一種深紅紫鏈霉菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種深紅紫鏈霉菌（Streptomycesviolaceorubidus）JG-1CGMCCNo.7921及其應用。通過從吉爾吉斯斯坦賈拉拉巴州Kyzyl-Suu(N41°18’25.12E72°57’46.15)野生核桃林中取樣，分離、篩選、生理生化鑒定，確定該菌種本發(fā)明提供的深紅紫鏈霉菌（Streptomycesviolaceorubidus）JG-1CGMCCNo.7921具有蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶陰性，α-淀粉酶、酯酶、脂肪酶陽性，可廣泛用于α-淀粉酶、酯酶、脂肪酶生產領域。
【專利說明】一種深紅紫鏈霉菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微生物菌種及其應用領域，具體的說，本發(fā)明涉及一種深紅紫鏈霉菌及其應用的【技術領域】。
【背景技術】
[0002]放線菌類群是十分重要的高G+C含量的革蘭陽性細菌，它們的培養(yǎng)形態(tài)與細菌有本質區(qū)別，大多數產生菌絲結構，包括培養(yǎng)基中的基質菌絲和培養(yǎng)基表面的氣生菌絲及孢子絲。迄今已發(fā)表145個屬，約2000個種，其中鏈霉菌屬中約500個種。放線菌與人類的生產和生活關系極為密切，目前廣泛應用的抗生素約70%是各種放線菌所產生。一些種類的放線菌還能產生蛋白酶、淀粉酶、和纖維素酶等各種酶制劑、維生素(B12)和有機酸等。此外，放線菌還可用于留體轉化、烴類發(fā)酵、石油脫蠟和污水處理等方面。少數放線菌也會對人類構成危害，引起人和動植物病害。因此，放線菌與人類關系密切，在醫(yī)藥工業(yè)上有重要意義。放線菌在自然界分布廣泛，主要以孢子或菌絲狀態(tài)存在于土壤、空氣和水中，尤其是含水量低、有機物豐富、呈中性或微堿性的土壤中數量最多。土壤特有的泥腥味，主要是放線菌的代謝產物所致。
[0003]放線菌與人類的生產和生活關系極為密切，目前廣泛應用的抗生素約70%是各種放線菌所產生。一些種類的放線菌還能產生蛋白酶、淀粉酶、和纖維素酶等各種酶制劑、維生素和有機酸等。此外，放線菌還可用于留體轉化、烴類發(fā)酵、石油脫蠟和污水處理等方面。少數放線菌也會對人類構成危害，引起人和動植物病害。因此，放線菌與人類關系密切，在醫(yī)藥工業(yè)上有重要意義。
[0004]而鏈霉菌分類屬于細菌界、厚壁菌門、放射細菌綱、放射細菌亞綱、放線菌目、鏈霉菌亞目、鏈霉菌科中惟一的一個特大屬，是放線菌的典型代表。鏈霉菌屬
是至今放線菌中種類最多，數量最大的一個屬，已知種達500多個，廣泛分布于自然界。廣泛分布于含水量較低、通氣良好、有機質豐富和微堿性的土壤中，在淡水、海水及其淤泥中也有分布。少數種類是人體和動植物的病原菌。有發(fā)育良好的分枝菌絲，菌絲無橫隔，分化為營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲、孢子絲。孢子絲再形成分生孢子。孢子絲和孢子的形態(tài)、顏色因種而異，是分種的主要識別性狀之一。已報道的有千余種，主要分布于土壤中。已知放線菌所產抗生素的90%由本屬產生。菌絲纖細、無隔、多核、分枝，革蘭氏陽性，菌絲體發(fā)達，分化成基內菌絲和氣生菌絲，后者成熟后發(fā)育成孢子絲，其形態(tài)多樣(直、波曲、螺旋、輪生)，可裂生大量分生孢子進行散播、繁殖。菌落小而致密、干而不透明，幼時表面光滑、邊緣整齊、顏色單調、不易挑起，繼而發(fā)展成絨毛狀、表面起粉、色澤豐富，正反面顏色往往不同。各個種都能利用葡萄糖。有較強的淀粉和蛋白質水解能力(尤其是角蛋白)。鏈霉菌是一類具有重要藥用價值的微生物，早期發(fā)現的抗生素絕大多數是由該屬的菌種產生，如抗細菌抗生素鏈霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素、新生霉素等，抗真菌抗生素灰黃霉素以及抗腫瘤抗生素柔紅霉素、絲裂霉素、平陽霉素等。70年代后，隨著疾病相關分子靶標的不斷揭示和篩選新模型的不斷建立，從鏈霉菌的代謝產物中又發(fā)現了大量傳統抗生素以外的藥理活性物質，如酶抑制劑，免疫調節(jié)劑、受體拮抗劑等。深紅紫鏈霉菌屬于放線菌綱放線菌目鏈霉菌科鏈霉菌屬，孢子球形、卵圓形。目前未見有關深紅紫鏈霉菌及其應用的詳細報道。

【發(fā)明內容】

[0005]針對目前國內外現有技術中，未見專門針對深紅紫鏈霉菌LSti^ptomycesviolaceorubidus^研究及應用趨向研究現狀,本發(fā)明旨在提供一種深紅紫鏈霉菌及其應用，所述的深紅紫鏈霉菌通過代謝表達，蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶陰性，α -淀粉酶、酯酶、脂肪酶陽性，深紅紫鏈霉菌廣泛用于α -淀粉酶、酯酶、脂肪酶生產領域，這些特性明顯區(qū)別于已公開報道的其他紫色鏈霉菌有效種，具有廣泛的應用價值。
[0006]本發(fā)明采用的主要技術方案:
本發(fā)明從吉爾吉斯斯坦共和國賈拉拉巴德州Kyzyl-Suu(N 41° 18’ 25.12 E72° 57’46.15)野生核桃林土樣中取樣，以不同的培養(yǎng)溫度、pH值、培養(yǎng)基為富集條件，篩選出一批生長良好的微生物菌株，從中優(yōu)選出一株編號為JG-1的菌株,參照《放線菌系統學-方法、原理與實踐》所用的方法進行鑒定，對JG-1菌株進行形態(tài)學，生理生化鑒定，命名為深紅紫鏈霉菌iStreptomyces vi olaceorubi dus )。該菌株于申請日前已保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編:100101，保藏日期是2013年07月15日，保藏號是CGMCC N0.7921 ;該菌革蘭氏陽性，菌落中等大小，呈灰黃色變淺黃色，扁平，在分離培養(yǎng)基淀粉瓊脂培養(yǎng)基上有氣生菌絲，顯微鏡下觀察基內菌絲有斷裂，無橫隔；該菌在蔗糖硝酸鹽瓊脂上氣生菌絲少，白色至灰色；基生菌絲無色；該菌在葡萄糖天冬素瓊脂上無氣生菌絲，基生菌絲灰色至淺微粉色；該菌在淀粉瓊脂上氣生菌絲為灰黃變淺黃，基生菌絲為淺橙色，在無機鹽淀粉瓊脂上氣生菌絲差；基生菌絲反面在灰黃色至黃褐色，無可溶色素，在燕麥粉瓊脂上氣生菌絲灰色，基生菌絲無色或灰黃色，該菌在牛奶內不生長，纖維素上不生長，不產生類黑色素、酪氨酸酶和H2S,利用葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-棉子糖以及乳糖、D-海藻糖、水楊苷；不利用D-果糖、蔗糖、L-鼠李糖。
[0007]本發(fā)明通過總DNA的提取、16S rRNA基因的PCR擴增和測序，根據測序結果，用Blast搜索軟件從GenBank、EMBL等數據庫中調出相似性較高的相關放線菌菌株的16SrRNA基因序列，用CLUSTAL X進行多序列比對，并采用Saitou和Nei的鄰接法Joining)用MEGA 5.0軟件進行系統進化樹的構建和同源性比較。經測定，深紅紫鏈霉菌(S trep tomyces vi olaceorubi dus ) JG-1 CGMCC N0.7921 的 16s rRNA 基因序列為 1436bp。
[0008]通過上述結果及16S rRNA同源分析、系統發(fā)育分析結果，將純化的菌株深紅紫鏈霉菌(trep tomyces vi olaceorubi dus )進行系統進化樹的構建及多樣性分析,菌種編號為JG-1與深紅紫鏈霉菌vi olaceorubi dus )同源性最高,將菌種編號為JG-1菌株鑒定為深紅紫鏈霉菌iStreptomyces vi olaceorubi dus ) ?
[0009]本發(fā)明進而提供深紅紫鏈霉菌violaceorubi dus ) JG-1 CGMCCN0.7921的分離和培養(yǎng)方法。
[0010]1.分離培養(yǎng)基采用:一是淀粉瓊脂培養(yǎng)基:可溶性淀粉20g，氯化納0.5g,硝酸鉀lg，磷酸氫二鉀0.5g，七水硫酸鎂0.5g，七水硫酸亞鐵0.01g,定容至1L，pH 7.0-7.2，121° C滅菌20分鐘；二是甘油天門冬素瓊脂:L-天門冬氨酸Ig，甘油IOg , K2HPO4 Ig，微量元素溶液Iml，瓊脂20.0g，定容至lL，pH 7.2，121° C滅菌20分鐘。微量元素溶液=FeSO4.7H20 0.lg, MnCl2.4H20 0.lg, ZnSO4.7H20 0.1g,定容至 1L。
[0011]2.分離和篩選條件:
(I)樣品采集:土壤樣品采自吉爾吉斯斯坦賈拉拉巴德州Kyzyl-Suu (N 41° 18’25.12E 72° 57’ 46.15)野生核桃林，于林地周邊隨機選取5處深度為3 cm-20cm的土壤樣品，混勻后裝入無菌容器內，車載冰箱運至實驗室，4° C保存?zhèn)溆谩?br> [0012](2)菌種篩選，純化及生理生化特性
依據梯度稀釋法，稱取IOg 土壤樣品于90mL無菌生理鹽水中，30° C活化30min后進行梯度稀釋，選取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—4稀釋液分別涂布于分離培養(yǎng)基淀粉瓊脂培養(yǎng)基和甘油天門冬素瓊脂培養(yǎng)基平板，每個處理3個重復，置30° C培養(yǎng)。待長出菌落后挑取形狀、大小、顏色等不同的菌落分別劃線接種于相應的平板，直至無雜菌落。
[0013]經培養(yǎng)篩選確定的深紅紫鏈霉菌violaceorubi dus ) JG-1 CGMCCN0.7921在葡萄糖天冬素瓊脂上無氣生菌絲，基生菌絲灰色至淺微粉色，在淀粉瓊脂上氣生菌絲為灰黃變淺黃，基生菌絲為淺橙色，在無機鹽淀粉瓊脂上氣生菌絲差；基生菌絲反面在灰黃色至黃褐色，無可溶色素，在燕麥粉瓊脂上氣生菌絲灰色系列；基生菌絲無色或灰黃色；該菌牛奶內不生長，纖維素上不生長，不產生類黑色素、酪氨酸酶和H2S,利用葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-棉子糖以及乳糖、D-海藻糖、水楊苷；不利用D-果糖、蔗糖、L-鼠李糖。具有α-淀粉酶、酯酶、脂肪酶活性。
[0014]同時，本發(fā)明提供的 深紅紫鏈霉菌violaceorubi dus ) JG-1 CGMCCN0.7921具有蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶陰性，α _淀粉酶、酯酶、脂肪酶陽性，可廣泛用于α-淀粉酶、酯酶、脂肪酶生產領域，該菌種生長迅速、發(fā)酵周期短的特點，在酶制劑產業(yè)方面具有廣泛的應用前景。
[0015]通過實施本發(fā)明具體的技術指標，實現本
【發(fā)明內容】
，可以達到以下有益效果:本發(fā)明提供的深紅紫鏈霉菌violaceorubidus^) JG-1 CGMCC N0.7921
具有蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶陰性，α-淀粉酶、酯酶、脂肪酶陽性，可廣泛用于α -淀粉酶、酯酶、脂肪酶工農業(yè)生產生產領域，可見，深紅紫鏈霉菌violaceorubidus) JG-1 CGMCC N0.7921在酶制劑產業(yè)方面具有廣泛的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1 所不為深紅紫鏈霉菌(Sirepio焊Ce1Svi olaceorubi dus ) JG-1 CGMCC N0.7921系統發(fā)育樹狀圖。
[0017]圖2 所不為深紅紫鏈霉菌(Sirepio焊Ce1Svi olaceorubi dus ) JG-1 CGMCC N0.7921菌種的菌體圖。
【具體實施方式】
[0018]下面結合具體實施例進一步闡明本發(fā)明，當然，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍。
[0019]本發(fā)明中涉及到的主要原輔材料、試劑和儀器設備:培養(yǎng)基選用:可溶性淀粉 20g，NaCl 0.5g, KNO3 Ig，K2HPO4.3H20 0.5g，MgSO4.7H200.5g，FeS04.7H20 0.01g，瓊脂 15_20g，水 1000ml，ρΗ7.0-7.2。
[0020]主要儀器與試劑:MSSPX-250型生化培養(yǎng)箱，MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋，Sff-CJ-1FB型單人雙面凈化工作臺，E360K離心機，恒溫搖床HWY-1OOt5PCR儀Eppendorf No:5345,電泳儀 Bio-Rad Mode 200/2.0，凝膠成像儀 United-Bio, GK-330C plus, PCR 預混液{TaKaRa
，其余試劑均為分析純。超聲波破碎儀為美國Sonics, VC 130。
[0021]本發(fā)明中選用的所有試劑和儀器都為本領域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實施，其他本領域熟知的一些試劑和設備都可適用于本發(fā)明以下實施方式的實施。
[0022]實施例一:深紅紫鏈霉菌(Sirepio焊Ce1Svi olaceorubi dus ) JG-1 CGMCC N0.7921的分離、篩選
1.分離
本發(fā)明所述的深紅紫鏈霉菌JG-1分離于吉爾吉斯斯坦賈拉拉巴德州Kyzyl-Suu(N41° 18’25.12E72。57’46.15)野生核桃林土壤樣品，于林地周邊隨機選取5處深度為3cm-20cm的土壤樣品，混勻后裝入無菌容器內，車載冰箱運至實驗室，采用平板稀釋涂布法，分離獲得一株鏈霉菌JG-1。
[0023]分離步驟:依據梯度稀釋法，稱取IOg 土壤樣品于90mL無菌生理鹽水中，30° C活化30min后進行梯度稀釋，選取10_2、10_3、10_4稀釋液分別涂布于淀粉瓊脂培養(yǎng)基和甘油天門冬素瓊脂培養(yǎng)基的平板，每個處理3個重復，置30° C培養(yǎng)。待長出菌落后挑取形狀、大小、顏色等不同的菌落分別劃線接種于新的分離培養(yǎng)基淀粉瓊脂培養(yǎng)基和甘油天門冬素瓊脂培養(yǎng)基，直至無雜菌落。將`純化后的菌株一部分采用凍干物安瓿管、甘油管和液氮等方式保藏，一部分保存于4° C直接用于后續(xù)研究。
[0024]2.培養(yǎng)條件
培養(yǎng)基:淀粉瓊脂培養(yǎng)基采用為，可溶性淀粉20g，氯化納0.5g，硝酸鉀lg，磷酸氫二鉀
0.5g，七水硫酸鎂0.5g，七水硫酸亞鐵0.01g，瓊脂20g，定容至lL，pH 7.0-7.2,121° C滅菌20分鐘。
[0025]NaCl生長耐受范圍:0.5-5%,最適生長NaCl 2-4% ；KC1生長耐受范圍:0.5-6%,最適生長KCl 2-4%; MgCl2生長耐受范圍:0.5-4%，最適生長MgCl2 1-2% ;最適生長pH:7.0 ；最適生長溫度:30°C。根據本發(fā)明提供的深紅紫鏈霉菌vi olaceorubi dus )CGMCC N0.7921特性確定其具體的生長因子，把菌株JG-1接種培養(yǎng)。結果見表1。
[0026]表1溫度、pH、鹽、抗生素對菌株JG-1生長的影響
溫度rc)41525303235生長情況-++++++++++++溫度rc)384550生長情況+++-pHI23456生長情況----+++pH78910生長情況++++--NaCl濃度0%1%2%3%4%5%生長情況+++++++++++++NaCl濃度6%7%8%9%10%生長情況
【權利要求】
1.一種深紅紫鏈霉菌violaceorubidus)JG-1，其特征在于，所述的深紅紫鏈霉菌印toJG-1 保藏編號為 CGMCC N0.7921。
2.如權利要求1所述的深紅紫鏈霉菌violaceorubidus)JG-1 CGMCCN0.7921在α-淀粉酶、酯酶、脂肪酶生產中應用。
【文檔編號】C12R1/465GK103555636SQ201310566781
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月14日 優(yōu)先權日:2013年11月14日
【發(fā)明者】包慧芳, 侯敏, 王寧, 古麗尼莎沙依木, 王煒 申請人:新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所