本發明涉及碳納米點的制備方法和作為熒光探針檢測三價鐵離子的應用，屬于納米-熒光傳感器領域。

背景技術：

近年來，碳納米點作為一種新型的熒光材料備受關注。它的表面除了含有豐富的羥基和羧基等水溶性官能團，還具有熒光強度高、光穩定性好、耐光漂白等優良的光學性能。因此具有低毒性和良好的水溶性的碳納米點有較好的生物相容性，在細胞標記、細胞成像等方面有著廣泛的應用前景。

重金屬對身體和人體健康有很大危害。鐵是其中的元素之一，并且廣泛應用于工業生產和日用產品，最終將被釋放到環境中。因此研究Fe³⁺與重要生物活性物質的相互作用，建立新的Fe³⁺檢測方法，對于生物、化學、環境及醫學等都有著特殊意義。

碳納米點的制備方法已經被廣泛研究。其中主要包括電化學制備法、強酸氧化法、激光輔助制備法、電弧放電法、高溫熱解法、水熱合成法、微波法、超聲法等。目前大多數方法都側重于水熱處理，雖然所用的原材料廉價易得，但是耗時較長。因此需要尋找一種以純天然綠色廉價的自然資源為碳源，且制備簡單、耗時較短的碳納米點的制備方法。

技術實現要素：

本發明是要解決現有的碳納米點的制備方法耗時較長的技術問題，而提供基于山竹的碳納米點的制備方法及其作為熒光探針檢測三價鐵離子的應用。該方法利用純天然綠色水果山竹來制備碳納米點，并建立一種新的熒光檢測Fe³⁺的方法，該碳納米點的制備操作簡單、原料綠色、廉價易得。

本發明的基于山竹的碳納米點的制備方法，按以下步驟進行：

(1)將山竹去殼后，取山竹果肉放入坩堝焙燒，去除水分，得到固體；

(2)再將坩堝放置在電熱爐上加熱，直至固體的顏色由白色變成黃棕色，冷卻，粉碎，得到黃棕色粉末；

(3)將黃棕色粉末用超純水溶解，磁力攪拌，超聲，離心提取上清液；

(4)將上清液用0.45μM的微孔濾膜過濾，再用透析袋透析，將得到的碳納米點溶液真空干燥、粉碎，即得到碳納米點粉末(MCDs)。

上述制備的碳納米點粉末可作為熒光探針檢測三價鐵離子，鐵離子為水溶液中的鐵離子或生命體中的鐵離子。

其中，定性檢測三價鐵離子的方法具體是：

(1)將碳納米點(MCDs)溶于超純水中，形成MCDs水溶液，測定溶液的熒光光譜；

(2)上述的MCDs水溶液與待測水溶液混合，并調節至pH值6.0～8.3之間，測定其熒光光譜，如果混合溶液的熒光強度顯著減弱，則可判定待測水溶液中含有三價鐵離子。

定量檢測水溶液中鐵離子的方法為標準曲線法，具體如下：

(1)配制不同濃度的含Fe³⁺的標準系列樣品，分別加入MCDs溶液，并調節至pH值6.0～8.3之間，并測試溶液的熒光光譜，讀出最大熒光發射峰的熒光強度值，以鐵離子的濃度為橫坐標、以最大熒光發射峰的熒光強度值為縱坐標作圖，繪出標準曲線；

(2)將MCDs水溶液與待測水溶液混合，再將pH值調節至與標準樣品相同，測定其熒光光譜，讀出最大熒光發射峰的熒光強度值，從標準曲線上讀出待測水溶液中Fe³⁺濃度。

生命體中的鐵離子的定性檢測方法，如下：

將待測的生命體放置到含有MCDs水溶液中培養1～6h，然后用熒光顯微鏡檢測生命體的活細胞，再把用MCDs培養后的生命體放入含有三價鐵離子的水溶液中培養1～6h后，用熒光顯微鏡檢測生命體的活細胞。

本發明我們利用綠色廉價的山竹制備了一種熒光碳納米點，并利用熒光光譜法研究了碳納米點(MCDs)與Fe³⁺的相互作用，使MCDs熒光猝滅并形成MCDs-Fe³⁺復合物，從而建立了一種基于山竹的碳納米點作為熒光探針熒光猝滅檢測Fe³⁺的方法，而且檢測不受其它常見金屬陽離子的明顯干擾。本發明的基于山竹的碳納米點的制備和作為熒光探針檢測三價鐵離子的方法。不僅可以用于檢測水溶液中的鐵離子，而且還可以通過細胞成像，檢測生命體中的鐵離子。

附圖說明

圖1為實施例1中MCDs、MCDs/Fe³⁺的透射電鏡(TEM)圖；

圖2為實施例1中MCDs的激發和發射光譜圖；

圖3為實施例1中的濃度對MCDs熒光發射光譜的影響；

圖4為實施例1的MCDs對常見金屬離子的熒光響應圖；

圖5為實施例1的其它常見金屬離子與Fe³⁺競爭時，MCDs的熒光變化圖；

圖6為實施例1中MCDs和不同濃度的Fe³⁺的混合溶液的熒光光譜圖；

圖7為實施例1中Fe³⁺濃度對MCDs的最大熒光發射峰強度的影響。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式的基于山竹的碳納米點的制備方法，按以下步驟進行：

(1)將山竹去殼后，取山竹果肉放入坩堝焙燒，去除水分，得到固體；

(2)再將坩堝放置在電熱爐上加熱，直至固體的顏色由白色變成黃棕色，冷卻，粉碎，得到黃棕色粉末；

(3)將黃棕色粉末用超純水溶解，磁力攪拌，超聲，離心提取上清液；

(4)將上清液用0.25～0.45μM的微孔濾膜過濾，再用透析袋透析，將得到的碳納米點溶液真空干燥、粉碎，即得到碳納米點粉末(MCDs)。

具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是步驟(1)中焙燒溫度為100～120℃，焙燒時間為10min～30min。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一或二不同的是步驟(2)中粉碎后的黃棕色粉末的粒徑為2～5nm。其它與具體實施方式一或二相同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一至三之一不同的是步驟(4)中透析袋的截留分子量(MWCO)為3000～4000道爾頓。其它與具體實施方式一至三之一相同。

具體實施方式五：具體實施方式一制備的碳納米點粉末可作為熒光探針檢測三價鐵離子，鐵離子為水溶液中的鐵離子或生命體中的鐵離子。

具體實施方式六：本實施方式的定性檢測三價鐵離子的方法具體是：

(1)將碳納米點(MCDs)溶于超純水中，形成MCDs水溶液，測定溶液的熒光光譜；

(2)上述的MCDs水溶液與待測水溶液混合，并調節至pH值6.0～8.3之間，測定混合液的熒光光譜，如果混合溶液的熒光強度顯著減弱，則可判定待測水溶液中含有三價鐵離子。

具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式六不同的是步驟(2)中所述的熒光強度顯著減弱是指熒光強度降至原來的50％以下。其它與具體實施方式六相同。

具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式六或七不同的是步驟(2)中所述的熒光強度顯著減弱是指熒光強度降至原來的40％以下。其它與具體實施方式六或七相同。

具體實施方式九：本實施方式的定量檢測水溶液中鐵離子的方法為標準曲線法，具體如下：

(1)配制不同濃度的含Fe³⁺的標準系列樣品，分別加入MCDs溶液，并調節至pH值6.0～8.3之間，并測試溶液的熒光光譜，讀出最大熒光發射峰的熒光強度值，以鐵離子的濃度為橫坐標、以最大熒光發射峰的熒光強度值為縱坐標作圖，繪出標準曲線；

(2)將MCDs水溶液與待測水溶液混合，再將pH值調節至與標準樣品相同，測定其熒光光譜，讀出最大熒光發射峰的熒光強度值，從標準曲線上讀出待測水溶液中Fe³⁺濃度。

具體實施方式十：本實施方式的生命體中的鐵離子的定性檢測方法，如下：

將待測的生命體放置到含有MCDs水溶液中培養1～6h，然后用熒光顯微鏡檢測生命體的活細胞，再把用MCDs培養后的生命體放入待測水溶液中培養1～6h后，用熒光顯微鏡檢測生命體的活細胞，如果出現熒光顯著減弱，則可判定待測生命體中含有三價鐵離子。

為使本領域技術人員進一步理解本發明，下面結合實施例和附圖進一步說明本發明。

實施例1：本實施例的基于山竹的碳納米點的制備方法，按以下步驟進行：

(1)將新鮮的山竹去殼后，取三瓣山竹果肉放入坩堝焙燒干燥10min；

(2)將坩堝放置在電熱爐上加熱，直至固體的顏色由白色變成黃棕色，自然冷卻；

(3)將黃棕色粉末用100mL超純水溶解，磁力攪拌，超聲，離心提取上清液；

(4)將上清液用0.45μM的微孔濾膜過濾，再用MWCO＝3500的透析袋透析，將得到的碳納米點溶液真空干燥，即得到碳納米點粉末(MCDs)。

將本實施例的碳納米點粉末(MCDs)加入到Fe³⁺溶液中，得到絡合物MCDs/Fe³⁺，測試MCDs、MCDs/Fe³⁺的透射電鏡(TEM)圖如圖1所示，其中圖1A)為MCDs的TEM圖，從圖1A)可以看出MCDs的粒徑大約為2-5nm左右，當TCDs溶液與Fe³⁺混合之后，形成的絡合物MCDs/Fe³⁺的粒徑變大，大約為25nm(如圖1B所示)。

圖2為本實施例1中的MCDs的激發和發射光譜圖；其中曲線A為MCDs的激發光譜圖，在260nm和365nm處有兩個峰。其中曲線B為MCDs的發射光譜圖，其最大熒光發射峰在440nm。

測試不同濃度的碳納米點(MCDs)的熒光光譜變化，具體步驟如下：

稱取300mg本實施例制備的MCDs于100mL容量瓶中，用超純水溶解，振蕩超聲，定容至刻度，靜置，其濃度為3mg/mL。移取不同體積的上述溶液于不同的5mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，激發波長為330nm，室溫條件下，利用熒光光譜儀，測定了不同濃度的MCDs水溶液的最大熒光發射峰強度；濃度對MCDs熒光發射光譜的影響圖如圖3所示，圖中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分別代表MCDs的濃度為0.001mg/mL、0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.04mg/mL、0.07mg/mL、0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.7mg/mL、1mg/mL、3mg/mL。從圖中可以看出，隨著濃度的增加，MCDs的最大發射峰發生紅移。最大發射峰熒光強度分別為21.10、22.74、27.04、70.15、100.6、135.7、213.6、168.8、114.6、18.66.可以看出，當MCDs的濃度為0.3mg/mL時，其熒光強度最大。

再測試本實施例制備的MCDs對不同金屬離子的熒光響應情況，具體步驟如下：

MCDs濃度為0.3mg/mL時，向MCDs的Tirs緩沖水溶液(pH＝7.3)中分別加入400μmoL/L Fe³⁺和其它常見的金屬離子(Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Al³⁺)，激發波長為330nm，測定了MCDs對不同金屬離子的熒光響應；得到的不同金屬離子的熒光響應圖如圖4所示，從圖4可以看出，當pH＝7.3時，MCDs對不同金屬離子的熒光響應不同，發現MCDs可以高選擇性識別Fe³⁺，且大多數金屬離子(Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Al³⁺)均不猝滅MCDs溶液的熒光光譜，僅有Fe³⁺顯著猝滅MCDs的熒光強度，Cu²⁺稍微猝滅了MCDs的熒光。其中：縱坐標表示最大熒光發射峰的熒光強度值，橫坐標表示金屬離子種類。

測試其它金屬離子對MCDs-Fe³⁺熒光光譜的影響，其具體步驟如下：

MCDs濃度為0.3mg/mL時，向MCDs的Tirs緩沖水溶液(pH＝7.3)中再加入400μmoL/L Fe³⁺和400μmoL/L的其它常見的金屬離子(Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Al³⁺)，Fe³⁺與其它金屬離子共存、其它金屬離子濃度與Fe³⁺濃度相同的條件下，在激發波長330nm下，測定了其它金屬離子對MCDs-Fe³⁺熒光光譜的影響。得到的其它常見金屬離子與Fe³⁺競爭時MCDs的熒光變化圖如圖5所示，從圖5可以看出其它常見的金屬離子(Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Al³⁺)對MCDs/Fe³⁺的熒光光譜均無明顯干擾，僅Cu²⁺輕微的猝滅了MCDs/Fe³⁺的熒光強度，使MCDs/Fe³⁺在440nm處的熒光強度從61減弱到53。

將3mg本實施例制備的MCDs溶解于10mL中性純水中，并加入1mL，濃度為0.1mol/L的Tris緩沖溶液，用NaOH調節溶液的pH＝7.3，此時MCDs的濃度為0.3mg/mL，Tris濃度為0.01mol/L。之后再向該溶液中加入不同體積的0.05mol/L的Fe³⁺，在激發波長330nm下，測定Fe³⁺濃度在0-1635μmol/L范圍內MCDs熒光光譜，得到的MCDs和不同濃度的Fe³⁺的混合溶液的熒光光譜圖如圖6所示，從圖6可以看出，隨著混合溶液中Fe³⁺濃度的增加，MCDs在440nm處的熒光峰強度逐漸減弱，從而可以實現MCDs對Fe³⁺的熒光檢測。以Fe³⁺濃度為橫作標、以最大熒光發射峰強度為縱作標作圖，得到的Fe³⁺濃度對MCDs的最大熒光發射峰強度的影響曲線圖如圖7所示，從圖7的插圖可知，Fe³⁺濃度在15-175μmol/L范圍時，MCDs在440nm處的熒光強度與Fe³⁺濃度呈現出良好的線性關系(線性相關系數R²＝0.9803)，對空白樣進行20次平行測定，按3σ/K(σ為空白樣的標準偏差，K為線性方程的斜率)并計算出檢出限為5.25×10^-8mol/L，說明本實施例制備的MCDs可以高靈敏的檢測Fe³⁺。

將酵母細胞在本實施例制備的MCDs溶液(0.3mg/mL)中37℃下培養2h，然后用400μM Fe³⁺溶液在37℃下處理上述酵母細胞，并且卵化2h，分別用熒光顯微鏡進行觀察，發現MCDs在酵母細胞中的熒光成像，呈現明亮的藍色熒光；而用400μM Fe³⁺溶液卵化的酵母細胞，其熒光顯著猝滅。說明本實施例制備的基于山竹的碳納米點可以在細胞生命體內檢測Fe³⁺。

實施例2：本實施例的基于山竹的碳納米點的制備方法，按以下步驟進行：

(1)將新鮮的山竹去殼后，取三瓣山竹果肉放入坩堝焙燒干燥20min；

(2)將坩堝放置在電熱爐上加熱，直至固體的顏色由白色變成黃棕色，自然冷卻；

(3)將黃棕色粉末用150mL超純水溶解，磁力攪拌，超聲，離心提取上清液；

(4)將上清液用0.45μM的微孔濾膜過濾，再用透析袋(MWCO＝3500)透析，將得到的碳納米點溶液真空干燥，即得到碳納米點粉末(MCDs)。

本實施例制備的MCDs濃度為0.3mg/mL時，向MCDs的HEPES緩沖水溶液(pH＝7.3)中分別加入400μmoL/L Fe³⁺和其它常見的金屬離子(Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Al³⁺)，激發波長為330nm，測定了MCDs對不同金屬離子的熒光響應；發現MCDs高選擇性識別Fe³⁺，且大多數金屬離子(Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Al³⁺)均不猝滅MCDs溶液的熒光光譜，僅有Fe³⁺顯著猝滅MCDs的熒光強度。

將3mg本實施例制備的MCDs溶解于10mL中性純水中，并加入1mL，濃度為0.1mol/L的HEPES緩沖溶液，用NaOH調節溶液的pH＝7.3，此時MCDs的濃度為0.3mg/mL，HEPES濃度為0.01mol/L。之后再向該溶液中加入不同體積的0.05mol/L的Fe³⁺，在激發波長330nm下，測定Fe³⁺濃度在0-1000μmol/L范圍內MCDs熒光光譜，發現隨著混合溶液中Fe³⁺濃度的增加，MCDs在440nm處的熒光峰強度逐漸減弱，從而可以實現MCDs對Fe³⁺的熒光檢測。而且Fe³⁺濃度在0-150μmol/L范圍時，MCDs在440nm處的熒光強度與Fe³⁺濃度呈現出良好的線性關系(線性相關系數R²＝0.9902)，對空白樣進行20次平行測定，按3σ/K(σ為空白樣的標準偏差，K為線性方程的斜率)并計算出檢出限為5.22×10^-8mol/L，說明本實施例制備的MCDs可以高靈敏的檢測Fe³⁺。

實施例3：本實施例的基于山竹的碳納米點的制備方法，按以下步驟進行：

(1)將新鮮的山竹去殼后，取三瓣山竹果肉放入坩堝焙燒干燥30min；

(2)將坩堝放置在電熱爐上加熱，直至固體的顏色由白色變成黃棕色，自然冷卻；

(3)將黃棕色粉末用150mL超純水溶解，磁力攪拌，超聲，離心提取上清液；

(4)將上清液用0.45μM的微孔濾膜過濾，再用MWCO＝3500的透析袋透析，將得到的碳納米點溶液真空干燥，即得到碳納米點粉末(MCDs)。

本實施例制備的MCDs濃度為0.3mg/mL時，向MCDs的HEPES緩沖水溶液(pH＝7.3)中分別加入400μmoL/L Fe³⁺和其它常見的金屬離子(Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Al³⁺)，激發波長為330nm，測定了MCDs對不同金屬離子的熒光響應；發現MCDs高選擇性識別Fe³⁺，且大多數金屬離子(Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Al³⁺)均不猝滅MCDs溶液的熒光光譜，僅有Fe³⁺顯著猝滅MCDs的熒光強度。

將3mg本實施例制備的MCDs溶解于10mL中性純水中，并加入1mL，濃度為0.1mol/L的HEPES緩沖溶液，用NaOH調節溶液的pH＝8.0，此時MCDs的濃度為0.3mg/mL，HEPES濃度為0.01mol/L。之后再向該溶液中加入不同體積的0.05mol/L的Fe³⁺，在激發波長330nm下，測定Fe³⁺濃度在0-1250μmol/L范圍內MCDs熒光光譜，發現隨著混合溶液中Fe³⁺濃度的增加，MCDs在440nm處的熒光峰強度逐漸減弱，從而可以實現MCDs對Fe³⁺的熒光檢測。而且Fe³⁺濃度在0-125μmol/L范圍時，MCDs在440nm處的熒光強度與Fe³⁺濃度呈現出良好的線性關系(線性相關系數R²＝0.9943)，對空白樣進行20次平行測定，按3σ/K(σ為空白樣的標準偏差，K為線性方程的斜率)并計算出檢出限為5.20×10^-8mol/L，說明本實施例制備的MCDs可以高靈敏的檢測Fe³⁺。

將酵母細胞在本實施例制備的MCDs溶液(0.3mg/mL)中37℃下培養2h，然后用400μM Fe³⁺溶液在37℃下處理上述酵母細胞，分別用熒光顯微鏡進行觀察，發現MCDs在酵母細胞中的呈明亮的藍色熒光；而用Fe³⁺溶液處理的上述酵母細胞的藍色熒光顯著減弱。說明本實施例制備的基于山竹的碳納米點可以在細胞生命體內檢測Fe³⁺。