單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉gm1原料的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉GM1原料的制備方法，包括如下步驟：a.取凍存新鮮豬腦，解凍，清洗，勻漿，將漿液加入濃鹽酸攪勻、然后離心分離，即得沉淀腦蛋白；b.將沉淀蛋白加入甲醇進行勻漿，然后攪拌，離心過濾，即得醇提液；c.將醇提液濃縮，得醇提濃縮液；d.將經上述步驟得到的醇提濃縮液，水解，然后離心分離，收集上清液，即得水解液；e.將水解液連續多次循環超濾，截留分子量為1600道爾頓以上的物質，得GM1的初純品，再將GM1的初純品超濾，去除分子量為1500道爾頓以下的物質，既得GM1溶液純品；f.將GM1溶液純品干燥，即得單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉GM1原料。
【專利說明】單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原料的制備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原料的制備方法。

【背景技術】
[0002] 單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1廣泛存在于哺乳類動物大腦細胞膜表面和中 樞神經組織中。單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1對神經系統損傷后的修復、促進神經的 生長和再生、促進神經支配功能的恢復、保護神經細胞膜等都有積極的作用。
[0003] 目前獲取單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1的方法是從動物腦組織中提取分離。 然而，神經節苷脂種類多，在腦組織中含量少，特別是其分子組成、結構物理化學性質等因 素十分相近，所以高純度GM1的提取分離難度大，特別是大規模工業化提取工藝還未見有 報道和應用。到目前為止，國內GM1提取分離的工藝主要有Momoi. T方法和利用微生物轉 化的方法或者用硅膠柱從混合神經節苷脂中分離，成本太高，難以大規模應用于臨床，操作 步驟繁瑣、工藝復雜、并消耗大量有機溶劑，提取的GM1含量僅為腦組織含量的萬分之一， 而且純度不高、僅為99%。
[0004] 本領域技術人員渴望獲得一種成本低、純度更高、能大規模工業化提取的單唾液 酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原料，但一直沒有解決這個技術問題。


【發明內容】

[0005] 本發明要解決的技術問題就是提供一種成本低、純度更高、適于大規模工業化應 用的單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原料的制備方法。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明的單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原料的制備 方法，包括如下步驟： a. 取凍存新鮮豬腦，解凍，清洗，勻漿，將漿液加入濃鹽酸攪勻、然后離心分離，去除上 層乳濁液，收集沉淀物，即得沉淀腦蛋白； b. 將經上述步驟得到的沉淀蛋白加入甲醇進行勻漿，再用氫氧化鈉調pH值為7-9,然 后攪拌，離心過濾，收集上清液，即得醇提液； c. 將經上述步驟得到的醇提液濃縮，得醇提濃縮液； d. 將經上述步驟得到的醇提濃縮液，調pH值為2-5,水解，然后離心分離，收集上清 液，即得水解液； e. 將經上述步驟所得水解液連續多次循環超濾，截留分子量為1600道爾頓以上的物 質，得GM1的初純品，再將GM1的初純品超濾，去除分子量為1500道爾頓以下的物質，既得 GM1溶液純品； f. 將經上述步驟所得GM1溶液純品干燥，即得單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原 料。
[0007] 進一步改進，所述a步驟，取凍存新鮮豬腦，加水浸泡自然解凍，再用水清洗，然后 加入豬腦重2-5倍重量的純化水用膠體磨勻漿lOmin，將勻漿所得漿液倒入提取罐中加熱 至80-85°C后保溫10-20min，再按豬腦重每lkg加入2-5 ml的比例加入濃度為12mol/L的 濃鹽酸攪勻、冷卻至20-50°C，再以3500-4000r/min的速度離心分離5min，然后去除上層乳 濁液，收集沉淀物，即得純化腦蛋白。
[0008] 進一步改進，所述b步驟，將經a步驟所得純化蛋白按豬腦重量3-6倍的比例加入 濃度為75-95%的甲醇，膠體磨勻漿1次，倒入提取罐中，用6mol/L氫氧化鈉調pH值為7-9， 加熱保溫至40-60°C攪拌3-8h，再以3500-4000r/min的速度離心分離5min，棄沉淀，收集上 清液，即得醇提液。
[0009] 進一步改進，所述C步驟，將經b步驟所得醇提液，60-80°C條件下真空減壓濃縮至 豬腦重量的1/3-1/5,即得醇提濃縮液。
[0010] 進一步改進，所述d步驟，將經C步驟所得醇提濃縮液，用6mol/L鹽酸溶液調pH 值為2-5,60-80°C條件下水解3-5h，然后冷卻至20-50°C，以3500-4000r/min的速度離心分 離5min，棄沉淀，收集上清液，再用6mol/L氫氧化鈉溶液調pH值為7-8,即得水解液。
[0011] 進一步改進，所述e步驟，將d步驟所得水解液置于能截留分子量為1600道爾頓 的中空纖維超濾膜內進行連續多次循環超濾，截留分子量為1600道爾頓以上的物質，得 GM1的初純品，再將GM1的初純品置于能夠截留分子量為1500道爾頓的中空纖維超濾膜中 超濾，去除分子量為1500道爾頓以下的物質，得GM1溶液純品。
[0012] 進一步改進，所述f步驟，將e步驟所得GM1溶液純品以-60°C冷凍干燥或噴霧干 燥，即得單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原料。
[0013] 本發明的方法利用ph梯度的極性有機溶劑少量的甲醇，經調整ph值和溫度、能高 效地將GM1從豬腦組織中經過純化蛋白、醇提、濃縮、水解、提純、干燥步驟處理，所提取的 GM1含量達到豬腦組織含量的千分之一，純度可達99. 9%以上，詳見附圖，其各項質量指標 都符合相關標準要求；且有機溶劑用量少、工藝簡單、周期短，因而成本低。
[0014] 本發明的方法簡單可控，能適用于大批量制備單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1 原料，能夠一次性處理大量豬腦組織，純化量大，可以進行規?；a，適于大規模工業化 應用。
[0015] 采用本發明的方法制備的單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原料可以用于制備 醫用注射液、凍干粉針及口服制劑等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是本發明方法制備的單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原料的GM1含量HPLC 色譜圖。

【具體實施方式】
[0017] 下面詳細說明本發明方法的實施方式，但不僅限于以下實施例。
[0018] 實施例一 本發明的單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原料的制備方法包括如下步驟： a.取凍存新鮮豬腦50Kg，加水浸泡自然解凍，再用水清洗，然后加入100kg純化水用 膠體磨勻漿l〇min，將勻漿所得漿液倒入提取罐中加熱至80°C后保溫lOmin，再加入150 ml 的比例加入濃度為12mol/L的濃鹽酸攪勻、冷卻至20°C，再以3500r/min的速度離心分離 5min，然后去除上層乳濁液，收集沉淀物，即得純化腦蛋白； b. 將經a步驟所得純化蛋白加入150kg濃度為75%的甲醇，膠體磨勻漿1次，倒入提 取罐中，用6mol/L氫氧化鈉調pH值為7,加熱保溫至40°C攪拌3h，再以3500r/min的速度 離心分離5min，棄沉淀，收集上清液，即得醇提液； c. 將經b步驟所得醇提液，60°C條件下真空減壓濃縮至17kg，即得醇提濃縮液； d. 將經c步驟所得醇提濃縮液，用6mol/L鹽酸溶液調pH值為2,60°C條件下水解3h， 然后冷卻至20°C，以3500r/min的速度離心分離5min，棄沉淀，收集上清液，用6mol/L氫氧 化鈉溶液調PH7. 5,即得水解液； e. 將d步驟所得水解液置于能截留分子量為1600道爾頓的中空纖維超濾膜內進行連 續5次循環超濾，截留分子量為1600道爾頓以上的物質，得GM1的初純品，再將GM1的初純 品置于能夠截留分子量為1500道爾頓的中空纖維超濾膜中超濾，去除分子量為1500道爾 頓以下的物質，得GM1溶液純品； f. 將e步驟所得GM1溶液純品置于冷凍干燥機中以-60°C冷凍干燥，即得單唾液酸四 已糖神經節苷脂鈉 GM1原料。
[0019] 實施例二 a. 取凍存新鮮豬腦50Kg，加水浸泡自然解凍，再用水清洗，然后加入100kg純化水用 膠體磨勻漿l〇min，將勻漿所得漿液倒入提取罐中加熱至85°C后保溫15min，再加入250 ml 的比例加入濃度為12mol/L的濃鹽酸攪勻、冷卻至35°C，再以3800r/min的速度離心分離 5min，然后去除上層乳濁液，收集沉淀物，即得純化腦蛋白； b. 將經a步驟所得純化蛋白加入250kg濃度為75%的甲醇，膠體磨勻楽1次、lOmin, 倒入提取罐中，用6mol/L氫氧化鈉調pH值為8. 5,加熱保溫至52°C攪拌6h，再以3800r/min 的速度離心分離5min，棄沉淀，收集上清液，即得醇提液； c. 將經b步驟所得醇提液，70°C條件下真空減壓濃縮至12. 5kg，即得醇提濃縮液； d. 將經c步驟所得醇提濃縮液，用6mol/L鹽酸溶液調pH值為3. 5, 75°C條件下水解 4h，然后冷卻至3(TC，以3800r/min的速度離心分離5min，棄沉淀，收集上清液，用6mol/L 氫氧化鈉溶液調PH7. 6,即得水解液； e. 將d步驟所得水解液置于能截留分子量為1600道爾頓的中空纖維超濾膜內進行連 續6次循環超濾，截留分子量為1600道爾頓以上的物質，得GM1的初純品，再將GM1的初純 品置于能夠截留分子量為1500道爾頓的中空纖維超濾膜中超濾，去除分子量為1500道爾 頓以下的物質，得GM1溶液純品； f. 將e步驟所得GM1溶液純品置于冷凍干燥機中以-60°C冷凍干燥，即得單唾液酸四 已糖神經節苷脂鈉 GM1原料。
[0020] 實施例三 a. 取凍存新鮮豬腦50Kg，加水浸泡自然解凍，再用水清洗，然后加入200kg純化水用 膠體磨勻漿lOmin，將勻漿所得漿液倒入提取罐中加熱至85°C后保溫20min，再加入250 ml 的比例加入濃度為12mol/L的濃鹽酸攪勻、冷卻至50°C，再以4000r/min的速度離心分離 5min，然后去除上層乳濁液，收集沉淀物，即得純化腦蛋白； b. 將經a步驟所得純化蛋白加入300kg濃度為95%的甲醇，膠體磨勻楽1次、lOmin, 倒入提取罐中，用6mol/L氫氧化鈉調pH值為9,加熱保溫至60°C攪拌8h，再以4000r/min 的速度離心分離5min，棄沉淀，收集上清液，即得醇提液； c. 將經b步驟所得醇提液，80°C條件下真空減壓濃縮至10kg，即得醇提濃縮液； d. 將經c步驟所得醇提濃縮液，用6mol/L鹽酸溶液調pH值為3. 8,80°C條件下水解 5h，然后冷卻至5(TC，以4000r/min的速度離心分離5min，棄沉淀，收集上清液，用6mol/L 氫氧化鈉溶液調PH7. 5,即得水解液； e. 將d步驟所得水解液置于能截留分子量為1600道爾頓的中空纖維超濾膜內進行連 續6次循環超濾，截留分子量為1600道爾頓以上的物質，得GM1的初純品，再將GM1的初純 品置于能夠截留分子量為1500道爾頓的中空纖維超濾膜中超濾，去除分子量為1500道爾 頓以下的物質，得GM1溶液純品； f. 將e步驟所得GM1溶液純品置于噴霧干燥機以180°C噴霧干燥，即得單唾液酸四已 糖神經節苷脂鈉 GM1原料。
[0021] 上述例舉了 3個典型的實施例，但不限于這些實施例。 申請人:經過反復試驗得到 本發明的方法，方法簡單可控，并按照該方法進行了反復的試驗，所制備的單唾液酸四已糖 神經節苷脂鈉 GM1原料都符合相關標準要求，試驗數據詳見下表。

【權利要求】
1. 一種單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原料的制備方法，其特征在于包括如下步 驟： a. 取凍存新鮮豬腦，解凍，清洗，勻漿，將漿液加入濃鹽酸攪勻、然后離心分離，去除上 層乳濁液，收集沉淀物，即得沉淀腦蛋白； b. 將經上述步驟得到的沉淀蛋白加入甲醇進行勻漿，再用氫氧化鈉調pH值為7-9,然 后攪拌，離心過濾，收集上清液，即得醇提液； c. 將經上述步驟得到的醇提液濃縮，得醇提濃縮液； d. 將經上述步驟得到的醇提濃縮液，調pH值為2-5,水解，然后離心分離，收集上清 液，即得水解液； e. 將經上述步驟所得水解液連續多次循環超濾，截留分子量為1600道爾頓以上的物 質，得GM1的初純品，再將GM1的初純品超濾，去除分子量為1500道爾頓以下的物質，既得 GM1溶液純品； f. 將經上述步驟所得GM1溶液純品干燥，即得單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原 料。
2. 根據權利要求1所述單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原料的制備方法，其特征在 于：所述a步驟，取凍存新鮮豬腦，加水浸泡自然解凍，再用水清洗，然后加入豬腦重2-5倍 重量的純化水用膠體磨勻漿lOmin，將勻漿所得漿液倒入提取罐中加熱至80-85°C后保溫 10-20min，再按豬腦重每lkg加入2-5 ml的比例加入濃度為12mol/L的濃鹽酸攪勻、冷卻 至20-50°C，再以3500-4000r/min的速度離心分離5min，然后去除上層乳濁液，收集沉淀 物，即得純化腦蛋白。
3. 根據權利要求1所述單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原料的制備方法，其特征在 于：所述b步驟，將經a步驟所得純化蛋白按豬腦重量3-6倍的比例加入濃度為75-95%的甲 醇，膠體磨勻漿1次，倒入提取罐中，用6mol/L氫氧化鈉調pH值為7-9,加熱保溫至40-60°C 攪拌3-8h，再以3500-4000r/min的速度離心分離5min，棄沉淀，收集上清液，即得醇提液。
4. 根據權利要求1所述單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原料的制備方法，其特征 在于：所述c步驟，將經b步驟所得醇提液，60-8(TC條件下真空減壓濃縮至豬腦重量的 1/3-1/5,即得醇提濃縮液。
5. 根據權利要求1所述單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原料的制備方法，其特征在 于：所述d步驟，將經c步驟所得醇提濃縮液，用6mol/L鹽酸溶液調pH值為2-5,60-80°C 條件下水解3-5h，然后冷卻至20-50°C，以3500-4000r/min的速度離心分離5min，棄沉淀， 收集上清液，再用6mol/L氫氧化鈉溶液調pH值為7-8,即得水解液。
6. 根據權利要求1所述單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原料的制備方法，其特征在 于：所述e步驟，將d步驟所得水解液置于能截留分子量為1600道爾頓的中空纖維超濾膜 內進行連續多次循環超濾，截留分子量為1600道爾頓以上的物質，得GM1的初純品，再將 GM1的初純品置于能夠截留分子量為1500道爾頓的中空纖維超濾膜中超濾，去除分子量為 1500道爾頓以下的物質，得GM1溶液純品。
7. 根據權利要求1所述單唾液酸四已糖神經節苷脂鈉 GM1原料的制備方法，其特征在 于：所述f步驟，將e步驟所得GM1溶液純品以-60°C冷凍干燥或噴霧干燥，即得單唾液酸 四已糖神經節苷脂鈉 GM1原料。
【文檔編號】C07H1/00GK104151372SQ201410368540
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月30日 優先權日:2014年7月30日
【發明者】釧助勝, 彭亞琦 申請人:湖南利諾生物藥業有限公司