專利名稱：短帚霉菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明特別涉及一株短帚霉菌及其在降解多環芳烴中的應用。
背景技術：
多環芳經(Polycyclicaromatic hydrocarbons, PAHs)是環境中普遍存在的一類有機污染物，由于其在環境中的半衰期較長和致癌、致畸、致突變的性質而受到人們的重視。美國環保局在20世紀80年代初把16種未帶分支的PAHs確定為環境中的優先污染物，我國也將其列入環境污染的黑名單中。微生物具有很強的分解代謝能力，微生物降解是環境中PAHs去除的最主要途徑。近年來，國內外報道了很多能降解PAHs的微生物，但是成功應用到土壤修復中的還很少，這主要與PAHs的性質、微生物的降解能力，及各種環境因素的影響有關。因此，篩選能夠同 時降解多組分PAHs的微生物，具有重要的現實意義。近年來，國內外對高分子量PAHs的微生物降解研究表明，能夠同時降解多種高分子量PAHs (如四環和五環)的微生物資源還很少。因此，篩選能夠同時降解多種PAHs的微生物具有重要的現實意義。

發明內容
鑒于現有技術中的不足，本發明的目的之一在于提供一株短帚霉菌，其能實現對多環芳烴，特別是高分子量PAHs的有效降解。本發明的短帚霉菌iScopulariopsis的編號為4Z,其已在國家知識產權局指定的保藏單位保藏，具體信息如下
保藏日期2012年11月22日；
保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
保藏地址北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所，郵編100101 ；
保藏編號為CGMCC No. 6870。本發明的另一目的在于提供前述短帚霉菌(Scopulariopsis brevicaulis) Al在降解有機芳香化合物中的應用。本發明的又一目的在于提供前述短帚霉菌iScopulariopsis brevicaulis) Al在制備有機芳香化合物的生物降解試劑中的應用。本發明的再一目的在于提供一種有機芳香化合物降解試劑，它包含前述短帚霉菌(Scopulari opsi s bre vi caul is、41。本發明還提供了前述短帚霉菌{Scopulariopsis brevicaulis) Al在修復有機芳香化合物污染土壤中的應用。本發明還提供了一種土壤修復試劑，包含前述短帚霉菌iScopulariopsisbrevicaul is、41。其中，前述有機芳香化合物包括多環芳烴。更具體的講，所述有機芳香化合物至少選自菲、芘、熒蒽和苯并[a]芘，但不限于此。本發明的短帚霉菌具有較廣的底物譜，對環境中的多環芳烴有很好的降解能力，適于制備環境修復制劑，特別是有機芳香化合物污染土壤試劑，藉以消除有機芳香化合物造成的環境污染。


圖1為實施例1中菌株4Z在固體培養基上的菌落形態；
圖2a_2d分別為實施例2中菌株4Z在含菲、芘、熒蒽和苯并[a]芘的培養液中的生長曲線；
圖3a_3d分別為實施例2中在菌株4Z培養液中菲、芘、熒蒽和苯并[a]芘濃度隨時間的變化曲線，CK為加入相同量滅活菌株的處理對照；
本發明短帚霉菌iScopulariopsis brevicaulis、Al的保藏日期為2012年11月22日，保藏單位名稱為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 6870。
具體實施例方式本發明采用富集培養方法從多環芳烴污染土壤中篩選分離得到一株能降解多環芳烴的真菌菌株。該菌株在平板上生長4天后呈白色凸起菌落，菌落直徑約為4 10 mm。形態特征觀察和18S rDNA序列分析結果表明，該菌株為短帚霉brevicaulis)，編號為4Z,研究發現,該菌株對PAHs具有很好的降解潛力。以下結合若干較佳實施例對本發明的技術方案作更為詳細的說明。實施例1 :多環芳烴降解真菌(亦即前述短帚霉{Scopulariopsisbrevicaulis) Al,以下亦可簡稱“菌株4Z”)的分離、純化、鑒定。1、培養基①馬丁氏培養基無機鹽培養基(MS):每升含K2HPO4 6. 0 g，KH2PO45.5 g,NH4NO3 2.0 g, Na2SO4 2.0 g，KCl 2.0 g，MgS04_7H20 0.2 g，微量金屬鹽溶液 1.0 mL，蒸餾水，pH 7. 0 ;③含PAHs的無機鹽培養基以DMF配制1000 mg/L的不同PAHs (菲，苯并[a]芘，芘，熒蒽)溶液，按適當的濃度加入滅菌的無機鹽培養基。2、PAHs降解菌的分離與純化
稱取10 g新鮮土壤，加入裝有IOOmL無機鹽液體培養基(芘濃度為100.0 mg /L)的三角瓶中，28°C下200 r /min振蕩培養I周。按10%接種量轉接到新鮮的芘無機鹽培養基中，繼續培養I周，反復5次。最后吸取0.1 mL培養液稀釋不同梯度涂布于馬丁氏培養基平板上，挑取單菌落，將平板劃線純化后的單菌落再接種到芘無機鹽液體培養基中，選取生長速度最快的菌株作為研究菌株。3、形態觀察及鑒定
將已充分活化的菌株接種到馬丁氏培養基中，28°C培養4天，革蘭氏染色后在光學顯微鏡下觀察細胞形態、菌體大小。將活化菌種在馬丁氏平皿上劃線接種，28°C培養箱中倒置培養4天，觀察菌落形態，并測量菌落大小，具體請參閱圖1。4、18S rDNA的PCR擴增、序列分析和系統發育樹的構建
真菌基因的DNA提取、PCR以及PCR產物的測序由上海生工生物技術有限公司完成。真菌菌18S rDNA序列通過Blast程序與GenBank中核酸數據進行比對分析。然后利用MEGA4. O軟件構建系統發育樹,采用Neighbor-Joining法進行系統發育分析。5、通過生物量變化看，菌株4Z在含有菲、芘、熒蒽和苯并芘的馬丁氏培養基上均能生長，尤其在含熒蒽和苯并芘的培養基上，生物量較大，說明菌株4Z對這兩種污染物有著良好的降解或耐受能力。實施例2 :多環芳烴降解真菌對多環芳烴的降解特性1、在無菌條件下將菌株4Z接種于含有100. mg/L多環芳烴的馬丁氏液體培養基中，28°C下200 r /min振蕩培養I周，離心收集菌體，并用磷酸鹽緩沖液反復洗滌3次，再用磷酸鹽緩沖液將菌懸液調至所需濃度備用。2、菌株4Z對多環芳烴的降解將10%的菌懸液加入50 mL液體培養基中，以加滅 活菌懸液的處理作為對照，加入多環芳烴母液，使菲、芘、熒蒽的最終濃度約為100 mg/L，苯并[a]花的最終濃度約為20 mg/Lo每個處理設3個重復。28°C下150 r /min避光振蕩培養6周，在不同時段取樣，4°C冷凍保存。測定溶液中PAHs的濃度和0D_的變化。3、溶液中多環芳烴的提取與分析
將三角瓶中的菌液全部倒入分液漏斗，加入50 mL乙酸乙酯提取三次，合并提取液后用無水Na2SO4去除水分。在水溫為36°C的旋轉蒸發器中旋轉濃縮至干。加2. 0 ml乙腈溶解，用高效液相色譜(HPLC)測定溶液中多環芳烴的濃度。4、降解結果通過降解試驗可以看出菌株4Z對多環芳烴有著良好的降解效果，在6周的時間里，菌株4Z對菲、芘、熒蒽、苯并芘的降解率分別為60. 0%、64. 3%、61. 9%和82. 1%。此外，本案發明人還以與前述實施例1-2相近的操作方法，利用菌株4Z對其它習見的PAHs，如前述的美國環保局指定的16種未帶分支的PAHs進行了降解實驗，結果顯示，該菌株4Z均表現出較高的降解能力。再及，本案發明人還以與前述實施例1-2相近的操作方法，利用菌株4Z對含菲、芘、熒蒽、苯并芘等污染物的土壤進行了修復處理，并對修復后土壤中多環芳烴污染物的含量進行了再次測定，其結果顯示，被污染土壤得以有效修復。需要指出的是，以上說明及優選實施例不可解釋為限定本發明的設計思想。在本發明的技術領域里持有相同知識者可以將本發明的技術性思想以多樣的形態改良變更，這樣的改良及變更應理解為屬于本發明的保護范圍內。
權利要求
1.短帚霉菌4Ζ，其保藏編號為CGMCC No. 6870。
2.權利要求1所述短帚霉菌在降解有機芳香化合物中的應用。
3.如權利要求2所述短帚霉菌在降解有機芳香化合物中的應用，其特征在于，所述有機芳香化合物包括多環芳烴。
4.如權利要求2或3所述短帚霉菌在降解有機芳香化合物中的應用，其特征在于，所述有機芳香化合物至少選自菲、芘、熒蒽和苯并[a]芘。
5.權利要求1所述短帚霉菌在制備有機芳香化合物的生物降解試劑中的應用，所述有機芳香化合物包括多環芳烴。
6.一種有機芳香化合物降解試劑，所述有機芳香化合物包括多環芳烴，其特征在于，所述降解試劑包含權利要求1所述的短帚霉菌。
7.權利要求1所述短帚霉菌在修復有機芳香化合物污染土壤中的應用，所述有機芳香化合物包括多環芳烴。
8.一種土壤修復試劑，其特征在于，包含權利要求1所述的短帚霉菌。
全文摘要
本發明公開了一株短帚霉菌及其應用，所述短帚霉菌(Scopulariopsisbrevicaulis)4Z的保藏編號為CGMCCNo.6870，其具有較廣的底物譜，對環境中的有機芳香化合物，特別是多環芳烴有很好的降解能力，可被應用環境污染的治理，例如可作為有機芳香化合物污染土壤的生物修復試劑廣泛應用。
文檔編號A62D101/20GK103013841SQ20121056317
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月24日 優先權日2012年12月24日
發明者毛健, 荊磊, 鄧宗武 申請人:中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所