專利名稱：家蠶微孢子蟲孢壁蛋白swp32基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種來自于家蠶微孢子蟲孢壁上的與家蠶相互 作用的孢壁蛋白基因SWP32。
技術背景微孢子蟲(必'cro邵oric/i's)隸屬于原生生物界(尸rot/"a)、微孢子蟲門(#icrospora) (Levine and Corliss 1980)，近期研究表明微孢子蟲在進化上與真菌有著緊密的親緣關 系。微孢子蟲近150個屬1300余種，是專營細胞內寄生，具有抗性極強的孢子，通過極 管刺入宿主組織細胞后將其孢原質注入細胞，完成感染并大量增殖，最終破壞宿主組織。 它能廣泛寄生感染無脊椎動物和脊椎動物，尤其是極具經濟價值的昆蟲、魚類、嚙齒類、 兔類、皮毛動物、靈長類以及家庭寵物如狗和鳥，引發疾病甚至死亡。其中家蠶微孢子蟲 (/fese/ag 60/^.KCi's)，能經食下和胚種途徑寄生于家蠶，引發嚴重的傳染性微粒子病，最 終導致家蠶大規模死亡，給世界蠶業造成巨大的經濟損失，成為近100年來影響蠶業生產 的難題。另外新發現，許多屬的微孢子蟲與人類疾病有關，如角膜病、角膜結膜炎、呼吸 疾病、前列腺肥大和擴散感染、肝炎、腦炎、痢疾、肌炎、膽管炎等等，甚至還能機會性 地感染艾滋病(AIDS)患者、器官移植病人、服用免疫抑制劑藥物病人和先天性免疫機能 不健全者，引起呼吸系統、泌尿系統和皮膚潰爛等惡性疾病，加劇病情，加速病人的死亡。 對于微孢子的治療已有報道，如煙曲霉素及它的衍生物抑制甲硫氨酸氨基肽酶2的活 性，阿苯達唑和苯丙咪唑能夠抑制微管蛋白形成，它們被鑒定為治療微孢子的有用藥劑， 然而，對于治療感染人類的多種微孢子仍沒有找到有效、安全的藥物。微孢子蟲能夠產生一種感染性的，能夠抵制環境的孢子，孢子彈出內部極絲并將其內 含物接種到臨近宿主細胞。孢子發芽機制一直吸引著微孢子蟲研究者們。近年來的研究表 明，在微孢子蟲受到外界刺激發芽之前，存在一個微孢子蟲孢子與宿主細胞相互接觸，以 提高宿主細胞感染率的過程，而微孢子蟲的孢壁蛋白在此過程中起著與宿主細胞相互識別 和粘附的作用，如果抑制了微孢子蟲孢子與宿主細胞的粘附作用，就可能降低了宿主細胞 的感染率甚至控制宿主細胞的感染，因此近年來微孢子蟲孢壁蛋白已成為該領域的研究焦 點。發明內容本發明基于蛋白質組學研究和基因組數據分析，克隆分析和免疫學鑒定家蠶微孢子蟲 孢壁蛋白蛋白基因SWP32，通過對家蠶微孢子蟲孢壁蛋白基因的克隆，得到了孢壁蛋白 SWP32的編碼序列，具體方法如下(1) 引物設計根據蛋白質組學的方法以及家蠶微孢子蟲的6倍基因組數據，獲得 孢壁蛋白SWP32編碼序列，利用引物設計軟件Primer 5.0進行引物設計，在正向引物加入 BamHI酶切位點，在反向引物加入XhoI酶切位點。引物序列分別為SWP32-primer-F: 5， GCGGATCCATGAAAACTTCAGTGGTTATCC 3' SWP32-primer-R: 5， CCGCTCGAGGCATTGATAAGAACAGACC 3'(2) NbSWP32基因PCR擴增由于微孢子蟲基因組的高度簡化特點，內含子很少， 基因組序列數據顯示SWP32基因不含內含子，故利用提取的微孢子基因組直接作為模板， 采用基因組PCR擴增目的片段。SWP32基因長度為948 bp;(3) NbSWP32基因克隆NbSWP32擴增片段克隆到pMD18-T (TaKaRa)載體上， 然后進行序列測定，從而獲得NbSWP32的全長編碼序列；(4) 序列分析將家蠶微孢子蟲NbSWP32與NCBI數據庫所登錄的蛋白質庫同源比 對分析，表明NbSWP32無同源序列存在。序列分析結果見下表。ProteinSP/Lth (Aa)ESTNCBI homologueTMD Predicted N-glycosylat ion sitesPredicted phosphoryla tion sitespl/MM (闊HBM numberSWP32腦16Yesnono YesYes7.25/37.4(5)蛋白的鑒定將克隆的SWP32基因進行原核表達，制備抗血清，利用免疫學的 手段免疫印跡、間接熒光免疫實驗和免疫電鏡對SWP32蛋白進行鑒定。結果表明SWP32 蛋白質在家蠶微孢子蟲孢壁上特異性表達，而且為孢壁蛋白。上述方法獲得的NbSWP32基因編碼序列及其推斷的氨基酸序列如下 SWP32的序列1 atgaaaacttcagtggttatccttgcaatgeigctatattacatceiatctttgccaat組 MKTSVVILAMSYITSIFANNSYDFCDGEFAISEKDDKCGF 121 tcatttaatcc8tgtaccct3tataaacagatacaga肌gaatattcaa8ictgcgteata181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901SFNPCTLYKQIQKEYSNCVI ctcagattttaccttaaagcgattagtaacatgttagaaagtatctgtgacaacaacaaa LRFYLKAISNMLESICDNNKRCLPFSIDSLYRPLYNREOF aagcacaaacaccaccatactttgtacgctctcttcagaaattgcttatatcttgtcaacKHKHHHTLYALFRNCLYLVN ccaatttatttcaaagaataccaagatgctcttgcatgtaatcaattagatgtctgctacPIYFKEYQDALACNQLDVCY tttttaattagaagaacagtatgccctaagtatggagttacgaaatacatcgaatgtcttFLIRRTVCPKYGVTKYIECL aaaaagagatgtgaagataggtttgatgaaaaagaacttgctatctttatctgtgattcaKKRCEDRFDEKELAIFICDS gagacatttgtcaatatcaaacttgaaattgatgcttgcagaaaaatatgccccgctgatETFVNIKLEIDACRKICPAD tgtacacttgatatttgtaaaatatacagtcttgatttctgggagagaagagatttattgCTLDICKIYSLDFWERRDLL aaagcaatttttgattatcattactgccatgttttatcttctgacaatacaageigatgaaKAIFDYHYCHVLSSDNTRDE ataattaaaaagattgaagagatctatctaaatggaactgaaagagatataaaattcactIIKKIEEIYLNGTERDIKFT tcattcattatataccaacttttcactgatttagttgcatgcaaatcaagtgataaaaatSFIIYQLFTDLVACKSSDKNIKRILDLICLYEKKDKCPSG gtgatggttatgattgaattcttcgtaaaggtctgttcttatcaatgctaa VMVMIEFFVKVCSYQC本本發明的優點是(1) 微孢子蟲孢壁蛋白在孢子與宿主細胞相互粘附的過程中起著起要的作用，抑制 了孢子與宿主細胞之間的粘附能有效控制微孢子蟲的感染。孢壁蛋白SWP32基因具有與宿 主細胞結合的潛在基序。(2) 序列分析結果顯示孢壁蛋白SWP32基因均是家蠶微孢子蟲物種所特有的基因， 實驗證明針對SWP32蛋白的抗體與其他蛋白無交叉反應，可以用于家蠶微孢子蟲的免疫 學檢測，為蠶業生產上微粒子病檢測手段帶來革命性的改變。
具體實施方式
-實施例根據蛋白質組學的方法以及家蠶微孢子蟲的6倍基因組數據，通過基因組數據庫以及一系列的克隆與亞克隆，獲得了家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP32基因編碼序列，利用引物設計軟件Primer 5.0進行引物設計，在正向引物加入BamH I酶切位點，在反向引物加入 Xhol酶切位點，分別設計如下引物SWP32-primer-F: 5' GCGGATCCATGAAAACTTCAGTGGTTATCC 3, SWP32-primer-R: 5， CCGCTCGAGGCATTGATAAGAACAGACC 3' 從家蠶微孢子蟲基因組DNA上擴增SWP32基因編碼序列，擴增片段克隆到pMD18-T (TaKaRa)載體上，然后進行序列測定，從而獲得SWP32基因的全長編碼序列。將SWP32 基因不含信號肽的序列克隆到原核表達載體pGEX-4Tl上進行誘導表達，純化表達產物； 將純化的表達產物作為抗原免疫小鼠制備抗血清；利用免疫學的手段免疫印跡、間接熒光 免疫實驗和免疫電鏡對SWP32蛋白或家蠶微孢子蟲進行鑒定、診斷。
權利要求
1、家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP32基因，其特征在于其序列如下ATGAAAACTT CAGTGGTTAT CCTTGCAATG AGCTATATTA CATCAATCTT TGCCAATAAT60TCTTATGATT TCTGTGACGG AGAATTTGCT ATAAGTGAGA AAGATGATAA ATGTGGTTTC120TCATTTAATC CATGTACCCT ATATAAACAG ATACAGAAAG AATATTCAAA CTGCGTAATA180CTCAGATTTT ACCTTAAAGC GATTAGTAAC ATGTTAGAAA GTATCTGTGA CAACAACAAA240AGATGTTTAC CATTTTCTAT TGACTCCTTA TATCGTCCAC TTTACAACCG TGAACAATTT300AAGCACAAAC ACCACCATAC TTTGTACGCT CTCTTCAGAA ATTGCTTATA TCTTGTCAAC360CCAATTTATT TCAAAGAATA CCAAGATGCT CTTGCATGTA ATCAATTAGA TGTCTGCTAC420TTTTTAATTA GAAGAACAGT ATGCCCTAAG TATGGAGTTA CGAAATACAT CGAATGTCTT480AAAAAGAGAT GTGAAGATAG GTTTGATGAA AAAGAACTTG CTATCTTTAT CTGTGATTCA540GAGACATTTG TCAATATCAA ACTTGAAATT GATGCTTGCA GAAAAATATG CCCCGCTGAT600TGTACACTTG ATATTTGTAA AATATACAGT CTTGATTTCT GGGAGAGAAG AGATTTATTG660AAAGCAATTT TTGATTATCA TTACTGCCAT GTTTTATCTT CTGACAATAC AAGAGATGAA720ATAATTAAAA AGATTGAAGA GATCTATCTA AATGGAACTG AAAGAGATAT AAAATTCACT780TCATTCATTA TATACCAACT TTTCACTGAT TTAGTTGCAT GCAAATCAAG TGATAAAAAT840ATTAAAAGAA TCTTGGACTT GATTTGTCTT TACGAGAAAA AGGATAAATG TCCTTCTGGT900GTGATGGTTA TGATTGAATT CTTCGTAAAG GTCTGTTCTT ATCAATGCTA A 951。
2、家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP32基因編碼的蛋白質，其特征在于其序列如下:MKTSVVILAMSYITSIFANNSYDFCDGEFAISEKDDKCGFSFNPCT國IQKEYSNCVI60LRFYLKAISNMLESIC酬KRCLPFSIDSLYRPLYN卿FK服HHHTLYALFRNCLYLVN120PIYFKEYQDALA國LDVCYFLIRRTVCPKYGVTKYIECLKKRCEDRFDEKELAIFICDS180ETFVNIKLEID織KICPADCTLDICKIYSL訓E,LLKAIFDYHYCHVLSSDNTRDE240I腦EEIYLNGTERDIKFTSFIIYQLFTDLVACKSSDKNIKRILDLICLYEKKDKCPSG300VMVMIEFFVKVCSYQC3160
全文摘要
一種家蠶微孢子蟲孢壁蛋白基因SWP32，依據蛋白質組學的方法和家蠶微孢子蟲的6倍基因組數據，經過克隆與亞克隆得到編碼家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP32編碼序列，并經一系列生物技術克隆以及免疫學手段證實。本發明所獲得的家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP32基因為家蠶微孢子蟲物種所特有，免疫學實驗表明針對NbSWP32蛋白的抗體與其他蛋白無交叉反應。該基因可用于家蠶微孢子蟲病的分子生物學、免疫學檢測，為蠶業生產上微粒子病的檢測帶來革命性的改變。
文檔編號C07K14/435GK101250538SQ20081006941
公開日2008年8月27日 申請日期2008年3月3日 優先權日2008年3月3日
發明者向仲懷, 周澤揚, 夏慶友, 潘國慶 申請人:重慶拓桑生物科技有限公司