩沖液用去離子水稀釋成1×緩沖液，然后每個流式管中加入100μl的1×緩沖液混懸細胞。每個流式管中分別加入fitcannexinvapoptosisdetectionkit中的fitcannexinv和pi各5μl，避光，室溫放置15min。每個流式管中再分別加入400μl的1×緩沖液，充分混勻后于1h內上樣，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

結果如圖5顯示，在藥物濃度為16μmol/l時，隨著藥物作用時間延長，達匹維林誘導u87細胞凋亡的程度增強；在達匹維林濃度為8μmol/l時，對u87細胞無明顯凋亡誘導作用。6.檢測達匹維林對gbm細胞內信號通路的影響

6.1.制備細胞裂解產物：使用patnscanintracellularsignalingarraykit試劑盒內的1x細胞裂解液，按1ml裂解液加10μlpmsf(100mm)(solarbio公司)或加入蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(solarbio公司)至終濃度為1mm，搖勻置于冰上。倒掉培養液，并將皿(直徑10cm)倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液。每皿細胞加5ml4℃預冷的pbs(0.01mph7.2～7.3)。平放輕輕搖動1min洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養液。將pbs棄凈后把培養皿置于冰上。每皿細胞加500μl含pmsf的裂解液，于冰上裂解2min，為使細胞充分裂解培養皿要經常來回搖動。裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養瓶的一側(動作要快)，然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。(整個操作盡量在冰上進行。)4℃下12000rpm離心3min。(提前開離心機預冷)將離心后的上清分裝轉移倒0.5min的離心管中。bca法測蛋白濃度，并用arraydiluentbuffer將所有蛋白濃度調至0.2–1.0mg/ml。

6.2.使用pathscan試劑盒檢測細胞蛋白：使用雙蒸水將試劑盒內20x的緩沖洗滌液稀釋至1x工作濃度。使用試劑盒內的抗體稀釋液將20x的抗體混合物稀釋成1x工作濃度。將試劑盒內20x的hrp-linkedstreptavidin稀釋至1x工作濃度。將試劑盒內有硝酸纖維涂層的玻璃板、分隔柵欄和金屬固定夾取出后組裝起來，將硝酸纖維膜分隔成16個小格。保證硝酸纖維涂層面朝上。向每格內滴加100μl封閉液，置于搖床上，轉速60rpm，室溫封閉15min。吸去封閉液，向每格內滴加50-75μl細胞裂解液，置于搖床(60rpm)室溫孵育2h。吸去細胞裂解液，每格內滴加100μl1x緩沖洗滌液，置于搖床(80rpm)洗滌5min×3次，吸去洗滌液。每格內加入75μl1x抗體混合物，置于搖床(60rpm)室溫孵育1h。吸去抗體混合物，每格內滴加100μl1x緩沖洗滌液，置于搖床(80rpm)洗滌5min×4次，吸去洗滌液。每格內滴加75μl1xhrp-linkedstreptavidin，置于搖床(60rpm)室溫孵育30min。吸去hrp-linkedstreptavidin，每格內滴加100μl1x緩沖洗滌液，置于搖床(80rpm)洗滌5min×4次，吸去洗滌液。拆下金屬夾及分隔柵欄，將有硝酸纖維素涂層面的玻璃板用用ecl發光液覆蓋，反應后，于暗室內顯影、定影。

pathscan結果顯示，達匹維林作用下，gbm細胞的akt(ser473),bad(ser112)和sapk/jnk(thr183/tyr185)的磷酸化水平較未作用組明顯升高。

實施例2檢測達匹維林的體內抗腫瘤活性

6.1.4到6周的雄性裸鼠在spf級動物實驗室飼養一周，以適應環境。u87細胞在dmem培養基(含體積分數為10％胎牛血清，100ku/l青霉素和100mg/l鏈霉素)，37℃，5％co2,飽和濕度培養箱中培養。接種裸鼠前，用0.25％胰酶消化傳代，離心后用pbs吹打混勻，重復離心1次。然后用預冷的pbs吹打均勾細胞成混懸液，置于碎冰上冰浴，備用。將腫瘤細胞懸液接種到裸鼠的右側背部皮下，每只裸鼠接種腫瘤細胞的個數約5×10⁷，觀察成瘤情況，如圖7(a)。2周后可見裸鼠右側背部形成直徑0.3cm瘤塊，開始給藥。給藥方案：對照組，含5％dmso的生理鹽水，每3天給藥1次；達匹維林濃度16mg/kg(溶解于含5％dmso的生理鹽水中)，每3天給藥1次；2組裸鼠均釆用腹腔注射給藥，實驗全程監測裸鼠體重，見圖7(b)。當對照組腫瘤最大者直徑超過1cm后結束給藥，處死裸鼠取出腫瘤組織，見圖7(c)。累計給藥4次。用游標卡尺測量腫瘤大小如圖7(d)，按照以下公式計算：v(體積)＝l×w²/2，其中l是腫瘤縱軸的長度，w為腫瘤橫軸的長度。切取大小適宜的腫瘤組織，用4％的多聚甲醛固定過夜。將固定組織用酒精進行梯度脫水，后石蠟包埋，制成石蠟塊后將包埋腫瘤組織切成厚度5μm的石蠟切片，再用載玻片將石蠟切片撈起、烤片機上烘干。

6.2.he染色、免疫組化、tunel染色

he染色：切片脫蠟脫水：二甲苯、酒精(濃度由高到低)，蒸餾水洗凈，蘇木素染色1min，自來水沖干凈，鹽酸分化1秒，自來水沖干凈，伊紅浸染1秒，酒精從低到高脫水，自然晾干，中性樹脂封片，顯微鏡下鏡檢，如圖8(a)。

免疫組化：切片置于二甲苯中脫蠟，梯度酒精洗去二甲苯。蒸餾水洗凈，用枸櫞酸鈉抗原修復液行熱抗原修復20min，自然冷卻到室溫，pbs漂洗5min，重復3次，用3％h2o2室溫10min阻斷內源性的過氧化物酶，pbs漂洗5min，重復3次，用正常的羊血清封閉非特異性的結合位點，pbs漂洗5min，重復3次，每片玻片滴加50pl稀釋為工作液的一抗ki67室溫孵育2小時，pbs漂洗5min，重復3次，加入辣根過氧化物標記的二抗，室溫30min，pbs漂洗5遍，重復3次，然后滴加dab顯色3～10min，顯微鏡下觀察有無顯色。蘇木素復染，自來水沖干凈，鹽酸分化1s，自來水沖干凈，50-60度水中返藍，梯度酒精脫水，中性樹膠封片，標記然后鏡檢,結果如圖8(b)所示。

tunel染色：使用tunel試劑盒(roche細胞凋亡原位檢測試劑盒，pod)。組織切片進行脫臘和水合處理，將組織切片浸入蛋白酶k工作液，21-37℃下反應15-30min。制備tunel反應混合液：滴加50μl酶溶液(管1)至余下的管2標記溶液中(約450μl)，得到總體積500μl的tunel反應混合液。設置陰性對照樣品：將經固定和通透處理的細胞與50μl/每孔的標記溶液一起孵育，標記溶液中無末端轉移酶(非tunel反應混合液)。設置陽性對照樣品：將經固定和通透處理的細胞與微球菌核酸酶或重組的dnasei，gradei(3000u/ml-3u/ml，溶于50mmph7.5的tris-hcl，含10mmmgcl2，1mg/mlbsa)，15-25℃下處理10min，在標記反應前誘導dna鏈斷裂。使用蛋白酶k預處理組織切片后，用pbs漂洗玻片2次。吸干樣品周圍的水分，滴加50μltunel反應混合液到樣品(對于陰性對照樣品，每個樣品滴加50μl不含末端轉移酶的標記溶液)。加蓋，37℃下避光和加濕環境下反應60min。用pbs漂洗玻片3次。熒光顯微鏡下，加滴pbs，進行樣品分析。采用450-500nm激發波長，在515-565nm(綠光)范圍內進行熒光信號檢測。吸干樣品周圍的水分，滴加50μlpod轉換液(管3)到樣品上，37℃加濕環境下反應30min。pbs漂洗玻片3次，滴加50-100μldab底物或者其他的pod底物，顯微鏡下觀察有無顯色。pbs漂洗玻片3次。蘇木素復染，中性樹膠封片鏡檢，結果如圖9所示。

結果顯示，達匹維林組he染色切片在顯微鏡下可見點狀壞死灶被伊紅著色，對照組的he染色切片在顯微鏡下未見腫瘤壞死灶；ki67免疫組化染為棕褐色的代表增殖活性強的腫瘤細胞，達匹維林組的ki67陽性率(9.93±1.53％)明顯低于對照組(25.78±1.89％)；tunel染色染為棕褐色的代表凋亡細胞，達匹維林組的凋亡細胞所占比率(4.00±0.83％)顯著高于對照組(1.32％±0.30％)。結果證實，達匹維林能夠介導腫瘤組織的細胞凋亡，抑制腫瘤組織增殖。

6.3.毒性試驗：取14只6～7周齡sd大鼠，雌雄各半，隨機分為2組，分別為達匹維林組和陰性對照組，腹腔注射給藥，0、3d各給藥1次，共2次，設3w恢復期。其中，達匹維林組每只給藥劑量為16mg/kg，陰性對照組則每只給予1ml生理鹽水。每次給藥次日觀察注射部位有無發紅、腫脹、化膿、壞死等異常反應。檢測指標：初次給藥后約1w、恢復期第2w、第3w采血進行血清生化檢驗，血生化指標包括：肝功能(alt、ast)和腎功能(crea、urea)相關指標，結果如圖10所示。

結果顯示：臨床癥狀觀察結果顯示各組動物在給藥前后均未見任何異常癥狀。觀察至第3w，全部動物無異常癥狀，無死亡。達匹維林組與對照組血清生化檢驗結果顯示，給藥前(第0d)兩組大鼠4項血生化指標均無異常；初次給藥后1w時，查alt、ast、urea均無異常，crea結果示達匹維林組高于陰性對照組；恢復期第2、3w復查血生化指標，達匹維林組與對照組4項指標均無異常。試驗結果表明在給予大鼠抗腫瘤劑量的達匹維林時，該藥物對于肝臟無明顯毒性，對于腎臟可能有一過性損傷作用，但并無持久影響。