專(zhuān)利名稱(chēng)：蠶微孢子蟲(chóng)、核型多角體病毒和濃核病毒的三重?zé)晒鈖cr檢測(cè)方法及試劑盒和引物、探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域,涉及家蠶微孢子蟲(chóng)(Ab1Seaa bombycis, Nb)、家蠶核型多角體病毒(及mori Nuclear Polyhedrosis Virus, BmNPV)和家香濃核病毒 (.Bombyx mori Densovirus, BmDNV)的三重突光定量PCR檢測(cè)方法及試劑盒和引物、探針。
背景技術(shù)：
家香微抱子蟲(chóng)iNosema bombyci s, Nb)、家香核型多角體病毒iBombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus,BmNPV)和家香濃核病毒麗xri Densovirus,BmDNV), 分別是引起家蠶的微粒子病、核型多角體病和家蠶濃核病的病原體，均可造成世界蠶業(yè)巨大經(jīng)濟(jì)損失，甚至有可能同時(shí)混合感染。由于對(duì)上述蠶病缺少有效的控制手段，因此對(duì)病原微生物的早期檢測(cè)鑒定非常重要，準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)方法能有效的防止疾病的傳播，減少經(jīng)濟(jì)損失。蠶微孢子蟲(chóng)屬原生動(dòng)物界微孢子蟲(chóng)門(mén)、微孢子蟲(chóng)綱、微孢子蟲(chóng)目、微孢子蟲(chóng)科、微孢子蟲(chóng)屬。家蠶核型多角體病毒屬桿狀病毒科，真桿狀病毒亞科，核型多角體病毒屬，是雙鏈DNA病毒。家蠶濃核病毒屬細(xì)小病毒科，濃核病毒亞科，相同病毒屬，是單鏈DNA病毒。顯微鏡被廣泛用于家蠶孢子蟲(chóng)的檢測(cè)，但其特異性和靈敏度不高，檢測(cè)速度和效率較低；而對(duì)家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒的檢測(cè)，更加需要電子顯微鏡，檢測(cè)速度和效率較低，也不能同時(shí)鑒別診斷。血清學(xué)鑒別法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，但是存在比較高的交叉反應(yīng)與非特異性反應(yīng)，而且家蠶孢子蟲(chóng)是顆粒性抗原，血清學(xué)檢測(cè)不穩(wěn)定。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，上述3種病原體都可以通過(guò)在保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)。熒光實(shí)時(shí)定量PCR (Real-time PCR)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)標(biāo)記的探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)擴(kuò)增曲線對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。 TaqMan探針是常用的一種熒光標(biāo)記方法，PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的TaqMan熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的 5’ 一3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)是指在同一個(gè)熒光定量PCR擴(kuò)增試驗(yàn)中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因，而每個(gè)目的基因采用不同波長(zhǎng)的熒光探針進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)該原理設(shè)計(jì)特異性多重?zé)晒馓结槪Ｓ玫臒晒饣鶊F(tuán)有FAM、TET、VIC、HEX、ROX等，可通過(guò)不同的熒光檢測(cè)通道，同時(shí)檢測(cè)多種熒光信號(hào)。

發(fā)明內(nèi)容
為了實(shí)現(xiàn)同步檢測(cè)家蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒的三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)用試劑盒；本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒的檢測(cè)引物和探針；本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒的三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)在家蠶中對(duì)上述3種病原微生物的快速早期鑒別診斷，由于引物和探針具有很高的特異性和靈敏度，提高了早期鑒別檢測(cè)效率，并簡(jiǎn)化了檢測(cè)方法。為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒的三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒， 該試劑盒包括Premix Ex Taq試劑、引物和探針,其中
1)家蠶微孢子蟲(chóng)的引物和探針
引物的序列如下上游引物AGTGCCATCGTTGCTGGTT,
下游引物TGGGCCTTTCTTCTTTCCTAT ；
探針的序列如下FAM-ACCGCTAAGGAAACCCGCAAGGA-Eclipse ；
2)家蠶核型多角體病毒的引物和探針
引物的序列如下上游引物ATCGCCATCGGACAACGCGG，
下游引物GTGGCCGTCCGAATGCGTCT ；
探針的序列如下HEX-TTATGTCGGTGGATCGACAA-Eclipse ；
3)家蠶濃核病毒的引物和探針
引物的序列如下上游引物GGTGGAAGTGGAAGTGGAAA，
下游引物TTTCCACTCGATTGGCTTGT ；
探針的序列如下ROX-GGTGCAAGTAGAGGAGGTGC-Ec Iipse0為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
蠶微孢子蟲(chóng)熒光定量PCR檢測(cè)用引物，該引物的序列如下
上游引物AGTGCCATCGTTGCTGGTT，
下游引物TGGGCCTTTCTTCTTTCCTAT。蠶微孢子蟲(chóng)熒光定量PCR檢測(cè)用探針，該探針針對(duì)上述的引物擴(kuò)增的基因片段， 探針的序列如下FAM-ACCGCTAAGGAAACCCGCAAGGA-Ec Iipse0家蠶核型多角體病毒熒光定量PCR檢測(cè)用引物，該引物的序列如下
上游引物ATCGCCATCGGACAACGCGG，
下游引物GTGGCCGTCCGAATGCGTCT。家蠶核型多角體病毒熒光定量PCR檢測(cè)用探針，該探針針對(duì)上述的引物擴(kuò)增的基因片段，探針的序列如下HEX-TTATGTCGGTGGATCGACAA-Eclipse。家蠶濃核病毒熒光定量PCR檢測(cè)用引物，該引物的序列如下
引物的序列如下上游引物GGTGGAAGTGGAAGTGGAAA，
下游引物TTTCCACTCGATTGGCTTGT。家蠶濃核病毒熒光定量PCR檢測(cè)用探針，該探針針對(duì)上述的引物擴(kuò)增的基因片段，探針的序列如下探針的序列如下ROX-GGTGCAAGTAGAGGAGGTGC-Eclipse。為了實(shí)現(xiàn)上述的第三個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒的三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，該方法包括以下的步驟1)樣本DNA提取選取感染上述病原體的家蠶材料O.2g，經(jīng)玻璃珠破碎法破碎，6000 r/min, 20 s X 6次，使用DNA抽提試劑盒進(jìn)行DNA抽提，抽提后的DNA溶解在20 μ I水中；
2)三重?zé)晒釶CR擴(kuò)增法對(duì)3種樣本的同步檢測(cè)
蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒的引物和探針的序列如上所述；
三重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系如下10μ I Premix Ex Taq，各引物10 pmol/μ I均O. 13 μ 1， 各探針10 pmol/μ I均0.27 μ 1，取上述提取的DNA液4μ 1，蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒的DNA濃度分別為2. 5 ng/ μ 1，用水補(bǔ)足體積至20 μ I ;
應(yīng)用熒光定量PCR儀Iightcycle 480進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?I) 95°C, 10 sec ； (2) 95°C,5 sec ；60°C,23 sec ；40 個(gè)循環(huán)；
3)調(diào)用相應(yīng)熒光補(bǔ)償程序，進(jìn)行熒光補(bǔ)償，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定；一般認(rèn)為Ct值小于等于 35時(shí)，結(jié)果為陽(yáng)性，Ct值大于等于40時(shí)，結(jié)果為陰性，Ct值介于35-40時(shí)，需要進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，若仍介于35-40，則判斷為陽(yáng)性，若大于等于40則判斷為陰性。上述的熒光補(bǔ)償反應(yīng)程序參照Roche說(shuō)明書(shū)，S卩⑴95°C，10 sec ； (2) 95°C，5 sec ；60°C,23 sec ；40 個(gè)循環(huán)；(3)95°C，10 sec ；40°C,30 sec ；95°C, continous ；40°C,1 sec。補(bǔ)償反應(yīng)時(shí)進(jìn)行單重突光反應(yīng),單重突光反應(yīng)體系如下10μ1 Premix Ex Taq,上述的上游、下游引物10 pmol/μ I各O. 4μ 1，上述的探針10 pmol/μ 1，O. 8 μ 1，取DNA 1μ 1， 蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒的的DNA含量分別為2. 5 ng/ μ I,用水補(bǔ)足體積至20 μ I0本發(fā)明基于具有高度物種特異性的家蠶微孢子蟲(chóng)小亞單位核糖體RNA基因序觀 iNosema bombycis small subunit ribosomal RNA, FJ854545 (基因序列號(hào)))、家香核型多角體病毒DNA聚合酶基因序列mori nucleopolyhedrovirus gene for DNA polymerase, D16231)和家蠶濃核病毒鎮(zhèn)江株假設(shè)結(jié)構(gòu)蛋白基因序列mori densovirus isolate Zhenjiang putative structural protein gene, AY236978),分別設(shè)計(jì)了各自的引物和探針，并在3個(gè)探針上標(biāo)記了不同的熒光信號(hào)，在優(yōu)化了 PCR反應(yīng)體系的條件下，實(shí)現(xiàn)三重?zé)晒舛縋CR同步檢測(cè)蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒。由于該3種病原體的核酸均為DNA，因此，不僅可實(shí)現(xiàn)DNA同步提取，也可以進(jìn)行熒光 PCR同步檢測(cè)，大大簡(jiǎn)化了檢測(cè)方法，并通過(guò)熒光補(bǔ)償?shù)某绦颍行У叵艘驘晒庑盘?hào)的交集而引起的假陽(yáng)性。由于該方法引入了高特異性擴(kuò)增引物和不同熒光標(biāo)記的探針，確保了本方法能快速、特異和靈敏的一次性鑒別檢測(cè)蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒，可提高早期檢出率，有效防止疾病的傳播，減少經(jīng)濟(jì)損失。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I引物和探針的設(shè)計(jì)
基于具有高度物種特異性的家蠶微孢子蟲(chóng)小亞單位核糖體RNA基因序列iNoserm bombycis small subunit ribosomal RNA, FJ854545 (基因序列號(hào)))、家香核型多角體病毒DNA聚合酶基因序列{Bombyx mori nucleopolyhedrovirus gene for DNA polymerase, D16231)和家香濃核病毒鎮(zhèn)江株假設(shè)結(jié)構(gòu)蛋白基因序列mori densovirus isolate Zhenjiang putative structural protein gene，AY236978)，用生物信息學(xué)方法根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，并利用Primer Express設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)出擴(kuò)增上述基因片段的特異性引物和熒光探針若干組。將設(shè)計(jì)得到的引物和探針--進(jìn)行BLAST驗(yàn)證(http://blast. ncbi. nlm.
nih. gov/),以保證引物的高特異性。并進(jìn)一步利用DNAStar軟件,驗(yàn)證各引物探針間是否會(huì)產(chǎn)生引物二聚體等。經(jīng)過(guò)上述驗(yàn)證，最后選擇了如表I所示的引物和探針，并在探針上分別標(biāo)記不同的熒光信號(hào)，以實(shí)現(xiàn)3通道同步檢測(cè)。表I家蠶微孢子蟲(chóng)、核型多角體病毒和濃核病毒檢測(cè)的引物和探針
權(quán)利要求
1.蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒的三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括Premix Ex Taq試劑、引物和探針,其特征在于1)家蠶微孢子蟲(chóng)的引物和探針引物的序列如下上游引物AGTGCCATCGTTGCTGGTT,下游引物TGGGCCTTTCTTCTTTCCTAT ；探針的序列如下FAM-ACCGCTAAGGAAACCCGCAAGGA-Eclipse ；2)家蠶核型多角體病毒的引物和探針引物的序列如下上游引物ATCGCCATCGGACAACGCGG，下游引物GTGGCCGTCCGAATGCGTCT ；探針的序列如下HEX-TTATGTCGGTGGATCGACAA-Eclipse ；3)家蠶濃核病毒的引物和探針引物的序列如下上游引物GGTGGAAGTGGAAGTGGAAA，下游引物TTTCCACTCGATTGGCTTGT ；探針的序列如下ROX-GGTGCAAGTAGAGGAGGTGC-Ec Iipse0
2.蠶微孢子蟲(chóng)熒光定量PCR檢測(cè)用引物，其特征在于該引物的序列如下上游引物AGTGCCATCGTTGCTGGTT，下游引物TGGGCCTTTCTTCTTTCCTAT。
3.蠶微孢子蟲(chóng)熒光定量PCR檢測(cè)用探針，其特征在于該探針針對(duì)權(quán)利要求2所述引物擴(kuò)增的基因片段，探針的序列如下FAM-ACCGCTAAGGAAACCCGCAAGGA-Eclipse。
4.家蠶核型多角體病毒熒光定量PCR檢測(cè)用引物，其特征在于該引物的序列如下 上游引物ATCGCCATCGGACAACGCGG，下游引物GTGGCCGTCCGAATGCGTCT。
5.家蠶核型多角體病毒熒光定量PCR檢測(cè)用探針，其特征在于該探針針對(duì)權(quán)利要求4 所述弓I物擴(kuò)增的基因片段，探針的序列如下HEX-TTATGTCGGTGGATCGACAA-Eclipse。
6.家蠶濃核病毒熒光定量PCR檢測(cè)用引物，其特征在于該引物的序列如下上游引物GGTGGAAGTGGAAGTGGAAA，下游引物TTTCCACTCGATTGGCTTGT。
7.家蠶濃核病毒熒光定量PCR檢測(cè)用探針，其特征在于該探針針對(duì)權(quán)利要求6所述引物擴(kuò)增的基因片段，探針的序列如下ROX-GGTGCAAGTAGAGGAGGTGC-Eclipse。
8.蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒的三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法， 其特征在于該方法包括以下的步驟1)樣本DNA提取選取感染病原體的家蠶材料O.2g，經(jīng)玻璃珠破碎法破碎，6000 r/ min, 20 s X 6次，使用DNA抽提試劑盒進(jìn)行DNA抽提，抽提后的DNA溶解在20 μ I水中；2)三重?zé)晒釶CR擴(kuò)增法對(duì)3種樣本的同步檢測(cè)蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒的引物和探針的序列如權(quán)利要求I 所示；三重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系如下10μ I Premix Ex Taq，各引物10 pmol/μ I均O. 13 μ 1， 各探針10 pmol/μ I均O. 27 μ 1，取上述提取的DNA液4 μ 1，蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒的DNA濃度分別為2. 5 ng/ μ 1，用水補(bǔ)足體積至20 μ I ;應(yīng)用熒光定量PCR儀Iightcycle 480進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?I) 95°C, 10 sec ； (2) 95°C,5 sec ；60°C,23 sec ；40 個(gè)循環(huán)；3)調(diào)用相應(yīng)熒光補(bǔ)償程序，進(jìn)行熒光補(bǔ)償，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定；一般認(rèn)為Ct值小于等于 35時(shí)，結(jié)果為陽(yáng)性，Ct值大于等于40時(shí)，結(jié)果為陰性，Ct值介于35-40時(shí)，需要進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，若仍介于35-40，則判斷為陽(yáng)性，若大于等于40則判斷為陰性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒的三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，其特征在于熒光補(bǔ)償反應(yīng)程序參照Roche說(shuō)明書(shū)，即(I) 95°C， 10 sec; (2) 95°C,5 sec ；60°C,23 sec ；40 個(gè)循環(huán)；(3) 95°C，10 sec ；40°C,30 sec ；95°C, continous ；40°C, I sec。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒的三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，其特征在于補(bǔ)償反應(yīng)時(shí)進(jìn)行單重?zé)晒夥磻?yīng)，單重?zé)晒夥磻?yīng)體系如下10 μ I Premix Ex Taq,權(quán)利要求I所述的上游、下游引物10 pmol/ μ I各O. 4 μ I,權(quán)利要求I所述的探針10 pmol/μ 1，0.8 μ 1，取DNA I μ 1，蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒的的DNA含量分別為2. 5 ng/μ 1，用水補(bǔ)足體積至20 μ I。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及家蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒的三重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法及試劑盒和引物、探針。本發(fā)明分別設(shè)計(jì)了各自的引物和探針，并在3個(gè)探針上標(biāo)記了不同的熒光信號(hào)，在優(yōu)化了PCR反應(yīng)體系的條件下，實(shí)現(xiàn)三重?zé)晒舛縋CR同步檢測(cè)蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒。不僅可實(shí)現(xiàn)DNA同步提取，也可以進(jìn)行熒光PCR同步檢測(cè)，大大簡(jiǎn)化了檢測(cè)方法，并通過(guò)熒光補(bǔ)償?shù)某绦颍行У叵艘驘晒庑盘?hào)的交集而引起的假陽(yáng)性。該方法能快速、特異和靈敏的一次性鑒別檢測(cè)蠶微孢子蟲(chóng)、家蠶核型多角體病毒和家蠶濃核病毒，可提高早期檢出率，有效防止疾病的傳播，減少經(jīng)濟(jì)損失。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102605106SQ20121008728
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月29日
發(fā)明者何永強(qiáng), 余招鋒, 吳珊, 帥江冰, 張曉峰, 戴云通, 李孝軍, 王素華, 許贏升, 魯興萌, 黎昊雁 申請(qǐng)人:浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院