背景技術：

1、法布里病(fabry?disease)是一種罕見的進行性先天性代謝疾病，由gla基因突變導致溶酶體酶α-半乳糖苷酶a?(α-gal)缺乏而引起。法布里病影響四萬分之一的男性，這些男性患有多系統疾病，通常是在兒童或青少年時期患上。法布里病也會影響女性并表現出多種癥狀。缺乏α-gal酶活性會導致其主要底物神經酰胺三己糖苷(gb3)和它的脫乙酰可溶形式三聚己糖鞘胺醇(lysogb3)逐漸全身積累。如果不進行治療，法布里病患者的預期壽命會縮短，通常會因影響腎、心臟和/或中樞神經系統的血管疾病而在四十歲或五十歲左右死亡。

2、法布里病的神經表現包括周圍神經系統，在許旺細胞(schwann?cell)和背根神經節中發現神經酰胺三己糖苷積累。一些患者的法布里病與疼痛的發生有關，這可能由背根神經節和交感神經節中的脂質沉積或小纖維神經病變引起。周圍神經病變影響超過四分之一的法布里病患者，并且其特征為小的有髓和無髓纖維損失，而較大纖維基本上不受影響(ohnishi和dyck.?loss?of?small?peripheral?sensory?neurons?in?fabry?disease.arch?neurol?1974;31:120)

3、通過引入功能性酶的酶替代療法(“ert”)是目前批準的法布里病治療方法。雖然ert在許多情況下有效，但該治療需要終生每兩周靜脈內施用α-gal一次。ert解決了與法布里病相關的癥狀，但不能治愈，而且不能阻止疾病的進展。藥理反應不足主要由于酶的循環半衰期短和細胞遞送不理想。因此，業內亟需能夠阻止疾病進展并且可能具有治愈性的用于治療法布里病的療法。基因療法是一種有前途的治療。

技術實現思路

1、本技術涉及使用重組腺相關病毒載體(raav)介導α-半乳糖苷酶a?(gla)基因的轉移和表達的基因療法方法。具體來說，本技術尤其公開了用于減輕、治療和/或預防法布里病中的周圍神經病變的基因療法方法和組合物。表達gla轉基因的raav載體引起法布里病患者的多個組織中功能性α-gal酶持續高水平暴露，與健康人的正常酶功能相當或更高，特別是在神經系統(例如pns)中。恢復的α-gal減少神經組織中，特別是在背根神經節中底物gb3和lysogb3的積累，并且改善神經異常，包括保留小神經纖維(例如有髓神經纖維)的密度。

2、在一些實施方案中，根據本公開用于治療和/或預防法布里病患者的周圍神經病變的raav載體具有廣泛組織向性并且利用遍在啟動子來驅動廣泛基因表達，從而引起持續高水平的蛋白質表達和蛋白質穩固暴露于多種組織和/或gb3或lysogb3水平降低。此外，本技術中使用的gla轉基因進行密碼子優化和/或表達α-gal的工程化變體，引起體內α-gal活性增加，和/或體內lysogb3或gb3水平降低。此外，驅動編碼具有增加的半衰期和改良的細胞攝取的α-gal蛋白的gla變體表達的本基因方法進一步增加關鍵靶組織(例如神經組織)中的α-gal暴露，從而允許更好的法布里病的治療結果，例如改良周圍神經病變的結果。

3、在本文所描述的一些實施方案中，可使用肝臟或神經系統特異性啟動子。

4、如下文更詳細描述，本文所描述的基于raav的基因療法方法引起法布里病小鼠模型中健康狀況的整體改良，如體重增加、腎功能改良和神經癥狀所證明，并且進一步預期在人類中也是如此。

5、具體來說，本發明的基因療法方法適合于減輕法布里病中的周圍神經病變。因此，在本發明的一個方面，提供了一種用于治療、減輕和/或預防經診斷患有法布里病的受試者的周圍神經病變的方法；所述方法包括向所述受試者施用包含重組腺相關病毒載體(raav)的組合物，所述重組腺相關病毒載體包含編碼α-gal酶或其變體的多核苷酸。周圍神經病變的癥狀可表現為神經病理性疼痛、熱感覺減退、聽力喪失、其它感覺缺陷和/或胃腸紊亂。

6、在一些實施方案中，提供了一種用于改善患有法布里病的受試者中的神經纖維周圍異常的方法；所述方法包括向所述受試者施用包含重組腺相關病毒載體(raav)的組合物，所述重組腺相關病毒載體包含編碼α-gal酶或其變體的多核苷酸。在一些實施方案中，保留小神經纖維，包括小的有髓和無髓神經纖維。在一些實施方案中，保留小的感覺神經的密度。

7、在一些實施方案中，如本文所述的表達gla轉基因的raav載體用于減少由α-半乳糖苷酶a缺乏病引起的周圍神經系統中神經酰胺三己糖苷(gb3)的積累，其包括向有需要的受試者施用。在一些實施方案中，減少背根神經節(drg)中gb3的積累。在其它實施方案中，減少drg中lamp1的表達。

8、在一些實施方案中，表達gla轉基因的raav載體具有廣泛組織向性，所述載體包含：(a)?5'末端反向重復序列(itr)；(b)遍在啟動子；(c)編碼α-gal酶或其變體的多核苷酸；(d)多腺苷酸；和(e)?3'?itr。

9、在一些實施方案中，可用于治療和/或預防法布里病患者的周圍神經病變的raav載體表現出廣泛組織向性并且包含：(a)?5'末端反向重復序列(itr)；(b)遍在啟動子；(c)編碼α-gal酶或其變體的多核苷酸；(d)土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件(wpre)；(e)多腺苷酸；和(f)?3'?itr。

10、在一些實施方案中，可用于治療和/或預防法布里病患者的周圍神經病變的raav載體包含：(a)?5'末端反向重復序列(itr)；(b)肝特異性啟動子；(c)編碼α-gal酶或其變體的多核苷酸；(d)多腺苷酸；和(e)?3'?itr。在其它實施方案中，raav載體還包含土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件(wpre)。肝特異性啟動子誘導肝臟中α-gal酶的表達，其可穿過血腦屏障(bbb)到神經系統，例如到pns。

11、在一些實施方案中，如本文所描述的raav載體用具有廣泛組織向性的aav衣殼包裝。

12、具有廣泛組織向性的各種aav衣殼可用于本文所述的raav載體中。舉例來說，在一些實施方案中，aav衣殼為選自aav1衣殼、aav2衣殼、aav3衣殼、aav4衣殼、aav5衣殼、aav6衣殼、aav7衣殼、aav8衣殼、aav9衣殼、aav11、12,13、aavhu.37、aavrh.8、aavrh.10,和aavrh.39、aav-dj或aav-dj/8的寬向性aav衣殼。

13、因此，在一些實施方案中，具有寬向性的aav衣殼包含aav1衣殼。在一些實施方案中，具有寬向性的aav衣殼包含aav2衣殼。在一些實施方案中，具有寬向性的aav衣殼包含aav3衣殼。在一些實施方案中，具有寬向性的aav衣殼包含aav4衣殼。在一些實施方案中，具有寬向性的aav衣殼包含aav5衣殼。在一些實施方案中，具有寬向性的aav衣殼包含aav6衣殼。在一些實施方案中，具有寬向性的aav衣殼包含aav7衣殼。在一些實施方案中，具有寬向性的aav衣殼包含aav8衣殼。在一些實施方案中，具有寬向性的aav衣殼包含aav9衣殼。

14、在一個實施方案中，aav衣殼包含aav9衣殼。aav9衣殼為天然存在的或修飾的。

15、在一些實施方案中，遍在啟動子選自雞β肌動蛋白(cba)啟動子、cag啟動子、ef-1α啟動子、pgk啟動子、ubc啟動子、lse?β-葡萄糖醛酸苷酶(gusb)啟動子或遍在染色質開放元件(ucoe)啟動子。在一些實施方案中，遍在啟動子包含cbh?(cmv增強子、雞β-肌動蛋白啟動子、雞-β肌動蛋白-mvm雜合內含子)。因此，在一些實施方案中，遍在啟動子為雞β肌動蛋白(cba)啟動子。在一些實施方案中，遍在啟動子為ef-1α啟動子。在一些實施方案中，ef-1α啟動子與來自雞β-肌動蛋白和兔β-球蛋白基因的嵌合內含子組合。在一些實施方案中，遍在啟動子為ubc啟動子。在一些實施方案中，遍在啟動子為lse?β-葡萄糖醛酸苷酶(gusb)啟動子。在一些實施方案中，遍在啟動子為遍在染色質開放元件(ucoe)啟動子。

16、在一些實施方案中，遍在啟動子包含巨細胞病毒(cmv)增強子、雞β肌動蛋白啟動子和兔β球蛋白內含子。

17、在一些實施方案中，遍在啟動子包含縮短的ef-1α啟動子和一種或多種內含子。

18、在一些實施方案中，一種或多種內含子來自雞β-肌動蛋白和/或兔β-球蛋白基因。

19、在一些實施方案中，具有廣泛組織向性的raav載體包含肝特異性啟動子。示例性肝特異性啟動子包括但不限于例如運甲狀腺素蛋白啟動子(ttr)；甲狀腺素結合球蛋白(tbg)啟動子；雜合肝特異性啟動子(hlp)和α-1-抗胰蛋白酶(aat)啟動子。

20、在一些實施方案中，wpre序列為任選的或修飾的。在一個實施方案中，wpre序列為wpre?mut6delatg。

21、可包括在本公開所涵蓋的基因療法載體中的示例性多腺苷酸序列包括人生長激素多腺苷酸(hghpa)、合成多腺苷酸(spa)、猿病毒40晚期多腺苷酸(sv?40pa)和牛生長激素(bgh)多腺苷酸。在一具體實施方案中，多腺苷酸為牛生長激素(bgh)多腺苷酸。

22、在一些實施方案中，表達α-gal酶的gla轉基因包含具有野生型序列(seq?id?no:1和5)的gla基因或具有本文所描述的修飾序列的gla基因。這類修飾gla序列包括例如密碼子優化的gla和/或gla的工程化變體。

23、在一些實施方案中，編碼α-gal酶的核苷酸序列進行密碼子優化。在一些實例中，編碼α-gal酶的核苷酸序列針對人類細胞進行密碼子優化。

24、在一些實施方案中，α-gal酶具有未修飾的序列。在其它實施方案中，α-gal酶具有修飾序列。

25、在一些實施方案中，編碼α-gal酶的核苷酸序列進行工程化。在一些實施方案中，編碼α-gal酶的核苷酸序列進行工程化并進行密碼子優化。在一些實施方案中，修飾序列相比于野生型α-gal酶(seq?id?no:?5)包含一個或多個氨基酸取代。在一些實施方案中，修飾的α-gal酶變體相比于野生型α-gal酶具有增加的穩定性(例如，血清穩定性)、細胞內活性(例如，溶酶體活性)和/或比催化活性。

26、作為非限制性實例，α-gal酶變體包含seq?id?no:?2的氨基酸序列。在一些實施方案中，α-gal酶變體包含seq?id?no:?3的氨基酸序列。在一些實施方案中，α-gal酶變體包含seq?id?no:?6的氨基酸序列。在一些實施方案中，α-gal酶變體包含seq?id?no:?7的氨基酸序列。

27、作為非限制性實例，gla轉基因包含選自seq?id?no:?8-10和12-13的核苷酸序列。在一些實施方案中，gla轉基因包含seq?id?no:?8的核苷酸序列。在一些實施方案中，gla轉基因包含seq?id?no:?9的核苷酸序列。在一些實施方案中，gla轉基因包含seq?id?no:?10的核苷酸序列。在一些實施方案中，gla轉基因包含seq?id?no:?12的核苷酸序列。在一些實施方案中，gla轉基因包含seq?id?no:?13的核苷酸序列。

28、作為非限制性實例，本發明的方法包括向有需要的受試者施用包裝在具有廣泛組織向性的raav9衣殼中的raav載體，所述載體包含：(a)?5'末端反向重復序列(itr)；(b)遍在啟動子，其包含巨細胞病毒(cmv)增強子、雞β肌動蛋白啟動子和兔β球蛋白內含子；(c)編碼α-gal酶或其變體的核苷酸序列；(d)多腺苷酸；和(e)?3'?itr。

29、在另一實例中，本發明的方法包括向表現出周圍神經病變的癥狀的法布里病患者施用包裝在具有廣泛組織向性的raav9衣殼中的raav載體，所述載體包含：(a)?5'末端反向重復序列(itr)；(b)遍在啟動子，其包含巨細胞病毒(cmv)增強子、雞β肌動蛋白啟動子和兔β球蛋白內含子；(c)編碼α-gal酶的核苷酸序列；(d)土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件(wpre)；(e)多腺苷酸；和(f)?3'?itr。

30、在一些實施方案中，raav載體通過靜脈內、皮下或經皮施用來施用。因此，在一些實施方案中，raav載體經靜脈內施用于有需要的受試者。在一些實施方案中，raav載體皮下施用于有需要的受試者。在一些實施方案中，raav載體經皮施用于有需要的受試者。

31、在一些實施方案中，經皮施用通過基因槍進行。

32、在一些實施方案中，本公開的raav載體以1.0×1010?vg/kg?(病毒基因組/公斤體重)至1.0×1014vg/kg范圍內的劑量施用。在一些實施方案中，本公開的raav載體以1.0×1010?vg/kg至5.0×1013vg/kg范圍內的劑量施用。在一些實施方案中，本公開的raav載體以1.0×1010?vg/kg至1.0×1013vg/kg范圍內的劑量施用。在一些實施方案中，本公開的raav載體以1.0×1010?vg/kg至5.0×1012vg/kg范圍內的劑量施用。在一些實施方案中，本公開的raav載體以1.0×1010?vg/kg至1.0×1012vg/kg范圍內的劑量施用。在一些實施方案中，本公開的raav載體以1.0×1010?vg/kg至5.0×1011vg/kg范圍內的劑量施用。在一些實施方案中，本公開的raav載體以1.0×1010?vg/kg至2.5×1011vg/kg范圍內的劑量施用。在一些實施方案中，本公開的raav載體以5.0×1010?vg/kg至1.0×1014vg/kg范圍內的劑量施用。在一些實施方案中，本公開的raav載體以5.0×1010?vg/kg至5.0×1013vg/kg范圍內的劑量施用。在一些實施方案中，本公開的raav載體以5.0×1010?vg/kg至1.0×1013vg/kg范圍內的劑量施用。在一些實施方案中，本公開的raav載體以5.0×1010?vg/kg至5.0×1012vg/kg范圍內的劑量施用。在一些實施方案中，本公開的raav載體以5.0×1010?vg/kg至1.0×1012vg/kg范圍內的劑量施用。在一些實施方案中，本公開的raav載體以5.0×1010?vg/kg至5.0×1011vg/kg范圍內的劑量施用。在一些實施方案中，本公開的raav載體以5.0×1010vg/kg至2.5×1011vg/kg范圍內的劑量施用。

33、在一些實施方案中，在施用raav載體之后，受試者在血清中具有可檢測的α-gal達至少5周、10周、18周、15周、26周、1年、5年、10年或20年。在一些實施方案中，在施用raav載體之后，受試者在血清中具有可檢測的α-gal達至少5周。在一些實施方案中，在施用raav載體之后，受試者在血清中具有可檢測的α-gal達至少10周。在一些實施方案中，在施用raav載體之后，受試者在血清中具有可檢測的α-gal達至少15周。在一些實施方案中，在施用raav載體之后，受試者在血清中具有可檢測的α-gal達至少26周。在一些實施方案中，在施用raav載體之后，受試者在血清中具有可檢測的α-gal達至少1年。在一些實施方案中，在施用raav載體之后，受試者在血清中具有可檢測的α-gal達至少5年。在一些實施方案中，在施用raav載體之后，受試者在血清中具有可檢測的α-gal達至少10年。在一些實施方案中，在施用raav載體之后，受試者在血清中具有可檢測的α-gal達至少15年。在一些實施方案中，在施用raav載體之后，受試者在血清中具有可檢測的α-gal達至少20年。在一些實施方案中，在施用raav載體之后，受試者在血清中具有可檢測的α-gal達受試者的一生。

34、在一些實施方案中，修飾的α-gal酶的表達提供比wt?α-gal的表達高3倍、10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、10,000倍、15,000倍、20,000倍、25,000倍、30,000倍的血清α-gal水平。在一些實施方案中，修飾的α-gal酶的表達提供比wt?α-gal的表達高3倍、10倍、30倍、100倍、1000倍、3000倍、10,000倍、15,000倍、20,000倍、30,000倍的細胞內酶水平。

35、在一些實施方案中，施用引起受試者的肝、腎、心臟、胃腸道、腦和/或周圍神經元中的一者或多者的α-gal酶暴露。因此，在一些實施方案中，施用引起肝中的α-gal酶暴露。在一些實施方案中，施用引起腎中的α-gal酶暴露。在一些實施方案中，施用引起心臟中的α-gal酶暴露。在一些實施方案中，施用引起胃腸道和與胃腸道相關的細胞中的α-gal酶暴露。在一些實施方案中，施用引起腦中的α-gal酶暴露。在一些實施方案中，施用引起周圍神經元中的α-gal酶暴露。

36、在另一方面，本發明提供了一種用于減輕或改善經診斷患有法布里病的受試者中的胃腸道癥狀的方法，所述方法包括向所述受試者施用包含重組腺相關病毒載體(raav)的組合物，所述重組腺相關病毒載體包含編碼α-gal酶或其變體的多核苷酸，其中所述經診斷患有法布里病的受試者具有或正顯現一種或多種胃腸道癥狀。胃腸道癥狀包括腸動力障礙、自主神經功能受損、血管病變和肌病。在一些實施方案中，治療逆轉胃腸道中的空泡形成。