本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖，具體地說，尤其涉及一種適用于水下環(huán)境中的動物病害防控方法。

背景技術(shù)：

1、水下環(huán)境中的細(xì)菌感染對人類和水生生物的健康構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)。在人類健康方面，處理長時間浸泡在水中的傷口細(xì)菌感染（如洗澡或游泳時）極為困難，因為持續(xù)的水接觸會沖刷掉常規(guī)治療方法，阻礙有效藥物的遞送。在水生生態(tài)系統(tǒng)中，同樣，細(xì)菌可以在海洋生物的開放性傷口上定殖，通常導(dǎo)致嚴(yán)重感染、愈合受阻，并在某些情況下引發(fā)大規(guī)模死亡。傳統(tǒng)上，抗生素一直是預(yù)防和治療疾病的主要手段。然而，抗生素在水下環(huán)境中的應(yīng)用面臨諸多限制。抗生素往往無法保持局部使用，導(dǎo)致環(huán)境污染并促進(jìn)抗生素耐藥性細(xì)菌株的出現(xiàn)。對于新興的抗菌納米材料而言，它們在水下治療中也缺乏特異性和靶向能力。這些問題進(jìn)一步加劇了藥物殘留對廣泛水域環(huán)境的影響。因此，開發(fā)一種能夠克服這些限制并實現(xiàn)水下靶向傷口治療的創(chuàng)新方法，依然是微生物學(xué)家和海洋生物技術(shù)學(xué)家面臨的難題。

2、基于反義寡核苷酸（aso）的基因沉默，作為一種有前景的替代方法，能夠針對性地調(diào)控細(xì)菌基因。然而，水下環(huán)境中的應(yīng)用仍然受到有效將核酸遞送至細(xì)菌細(xì)胞的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的遞送方法，如電穿孔和化學(xué)轉(zhuǎn)化，嚴(yán)格依賴于專業(yè)實驗室的操作，且它們在水中的效果有限，或需要復(fù)雜且不切實際的設(shè)備，從而限制了水下環(huán)境中局部細(xì)菌基因調(diào)控的潛力。盡管金納米粒子和硅納米粒子等納米顆粒在通過內(nèi)吞作用將各種載荷遞送到真核細(xì)胞中已證明有效，但將核酸遞送進(jìn)細(xì)菌的能力則受到細(xì)菌細(xì)胞壁的限制。此外，水生生態(tài)系統(tǒng)的動態(tài)特性進(jìn)一步增加了遞送難度。水流的存在、溫度變化和多樣的微生物群落都可能影響局部濃度，從而影響aso的效能，使得遞送成為一個重大難題。

3、因此，亟需創(chuàng)新遞送系統(tǒng)，以提高aso在細(xì)菌細(xì)胞中的攝取，同時維持其在水中的局部濃度。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種適用于水下環(huán)境中的動物病害防控方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

3、一種適用于水下環(huán)境中的動物病害防控方法，包括以下步驟：

4、（1）制備反義寡核苷酸/碳點復(fù)合物（aso/cds）；

5、（2）通過實驗驗證所述aso/cds能夠?qū)δ繕?biāo)菌的特定基因進(jìn)行沉默；

6、（3）制備水下粘性水凝膠；

7、（4）將被細(xì)菌感染水產(chǎn)動物的傷口用aso/cds處理，每次處理均在用無菌水清洗傷口后立即使用水下粘性水凝膠進(jìn)行封閉；直至治愈細(xì)菌感染。

8、進(jìn)一步的，所述步驟（1）包括：

9、①合成碳點：將檸檬酸和聚乙烯亞胺溶于超純水中并超聲處理；然后，將混合溶液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜水浴中，在200℃下反應(yīng)，反應(yīng)完成后冷卻至室溫，隨后用透析袋將黃色溶液在超純水中透析；最后，將濾液真空冷凍干燥，得到黃色碳點粉末以備用；

10、②cds負(fù)載aso：將cds與aso按照一定質(zhì)量比在超純水中孵育，獲得aso/cds復(fù)合物。

11、進(jìn)一步的，所述步驟（2）中：將aso/cds加入到細(xì)菌懸液中，將該混合物進(jìn)行孵育；孵育后，孵育后的細(xì)菌懸液接種在含有脫脂奶粉和nacl的lb瓊脂平板上，隨后再進(jìn)行孵育；通過觀察細(xì)菌菌落周圍的透明圈來評估aso/cds對細(xì)菌的特定基因的沉默效果。

12、進(jìn)一步的，所述步驟（3）中：將單寧酸、殼聚糖和九水合硝酸鋁溶解于水中攪拌均勻，隨后，在攪拌條件下加入丙烯酸和n,n'-亞甲基雙丙烯酰胺，攪拌均勻；最后緩慢滴加過硫酸銨溶液，并進(jìn)行超聲處理以去除氣泡；所得混合物倒入模具中并密封，在水浴條件下將溫度逐漸從60℃升至80℃，最終在80℃維持30?min后冷卻至室溫。

13、進(jìn)一步的，所述步驟（4）中，將被細(xì)菌感染水產(chǎn)動物的傷口每天用aso/cds，cds與aso的質(zhì)量比為20:1，連續(xù)7天、每隔12?h處理一次。

14、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

15、本發(fā)明整合了碳點（cds）介導(dǎo)的特定aso遞送與粘附性水凝膠的定位能力，解決了水中傷口護(hù)理中aso遞送至致病細(xì)菌的挑戰(zhàn)。本發(fā)明合成的直徑約3納米的cds具有優(yōu)異的膜穿透性，同時對細(xì)菌活性幾乎沒有影響，使其能夠?qū)so遞送到細(xì)菌細(xì)胞中，而無需額外的化學(xué)促進(jìn)劑或設(shè)備。aso/cds與水下粘附性水凝膠的結(jié)合使得aso/cds復(fù)合物能夠在感染部位實現(xiàn)局部的、持續(xù)的釋放，從而確保了治療作用的延續(xù)，并有效預(yù)防了水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的細(xì)菌感染疾病，例如多寶魚的爛鰭病。

技術(shù)特征：

1.一種適用于水下環(huán)境中的動物病害防控方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的動物病害防控方法，其特征在于，所述步驟（1）包括：

3.如權(quán)利要求1所述的動物病害防控方法，其特征在于，所述步驟（2）中：將aso/cds加入到細(xì)菌懸液中，將該混合物進(jìn)行孵育；孵育后，孵育后的細(xì)菌懸液接種在含有脫脂奶粉和nacl的lb瓊脂平板上，隨后再進(jìn)行孵育；通過觀察細(xì)菌菌落周圍的透明圈來評估aso/cds對細(xì)菌的特定基因的沉默效果。

4.如權(quán)利要求1所述的動物病害防控方法，其特征在于，所述步驟（3）中：將單寧酸、殼聚糖和九水合硝酸鋁溶解于水中攪拌均勻，隨后，在攪拌條件下加入丙烯酸和n,n'-亞甲基雙丙烯酰胺，攪拌均勻；最后緩慢滴加過硫酸銨溶液，并進(jìn)行超聲處理以去除氣泡；所得混合物倒入模具中并密封，在水浴條件下將溫度逐漸從60℃升至80℃，最終在80℃維持30min后冷卻至室溫。

5.如權(quán)利要求1所述的動物病害防控方法，其特征在于，所述步驟（4）中，將被細(xì)菌感染水產(chǎn)動物的傷口每天用aso/cds，cds與aso的質(zhì)量比為20:1，連續(xù)7天、每隔12?h處理一次。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種適用于水下環(huán)境中的動物病害防控方法，屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明整合了碳點（CDs）介導(dǎo)的特定ASO遞送與粘附性水凝膠的定位能力，解決了水中傷口護(hù)理中ASO遞送至致病細(xì)菌的挑戰(zhàn)。本發(fā)明合成的直徑約3納米的CDs具有優(yōu)異的膜穿透性，同時對細(xì)菌活性幾乎沒有影響，使其能夠?qū)SO遞送到細(xì)菌細(xì)胞中，而無需額外的化學(xué)促進(jìn)劑或設(shè)備。ASO/CDs與水下粘附性水凝膠的結(jié)合使得ASO/CDs復(fù)合物能夠在感染部位實現(xiàn)局部的、持續(xù)的釋放，從而確保了治療作用的延續(xù)，并有效預(yù)防了水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的細(xì)菌感染疾病，例如多寶魚的爛鰭病。

技術(shù)研發(fā)人員：王國慶,張青松
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國海洋大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/24