本發明屬于生物藥品制造領域，具體涉及一種含有牙髓干細胞的修復注射制劑及其制備方法。

背景技術：

1、干細胞存在于人體的不同部位，如造血、神經和間充質等組織中，表現出不同程度的組織重建能力。其中牙髓干細胞是來源于牙齒牙髓組織的多能干細胞，其來源豐富，獲取過程相對無痛且風險較小，具有自我復制的能力，可在體外培養中長時間保持增殖活性，具有較低的免疫原性，也能分泌生長因子，刺激血管的生成，從而促進組織修復與再生，還能釋放一系列抗炎因子，減輕炎癥反應。牙髓干細胞的基因穩定性較高，不易發生惡性轉化，使用過程中不涉及倫理問題，以上優勢使得牙髓干細胞在組織修復等多個方面具有較大的應用潛力。干細胞注射制劑是較為常見的制劑形式，具有操作簡單，用量易于控制等優勢，同時也對干細胞純度及活性的維持等提出了更高的要求。

技術實現思路

1、基于以上問題，本發明提供一種含有牙髓干細胞的修復注射制劑，包含微載體復合物及牙髓干細胞混合液，其中微載體復合物是由多個有效成分組合而成，如殼聚糖、紫草寧等，牙髓干細胞混合液是由傳代后的牙髓干細胞及活性保持試劑組合而成，活性保持試劑是采用綠色溶劑對金絲桃花進行提取，并結合高壓電場處理后，將所獲濾液與海藻糖混合而成。本發明所獲含有牙髓干細胞的修復注射制劑，實驗驗證對牙髓牙本質及軟骨都具有較好的修復效果，修復效果強于單一的牙髓干細胞制劑，具有較好的應用前景。

2、本發明提供一種含有牙髓干細胞的修復注射制劑，包含以下質量份數的原材料：5-8份微載體復合物、10-15份牙髓干細胞混合液。

3、所述微載體復合物的制備方法如下：

4、l1.按照質量體積比27.2mg：139.3mg：78.5mg：0.8ml稱量季戊四醇、當歸內酯、異檸檬酸內酯、異辛酸亞錫，將異辛酸亞錫加入到甲苯中，獲得溶液1，將溶液1加熱到80-90℃，然后將季戊四醇、當歸內酯及異檸檬酸內酯投入，氮氣氣氛下，以100-150rpm的轉速持續攪拌18-20h，結束后獲得溶液2；

5、l2.將步驟l1所獲溶液2自然冷卻至室溫，加入溶液2體積8-10倍的氯仿，攪拌至混合均勻后，獲得溶液3，加入溶液3體積3-5倍的無水乙醇，靜置2-3h，過濾獲取沉淀物，將沉淀物在60-70℃下真空干燥，即獲得物質1；

6、l3.按照質量比2-2.5：1稱量硝酸鈣四水合物與磷酸氫二銨，將硝酸鈣四水合物與磷酸氫二銨分別采用蒸餾水配置成溶液，獲得溶液4與溶液5，將溶液5滴入溶液4中，并輔以150-200rpm的轉速進行攪拌，持續40-50min后，獲得溶液6，將溶液6過濾，所獲沉淀物采用蒸餾水洗滌，烘干后即獲得物質2；

7、l4.將殼聚糖溶于乙酸溶液中，獲得濃度為3-5g/ml的溶液7，按照質量體積比3-5g：4-8g：15-20ml稱量步驟l2所獲物質1、步驟l3所獲物質2與溶液7，混合后在500-600w功率下超聲處理15-20min，結束后獲得溶液8，將溶液8真空冷凍干燥，獲得凍干粉末；

8、l5.按照質量比30-35：1稱量步驟l4所獲凍干粉末與紫草寧，將紫草寧采用無水乙醇溶解，然后將凍干粉末加入，攪拌至分散均勻后，置于通風環境下至無水乙醇完全揮發，即獲得微載體復合物。

9、較佳地，步驟l1中季戊四醇的cas號為115-77-5，異檸檬酸內酯的cas號為4702-32-3，當歸內酯的cas號為591-12-8，異辛酸亞錫的cas號為301-10-0，甲苯的用量為異辛酸亞錫體積的4-5倍。

10、較佳地，步驟l3中，溶液4的濃度為0.2-0.3g/ml，溶液5的濃度為0.1-0.2g/ml。

11、較佳地，步驟l4中，乙酸溶液的質量百分比濃度優選2%。

12、較佳地，步驟l5中紫草寧的cas號為54952-43-1。

13、所述牙髓干細胞混合液是由3代，或第4代，或第5代牙髓干細胞與活性保持試劑組合而成，其中活性保持試劑的制備方法如下：

14、s1.將金絲桃的花真空冷凍干燥，結束后研磨成粉，過2目篩后獲得金絲桃粉，按照質量體積比5-10g：1-2g：2-3g：60-80ml稱量金絲桃粉、脯氨酸、葡萄糖與水，混合均勻后加熱至40-50℃，以150-200rpm的轉速持續攪拌處理45-60min，結束后在3-5kv/cm的場強下處理5-10min，過濾，獲取濾液；

15、s2.按照質量體積比5-8mg：10-15ml稱量海藻糖與步驟s1所獲濾液，攪拌至分散均勻后，即獲得活性保持試劑。

16、較佳地，將原代牙髓干細胞依次進行傳代，即可獲取第3代，或第4代，或第5代牙髓干細胞，將第3代，或第4代，或第5代牙髓干細胞置于活性保持試劑中，使得傳代后的牙髓干細胞在活性保持試劑中的濃度為1×106-109個/ml，即獲得牙髓干細胞混合液。

17、本發明還提供一種含有牙髓干細胞的修復注射制劑的制備方法，具體步驟如下：

18、按照相應質量份數獲取微載體復合物與牙髓干細胞混合液，將微載體復合物與牙髓干細胞混合液混合后，在200-250w功率下超聲處理1-2min，結束后即獲得含有牙髓干細胞的修復注射制劑。

19、較佳地，上述含有牙髓干細胞的修復注射制劑需現配現用。

20、本發明的有益效果如下：

21、本發明含有牙髓干細胞的修復注射制劑，包含微載體復合物及牙髓干細胞混合液，其中微載體復合物是由多個有效成分組合而成。采用季戊四醇作引發劑，異辛酸亞錫存在下，檸檬酸內酯及當歸內酯開環并進一步連接，獲得如圖1所示的物質1，所獲物質1具有較好的生物降解效果及低毒性，優于常見的pgcl等復合物；將硝酸鈣四水合物與磷酸氫二銨反應，獲取具有一定力學支撐性的物質2，不僅能提供給后續牙髓干細胞立體的培養環境，同時支持后續殼聚糖等物質的附著；殼聚糖的存在提供粘附性，促進各材料混合均勻，并有助于后續牙髓干細胞保持生物活性；紫草寧作為最后的包覆物，能提升牙髓干細胞的誘導分化及修復潛力。此外，牙髓干細胞混合液是由傳代后的牙髓干細胞及活性保持試劑組合而成，活性保持試劑的存在能最大程度維持牙髓干細胞的體外活性，活性保持試劑是采用綠色溶劑對金絲桃花進行提取，并結合高壓電場處理后，將所獲濾液與海藻糖混合而成。

22、本發明所獲含有牙髓干細胞的修復注射制劑，實驗驗證對牙髓牙本質及軟骨都具有較好的修復效果，修復效果強于單一的牙髓干細胞制劑，其中微載體復合物能有效強化牙髓干細胞混合液的修復效果。

技術特征：

1.一種含有牙髓干細胞的修復注射制劑，其特征在于，包含以下質量份數的原材料：5-8份微載體復合物、10-15份牙髓干細胞混合液；

2.根據權利要求1所述含有牙髓干細胞的修復注射制劑，其特征在于，步驟l1中甲苯的用量為異辛酸亞錫體積的4-5倍。

3.根據權利要求2所述含有牙髓干細胞的修復注射制劑，其特征在于，步驟l3中溶液4的濃度為0.2-0.3g/ml，溶液5的濃度為0.1-0.2g/ml。

4.根據權利要求3所述含有牙髓干細胞的修復注射制劑，其特征在于，所述牙髓干細胞混合液是由第3代，或第4代，或第5代牙髓干細胞與活性保持試劑組合而成，第3代，或第4代，或第5代牙髓干細胞在活性保持試劑中的濃度為1×106-109個/ml。

5.根據權利要求4所述含有牙髓干細胞的修復注射制劑，其特征在于，所述活性保持試劑的制備方法如下：

6.一種根據權利要求1-5任一項所述含有牙髓干細胞的修復注射制劑的制備方法，其特征在于，按照相應質量份數獲取微載體復合物與牙髓干細胞混合液，將微載體復合物與牙髓干細胞混合液混合后，超聲處理，結束后即獲得含有牙髓干細胞的修復注射制劑。

技術總結
本發明屬于生物藥品制造領域，具體涉及一種含有牙髓干細胞的修復注射制劑及其制備方法。修復注射制劑包含微載體復合物及牙髓干細胞混合液，微載體復合物是由檸檬酸內酯、當歸內酯及季戊四醇合成的物質1，硝酸鈣四水合物與磷酸氫二銨反應獲得的物質2，殼聚糖及紫草寧組合而成，牙髓干細胞混合液是由傳代后的牙髓干細胞及活性保持試劑組合而成，活性保持試劑是采用綠色溶劑對金絲桃花進行提取，并結合高壓電場處理后，將所獲濾液與海藻糖混合而成，微載體復合物能有效強化牙髓干細胞混合液的修復效果。實驗驗證本發明所獲修復注射制劑，對牙髓牙本質及軟骨都具有較好的修復效果，具有較好的應用前景。

技術研發人員：王光斌,吳凡,楊前,鄭欣欣,張文凱,陳文慧
受保護的技術使用者：新北辰（湖北）生物科技集團有限公司
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24