專利名稱：單唾液酸四己糖神經節苷脂的高純度制備工藝的制作方法
神經節苷脂是一族異構的含唾液酸殘基的結構復雜的膜糖脂，其分子皆由一個疏水的神經酰胺部分和一個親水的唾液酸寡糖基團組成。神經酰胺由鞘氨醇的氨基與脂肪酸酸化而成。神經節苷脂分子既有水溶性，又有脂溶性。Sevennerholm按唾液酸殘基的位置和寡糖核心區的長度，將神經節苷脂分為不同的種類，其中GM1為單唾液酸四已糖神經節苷脂。
哺乳動物中樞神經系統中神經節苷脂含量豐富，其中以神經系統灰質含量最高。據估計，以水解后的唾液酸計算大腦中每克新鮮灰質和白質含量分別為3000-3500nM和1000-1250nM，明顯高于其他組織。中樞神經系統的神經節苷脂主要為神經節系列，大腦灰質多為GM1，GD1a，GD1b，(GD為二唾液酸神經節苷脂)GT1b(GT為三唾液酸神經節苷脂)，GQ1b(GQ為四唾液酸神經節苷脂)，其次是GM2和GD3；白質以GM1和GM4為主。神經節苷脂在神經元胞體中含量略低于平均水平，而在突觸小體中含量高于平均水平。對于單個神經節苷脂而言，GT1，GD1b及GM1集中于突觸前后膜。神經節苷脂位于神經元細胞膜雙層結構外層，神經酰胺一端嵌入細胞膜內，而寡糖鏈一端伸出細胞膜外突入外環境。神經節苷脂的這種非對稱性分布以及它們的化學性質差異使其特別易與各種細胞外信息發生相互反應，從而在細胞膜活動上充當重要角色。實驗證明外源性神經節苷脂尤其是GM1能嵌入神經細胞膜，模仿內源性神經節苷脂的某些功能，調節膜介導的細胞功能，并能刺激中樞神經系統損傷后潛在的代替機制阻止損害的發展，保護未受損的神經組織，同時還能影響體外培養的神經元的生長及其活性，促進其存活及生長。神經節苷脂GM1在神經系統中的主要生理作用為1，促進神經細胞的生長，分化發育和神經再生2，參與突觸傳遞，維持腦的正常機能，參與各種學習記憶活動3，在細胞與細胞，細胞與微生物以及細胞與基質間的相互作用過程中起介導作用4，調節細胞膜中各種蛋白質功能，如離子通道，表皮生長因子受體等。由意大利Fidia公司從牛腦組織中提取的GM1注射液(商品名Sygen)已于90年代正式在我國銷售。由于GM1能通過血腦屏障，注射后快速在大腦和脊髓組織中分散，因此臨床上GM1的治療效果十分顯著。主要用于治療人血管性或創傷性中樞神經系統損傷。如腦卒中、急性脊髓損傷和腦外傷。
CM1的研究已有數十年，目前已證明其結構組成和理化性質，主要歸結為1.GM1分子由一個唾液酸，一個葡萄糖，二個半乳糖，一個氨基半乳糖及一個神經酰胺殘基組成。分子式為 2，分子量1551，鈉鹽為15743，性狀為乳白色粉末，無味，有吸濕性，溶于水，甲醇-水及甲醇-氯仿溶液。不溶于甲醇，丙酮，氯仿，乙醚。熔點207-230攝氏度。
4，紫外吸收最大波長位于205nm有特殊的紅外吸收光譜，可通過氨基正相柱高效液相色和薄層色譜(TLC)進行純度鑒定。氣相色譜可鑒定GM1分子中糖基和神經酰胺殘基。
神經節苷脂及GM1提取和分離純化已有文獻和專利報道。其主要提取方法是豬腦或牛腦經絞粹，用丙酮脫水制成丙酮粉。再用氯仿、甲醇、水混合有機溶劑提取[Svennerholm.et al Biochemical et Biophsica Acta，617-109(1980)]。提取物神經節苷脂轉入水相[J.Folch，The Journal of Biological Chemistry，226，497-509(1957)].用DEAE-Sephadex-A25純化[R.w.Ledeen，et al.Journal ofNeurochemistry，21，829(1973)].硅膠層析，GM1得率達到14％。神經節苷脂的分離有用a環糊精技術(EP00469352A1)，也用大孔徑樹脂吸附技術(CN85102590)。神經節苷脂脫唾液酸方法有用唾液酸酶處理法(Richard Kuhn，etal.，ChemischeBerichte，1963.96.866).有用加熱處理法(US4868292)以及微生物處理方法(FukanoY，et al.，Appl Environ Microbiol，1997.63.1861)。GM1純化方法Momoi TaKashi建立了陰離子交換層析技術(Biochim Biophys Acta，1976，411，488)。親和層析技術(Krishna Kant，et al J.Chromato，1989.494289)等。
總神經節苷脂的提取主要依據其本身的兩個性質脂溶性和水溶性。根據其脂溶性，可用傳統的提取脂肪的方法把神經節苷脂與其它脂類一起從腦組織中提取出來，比如用20倍體積的氯仿-甲醇(2∶1)提取，幾乎所有脂類都釋放到溶液中，但神經節苷脂僅70％左右釋放。這主要是大多脂類都是非極性，而神經節苷脂具有一定極性。本發明改變了提取有機溶劑的極性，用氯仿-甲醇-水(1∶2∶0.75)這一個體系來提取神經節苷脂，結果神經節苷脂幾乎全部釋放到溶液中，而其他脂類釋放不徹底。
用本發明改良的氯仿-甲醇-水(1∶2∶0.75)這一個體系來提取神經節苷脂，除了神經節苷脂釋放徹底之外，其他的極性脂類如磷脂，硫脂等也大量釋放。為了減少它們的污染，根據其極性差異，調節氯仿-甲醇-水比例為1∶2∶1.4，此時有機溶劑開始分層，經測定神經節苷脂全部進入上層水相，而色素及大部分磷脂、硫脂分配到下層有機相。經過兩步提取分層操作，神經節苷脂含量從腦組織中的15％左右提高到上層水相的70％左右。腦組織中神經節苷脂主要以GM1，GD1a，GD1b(二唾液酸神經節苷脂)，GT1b(三唾液酸神經節苷脂b)，GQ1b(四唾液酸神經節苷脂b)。其中GD1和GT1b在結構上與GM1僅僅是多一個和兩個唾液酸殘基，如能將其多余的唾液酸殘基去除轉變成CM1，就能提高整個CM1制備工藝中的產率。本發明使用弱酸條件下(PH3.0-5.0)加熱到80℃以上的處理方法，GD1a，GD1b和GT1b的末端唾液酸鏈會逐一水解掉剩下最后一個唾液酸殘基。本發明對牛腦組織中的總神經節苷脂在不同酸溶液中加熱水解后的結果表明，其中GM1含量倍增2-3倍。
總神經節苷脂酸水解產物中主要為GM1和其它神經節苷脂、磷脂、硫脂、其中GM1和其它神經節苷脂占80％以上。根據神經節苷脂在唾液酸和酰氨基團數目的差異，本發明選用陰離子交換層析將其分離。采用Q-Sepharose強陰離子介質和DEAE型弱陰離子介質的結果表明，總神經節苷脂在介質轉為乙酸型后，在低電導條件下能吸附在介質上。然后用較低的鹽濃度有效地將GM1洗脫下來，同時除去部分磷脂和硫脂。經過此步分離純化的GM1經薄層色譜分析其純度在90％左右。
對于殘留的少量其他脂類物質，本發明根據其與GM1疏水性差異，用Sourse RPC 30反相介質進行分離純化的結果表明，此步所得GM1純度大于98％。由于GM1不溶于丙酮，分離純化所得高純度GM1溶液中加入10倍或更多的冷丙酮，沉淀結晶的GM1經離心、真空干燥后得白色干粉。實例1總神經節苷脂的提取20千克洗干凈的新鮮牛腦組織，用組織勻漿機勻漿，加入50升冷丙酮(-10℃)攪拌，-10℃放置過夜，離心取沉淀，上清減壓蒸發回收。沉淀置80℃烘烤過夜，得丙酮粉，約1千克。
1千克丙酮粉加入3升甲醇，1.5升氯仿，1.125升水。具體加入方法是先加入甲醇，攪拌2小時，再加入丙酮和水，室溫攪拌過夜。然后離心收集上清，所得上清應是清澈的有機溶劑混合液，加入0.975升水，溶液變為乳狀液，小心倒置兩次后靜止分層，取上清。此上清即為總神經節苷脂粗提液。此粗提液加入1/10體積正辛醇減壓濃縮至干，加入500毫升水即溶解，可得總神經節苷脂約25克，其中38％神經節苷脂GD1a，20％神經節苷脂GM1，21％神經節苷脂GT1b，18％神經節苷脂GD1b。實例2總神經節苷脂的水解及脫鹽約含5克粗神經節苷脂的水溶液100毫升，加入0.1N乙酸20毫升，溶液最終pH為4.0。該溶液放置于100℃水浴2小時，其pH變為4.56，經TLC分析神經節苷脂GD1a和GT1b部分水解為GM1，GM1含量增高2.6倍。
酸水解后含GM1水溶液用Sephadex G-25柱脫鹽，檢測波長為214nm，收集洗脫峰，所得收集峰溶液約500毫升，電導約2000us.cm-1，得率約85％。實例3Q-Sepharose F.F.柱層析分離GM1脫鹽溶液500毫升含GM1約3.5克，減壓濃縮至1/20體積后，加入氯仿和甲醇。稀釋調節氯仿∶甲醇∶水比例為30∶60∶8，佳電導小于100單位，用NaOH調節pH為8.0。
Q Sepharose F.F乙酸化處理5倍體積氯仿-甲醇-1M乙酸鈉(30∶60∶8)懸浮填料，靜止后去上清，如此操作3次，然后用此溶液浸泡填料過夜。又用5倍體積氯仿-甲醇-水(30∶60∶8)懸浮填料，靜止后去上清，如此操作3次后裝柱，柱規格為20cm×50mm，填料柱體積300ml，裝柱后再用氯仿-甲醇-水(30∶60∶8)洗脫5倍柱體積，檢測波長為214mn。
上樣溶液體積有約1.5升，以8毫升/分鐘速度上樣，上樣結束后用5倍柱體積氯仿-甲醇-水(30∶60∶8)平衡柱子，流速為20毫升/分鐘。再用氯仿-甲醇-水(30∶60∶8，0.015M乙酸鈉)洗脫GM1，約600毫升。接著用氯仿-甲醇-水(30∶60∶8，0.2M乙酸鈉)洗脫其它神經節苷脂。所得GM1洗脫峰減壓濃縮至干，用原體積1/4體積水溶解，即為0.8M乙酸鈉水溶液。此層析所得GM1約2.8克，純度約90％，得率為80％。實例4Source RPC 30反相柱層析實例3所得GM1水溶液中乙酸鈉濃度為0.8M，體積150毫升中含GM1約2.8克，用NaOH調至pH9.0，37℃中保溫1小時后上樣Source RPC 30反相柱。柱規格為20cm×36mm，柱體積300毫升，以10毫升/分鐘流速上樣。經5倍柱體積水溶液平衡柱子后用甲醇-水(2∶1)洗脫GM1。檢測波長為214nm，收集洗脫峰200毫升。此步所得GM1約2.4克，得率大于85％，經lichrospher NH4柱HPLC和TLC分析純度大于98％。實例5GM1干粉制備反相層析所得GM1溶液減壓濃縮成85ml后，加入1升冷丙酮(-10℃)，放置于-10℃中過夜后，GM1沉淀結晶析出。離心收集沉淀，用80℃水溶解，即得GM1水溶液或經真空冷凍干燥后成乳白色干粉，約重2.2克。實例6GM1對體外雞胚背根神經節原代神經元樹突生長的作用取實例5GM1加入DMEM/N1培養基，使終濃度為5×10-6M及1×10-5M。將8日齡雞胚背根神經節原代神經元以相同的培養基混合，每次取100ul細胞懸液加入96孔板(1500個細胞/孔)，培養4小時后，每孔加入含GM1 0.5×10-6M、1×10-5M的培養基100ul，繼續培養24小時。結果表明GM1培養孔的樹突性神經元比例較對照孔顯著增加(P＜0.05)。
權利要求
1.本專利中單唾液酸四己糖神經節苷脂(GM1)的高純度制備工藝特征在于用有機溶劑混合物從哺乳動物腦組織中提取總神經節苷脂，然后對總神經節苷脂提取液濃縮后進行酸水解以提高GM1含量，濃縮水解產物經脫鹽后溶解于有機溶劑混合物中進行陰離子交換柱層析，收集含GM1的洗脫峰，濃縮后再進行反相柱層析。所得GM1于冷丙酮中沉淀，得純度大于98％的GM1干粉。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于提取總神經苷脂所用有機溶劑混合物是氯仿-甲醇-水。提取總脂時其體積比例是氯仿-甲醇-水，1∶2∶0.75，分離總神經節苷脂時其體積比例調節到氯仿-甲醇-水，1∶2∶1 4，腦組織與有機溶劑比例為1∶20(v/v)。
3.根據權利要求1所述方法，其特征在于酸水解的條件是用無機酸將總神經節苷脂水溶液pH調節到3.0-5.0，加熱溫度至80-100℃、水解時間2h。
4.根據權利要求1所述方法，其特征在于所用離子交換介質為Q-Sepharose或DEAE-Sepharose型。
5.根據權利要求4所述方法，其特征在于所用離子交換介質Q-SepharoseF.F.層析條件為(1).上樣條件a柱子用氯仿-甲醇-水，30∶60∶8，(v/v/v)，平衡到電導率小于50us.cm-1；b.樣品溶解于氯仿-甲醇-水，30∶60∶8，(v/v/v)，電導率小于100us cm-1，pH為8.0；(2)洗脫條件a.氯仿-甲醇-水，30∶60∶8，(v/v/v)，(0.015M乙酸鈉)，洗脫GM1；b.氯仿-甲醇-水，30∶60∶8，(v/v/v)，(0.2M乙酸鈉)，洗脫非GM1神經節苷脂。
6.根據權利要求1所述方法，其特征在于所用反相介質為Sourse RPC 30。
7.根據權利要求6所述方法，其特征在于減壓濃縮后GM1溶于含30％正丙醇的水溶液中，加入乙酸鈉定終濃度0.8M，再用NaOH調PH9.0，37℃中1小時后上樣SourcRPC30反相柱，經水相洗脫后，用甲醇-水緩沖液(2∶1)洗脫下GM1。
全文摘要
本發明涉及從動物腦組織中分離純化高純度的單唾液酸四己糖神經節苷脂(Monosialotetrahexosylganglioside,GM1)的工藝方法。該方法主要包括用有機溶劑混合物提取總神經節苷脂,酸水解總神經節苷脂,離子交換柱層析,反相柱層析等四步,所得GM1純度大于98%。由于GM1已用于臨床治療中樞神經損傷疾病。故本發明所述GM1的制備方法適合于規模化生產。
文檔編號C07H15/10GK1353112SQ0013307
公開日2002年6月12日 申請日期2000年11月9日 優先權日2000年11月9日
發明者范開, 王建, 馬素永, 張益 , 田峰, 聶李亞, 黃洪濤 申請人:重慶富進生物醫藥有限公司