專利名稱：一種運用大孔樹脂純化人參皂甙compound-K的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種運用大孔樹脂進行人參皂甙compoimd-κ原料藥制備的方法，所 用大孔吸附樹脂可以是弱極性或低極性樹脂。
背景技術：
人參阜試 compound-K [20_0_β -D-glucopyranosyl_20-(S)-protopanaxadiol
屬二醇型人參皂苷，但它不存在于天然的人參中，是其它二醇型人參皂苷在人腸道內(nèi)的主 要降解產(chǎn)物。早在1972年，日本學者Yasioka等在用土壤細菌降解二醇型人參皂苷Rbl、 Rb2和Rc混合物來鑒定真性苷元結構時就首次發(fā)現(xiàn)了 CK，并鑒定了結構(I.Yosooka et al. Chem. Pharm. Bull. 1972,20(11) =2418-2421)。通過將近十年的研究，人們發(fā)現(xiàn) CK 在 許多方面都體現(xiàn)了良好的生物活性，有些甚至還超過了現(xiàn)有的一線藥物，CK的藥用價值也 越來越受到重視，特別是在抗腫瘤、抗炎、抗過敏、保肝、神經(jīng)損傷修復等方面的活性異常突 出。(Steve Helms, ND. Alter Med Rev, 2004,9 :259_274· Shin Yffand Kim DH. J Pharmacol Sci，2005，99 :83-88· Choo MK,et al. Planta Med，2003，69 :518_522· Lee HU,et al. Liver Int，2005，25 :1069-1073. Jang S, et al. Neur Res，2004，29 :2257_2266.)由于人參皂甙compound-K在天然的人參中不存在，其CK只能由其他二醇型人參 皂甙轉化而來，且這種轉化只能通過溫和的生物轉化方法獲得，而常用的酸或堿水解方法 是行不通的。生物轉化方法通常包括酶轉化法和微生物發(fā)酵轉化法(Jang IS, et al. KR, 2003037005-A, [P].2003-5-12. Cho BG,et al. KR，2003043168-A，[P].2003-6-2. Hasegawa H,et al. Planta Med，1996，62 :453_457. Bae EA,et al. J Microbiol Biotechn,2003,13 9-14.)。中國專利(CN1570133A和CN101139562A)公開了運用霉菌發(fā)酵轉化三七總皂甙大 規(guī)模制備人參皂甙compound-K的方法。在CN1477205A和CN101139562A中，是利用大孔樹脂進行發(fā)酵液中目標產(chǎn)物的提 取，而對化合物的純化均是采用常規(guī)的硅膠柱分離，具體方法也僅在實施例中一筆帶過，未 有具體描述，且在其權利要求中也未提到利用大孔樹脂進行化合物分離純化。對于人參皂 甙compound K的純化收率和產(chǎn)品純度，本專利所用方法要遠高于上述方法。CN1570133A，大連輕工業(yè)學院學報(2003，22 167-169，人參稀有皂苷C-K的分離 與純化)，中草藥(2004，35 =986-988,酶轉化三七葉總皂苷制備人參皂苷C-K的工藝優(yōu)化) 均是采用純粹的硅膠柱進行人參皂甙compound K的分離純化，且需用到氯仿，甲醇，乙酸乙 酯等易揮發(fā)、易燃、高毒性有機溶劑，非常不適于工業(yè)化生產(chǎn)，與本專利所采用的大孔樹脂 純化工藝是完全不同的，是兩種不同的純化方法和理念，且本專利方法在規(guī)模化生產(chǎn)的可 操作性、安全性、生產(chǎn)成本等方面均大大優(yōu)于硅膠柱分離方法，最終產(chǎn)品純度和收率也是本 專利方法具有優(yōu)勢。但是到目前為止，用于人參皂甙compoimd-K純化的方法只有采用硅膠柱層析，以 氯仿、乙酸乙酯、甲醇等有機溶溶劑洗脫的報道，但該方法存在成本高(硅膠不能反復使 用，氯仿、乙酸乙酯等有機溶劑價格昂貴)、操作復雜(每次都要重新填硅膠柱，需采用多種有機溶劑，甚至梯度洗脫)，并需使用大量強毒性、易燃、易揮發(fā)的有機溶劑，非常不利于工 業(yè)化大生產(chǎn)，制約了人參皂甙compoimd-K的大規(guī)模生產(chǎn)，急需成本低，操作簡便的新方法 的出現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種運用大孔樹脂純化人參皂甙compoimd-K的新方法，可以簡便、 大量的獲取高純度人參皂甙compoimd-K，解決了現(xiàn)有工藝無法大規(guī)模應用的瓶頸問題。本發(fā)明涉及的人參皂甙compound-K具有如下結構 本發(fā)明所用的發(fā)酵液是根據(jù)中國專利(CN1570133A)實施例1中報道的方法所得。在本發(fā)明的具體實施方案中，公開了一種從微生物發(fā)酵液中制備人參皂甙 compoimd-K原料藥的方法，其特征在于將微生物發(fā)酵液乙醇提取液濃縮，脫色，加水稀釋， 大孔樹脂層析柱吸附，低濃度有機溶劑水溶液洗滌，除去色素及高極性皂甙，再以高濃度有 機溶劑水溶液洗脫得人參皂甙compoimd-K組分，最后通過結晶得到含量在96%以上的人 參皂甙compound-K原料藥。在進一步的實施方案中，首先用活性炭進行脫色，以通過HPLC含量分析得到的乙 醇液中人參皂甙compound-K的重量計，活性炭加入量為乙醇液中人參皂甙compound-K量 的0. 1 2倍，脫色溫度為10 80°C，脫色時間為20min 24小時。在進一步的實施方案中，乙醇提取液用水進行稀釋后進行大孔樹脂吸附，稀釋后 提取液的乙醇體積濃度為40% 80%。在上述實施方案中，所用大孔吸附樹脂是AB-8、D101、HP20、H41、HP60或者S80弱 極性或低極性大孔樹脂，或具有相同或相似性能的其他型號的大孔吸附樹脂。在上述實施方案中，洗脫所用有機溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮、正丙醇和異丙醇或 它們的混合物。在上述實施方案中，優(yōu)選低濃度有機溶劑水溶液指有機溶劑濃度小于55%。在上述實施方案中，優(yōu)選高濃度有機溶劑水溶液指有機溶劑濃度大于60%。在上述實施方案中，優(yōu)選結晶所用有機溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或它 們的混合物。在優(yōu)選的實施方案中，結晶所用有機溶劑水溶液的有機溶劑濃度為30% 100%。并且進一步優(yōu)選結晶溫度為4 40°C。
在本發(fā)明的一種具體實施方案中，所述方法包括將發(fā)酵液用濾布過濾，收集菌 體，加入與發(fā)酵液等體積的工業(yè)乙醇(一般工業(yè)乙醇濃度為95% )，在室溫下冷浸提取24 小時，提取過程要充分攪拌，將乙醇提取液在60°C減壓回收溶劑濃縮，濃縮液中加入相當于 人參皂甙compound-K 0. 1 2倍量的活性炭粉，在10 80°C溫度下脫色20min 24小 時，抽濾，濾液中加入蒸餾水稀釋至乙醇濃度為40% 80%，稀釋液上大孔樹脂柱吸附，先 用低于50%低濃度有機溶劑水溶液洗3個柱體積，可以除去大部分色素和Rd、Mx, F2等高 極性人參皂甙雜質，在用高于60%高濃度有機溶劑水溶液洗1. 5個柱體積，得到人參皂甙 compound-K,減壓蒸干得人參皂甙compound-K粗品，30 % 80 %有機溶劑水溶液中結晶即 得純度大于96%的人參皂甙compound-K原料藥成品。在上述實施方案中，進一步優(yōu)選大孔樹脂柱的徑高比為1 10，人參皂甙 compound-K成品純度96%以上，收率為72%。本專利方法在人參皂甙compound K純化方面，相比于現(xiàn)有方法，本專利具有可操 作性好，安全性高，成本低，收率及純度高等鮮明優(yōu)點，對人參皂甙compound K的規(guī)模化生 產(chǎn)將產(chǎn)生極大的推動作用。本發(fā)明的積極效果在于大孔樹脂可重復利用，并避免了強毒、 易燃有機溶劑的使用，工藝更為安全和環(huán)保；操作更加簡便，純化收率更高，成本只有硅膠 柱分離的五分之一，完全適于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式實施例1取發(fā)酵液PeiZhou, et al. CN200410018000. 0，CN1570133A[P]，實施例 150L， 濾布抽濾，得濕菌體6800g，50L工業(yè)乙醇冷浸并充分攪拌提取24小時，濾布抽濾，得乙醇提 取液，其中含人參皂甙compound-K 62. 5g。將該乙醇提取液減壓濃縮至2. 5L，加入65g活 化的活性炭粉，室溫脫色12小時，抽濾，收集濾液，加入2. 5L水稀釋得上樣液，以DlOl大 孔樹脂柱上樣吸附，柱體積為4L，人參皂甙compound-K吸附量約為15mg/ml濕樹脂，流速 lL/h。上樣結束，先用12L 50%乙醇水溶液洗脫，除去色素及雜質，然后以6L 80%乙醇水 溶液洗脫得人參皂甙compoimd-K組分，大孔樹脂柱以乙醇洗滌再生。減壓回收溶劑，得人 參皂甙compound-K粗品60g，加入600ml無水乙醇溶解，邊攪拌邊加入120ml水，室溫靜 置結晶12小時。抽濾，75%稀乙醇洗滌，干燥即得人參皂甙compound-K成品46. 5g，純度 為 96. 4%，收率 74%。數(shù)據(jù)與文獻報道一致(I. Yosooka et al. Chem. Pharm. Bull. 1972, 20(11) :2418-2421)，m. p. 162-164°C，[a]D22+43.1 ° (c = 0· 248，MeOH)。實施例2取發(fā)酵液100L，濾布抽濾，得濕菌體15kg，120L工業(yè)乙醇冷浸并充分攪拌提取24 小時，濾布抽濾，得乙醇提取液，其中含人參皂甙compoimd-KHOg。將該乙醇提取液減壓 濃縮至3L，加入14g活化的活性炭粉，回流脫色0. 5小時，抽濾，收集濾液，加入IL水稀釋 得上樣液，以HP41大孔樹脂柱上樣吸附，柱體積為7L，人參皂甙compoimd-K吸附量約為 20mg/ml濕樹脂，流速lL/h。上樣結束，先用20L 35%甲醇水溶液洗脫，除去色素及雜質， 然后以8L 75%甲醇水溶液洗脫得人參皂甙compound-K組分。減壓回收溶劑，得人參皂 甙compound-K粗品120g，加入1. 2L甲醇溶解，邊攪拌邊加入300ml水，15°C靜置結晶12 小時。抽濾，75%稀乙醇洗滌，干燥即得人參皂甙compound-K成品95. 6g，純度為96. 6%,收率 68.3%。數(shù)據(jù)與文獻報道一致(I. Yosooka et al. Chem. Pharm. Bull. 1972, 20 (11) 2418-2421)，m. p. 162-164°C，[a]D22+43.1° (c = 0· 248，MeOH)。實施例3取發(fā)酵液100L，濾布抽濾，得濕菌體15kg，120L工業(yè)乙醇冷浸并充分攪拌提取24 小時，濾布抽濾，得乙醇提取液，其中含人參皂甙compoimd-KHOg。將該乙醇提取液減壓濃 縮至3L，加入70g活化的活性炭粉，600C脫色1小時，抽濾，收集濾液，加入1. 5L水稀釋得上 樣液，以AB-8大孔樹脂柱上樣吸附，柱體積為7L，人參皂甙compoimd-K吸附量約為20mg/ ml濕樹脂，流速1.5L/h。上樣結束，先用20L 20%異丙醇水溶液洗脫，除去色素及雜質，然 后以8L 60%異丙醇水溶液洗脫得人參皂甙compoimd-K組分。減壓回收溶劑，得人參皂甙 compound-K粗品115g，加入2L丙酮溶解，邊攪拌邊加入2L水，4°C靜置結晶12小時。抽濾， 75%稀乙醇洗滌，干燥即得人參皂甙compound-K成品102g，純度為96. 1%，收率72.8%。 數(shù)據(jù)與文獻報道一致(I. Yosooka et al. Chem. Pharm. Bull. 1972,20(11) :2418_2421)， m. p. 162-164°C, [α ]D22+43. 1° (c = 0· 248，MeOH)。實施例4取發(fā)酵液500L，濾布抽濾，得濕菌體70kg，500L工業(yè)乙醇冷浸并充分攪拌提取24 小時，濾布抽濾，得乙醇提取液，其中含人參皂甙COmpOimd-K750g。將該乙醇提取液減壓濃 縮至12L，加入1.5kg活化的活性炭粉，60°C脫色20min，抽濾，收集濾液，加入18L水稀釋 得上樣液，以HP60大孔樹脂柱上樣吸附，柱體積為50L，人參皂甙compoimd-K吸附量約為 15mg/ml濕樹脂，流速3L/h。上樣結束，先用130L 30%正丙醇水溶液洗脫，除去色素及雜 質，然后以55L 60%正丙醇水溶液洗脫得人參皂甙compoimd-K組分。減壓回收溶劑，得人 參皂甙compoimd-K粗品690g，加入1. 5L甲醇加熱溶解，并加入2L乙酸乙酯，4°C靜置結晶 12小時。抽濾，75%稀乙醇洗滌，干燥即得人參皂甙compound-K成品580g，純度為97. 3%， 收率 77.3%。數(shù)據(jù)與文獻報道一致(I. Yosooka et al. Chem. Pharm. Bull. 1972, 20 (11) 2418-2421)，m. p. 162-164°C，[a]D22+43.1° (c = 0· 248，MeOH)。實施例5取發(fā)酵液500L，濾布抽濾，得濕菌體72kg，500L工業(yè)乙醇冷浸并充分攪拌提取24 小時，濾布抽濾，得乙醇提取液，其中含人參皂甙COmpOimd-K750g。將該乙醇提取液減壓濃 縮至12L，加入750g活化的活性炭粉，回流脫色0. 5小時，抽濾，收集濾液，加入3L水稀釋 得上樣液，以S80大孔樹脂柱上樣吸附，柱體積為50L，人參皂甙compoimd-K吸附量約為 15mg/ml濕樹脂，流速3L/h。上樣結束，先用150L 55%丙酮水溶液洗脫，除去色素及雜質， 然后以55L 65%丙酮水溶液洗脫得人參皂甙compoimd-K組分。減壓回收溶劑，得人參皂 甙compound-K粗品675g，加入12L無水乙醇加熱溶解，邊攪拌邊加入8L水，40°C靜置結晶 12小時。抽濾，75%稀乙醇洗滌，干燥即得人參皂甙compound-K成品592g，純度為96.4%， 收率 78.9%。數(shù)據(jù)與文獻報道一致(I. Yosooka et al. Chem. Pharm. Bull. 1972, 20 (11) 2418-2421)，m. p. 162-164°C，[a]D22+43.1° (c = 0· 248，MeOH)。實施例6取發(fā)酵液500L，濾布抽濾，得濕菌體72kg，500L工業(yè)乙醇冷浸并充分攪拌提取24 小時，濾布抽濾，得乙醇提取液，其中含人參皂甙COmpOimd-K750g。將該乙醇提取液減壓 濃縮至12L，加入750g活化的活性炭粉，40°C脫色5小時，抽濾，收集濾液，加入3L水稀釋得上樣液，以S80大孔樹脂柱上樣吸附，柱體積為50L，人參皂甙compoimd-K吸附量約為 15mg/ml濕樹脂，流速3L/h。上樣結束，先用150L 55%丙酮水溶液洗脫，除去色素及雜質， 然后以55L 65%丙酮水溶液洗脫得人參皂甙compoimd-K組分。減壓回收溶劑，得人參皂 甙compound-K粗品675g，加入6. 5L丙酮加熱溶解，邊攪拌邊加入9. 5L水，40°C靜置結晶 12小時。抽濾，75%稀乙醇洗滌，干燥即得人參皂甙compound-K成品605g，純度為97. 1 %， 收率 80.6%。數(shù)據(jù)與文獻報道一致(I. Yosooka et al. Chem. Pharm. Bull. 1972, 20 (11) 2418-2421)，m. p. 162-164°C，[a]D22+43.1° (c = 0· 248，MeOH)。實施例7取發(fā)酵液1噸，濾布抽濾，得濕菌體150kg，1噸工業(yè)乙醇冷浸并充分攪拌提取24 小時，濾布抽濾，得乙醇提取液，其中含人參皂甙compoimd-Kl. 3kg。將該乙醇提取液減壓 濃縮至30L，加入1. 5kg活化的活性炭粉，10°C脫色12小時，抽濾，收集濾液，加入30L水稀 釋得上樣液，以S80大孔樹脂柱上樣吸附，柱體積為65L，人參皂甙compoimd-K吸附量約為 20mg/ml濕樹脂，流速5L/h。上樣結束，先用190L 50%乙醇水溶液洗脫，除去色素及雜質， 然后以80L 85%乙醇水溶液洗脫得人參皂甙compound-K組分。減壓回收溶劑，得人參皂甙 compound-K粗品1. 1kg，加入5. 5L甲醇加熱溶解，4°C靜置結晶12小時。抽濾，75%稀乙醇 洗滌，干燥即得人參皂甙compound-K成品946g，純度為96. 8 %，收率72.7%。數(shù)據(jù)與文獻報 道一致(I. Yosooka et al. Chem. Pharm. Bull. 1972,20(11) :2418_2421)，m. p. 162_164°C， [a]D22+43. 1° (c = 0· 248，MeOH)。實施例8取發(fā)酵液1噸，濾布抽濾，得濕菌體145kg，1噸工業(yè)乙醇冷浸并充分攪拌提取24 小時，濾布抽濾，得乙醇提取液，其中含人參皂甙compoimd-Kl. 35kg。將該乙醇提取液減壓 濃縮至30L，加入Ikg活化的活性炭粉，室溫脫色12小時，抽濾，收集濾液，加入IOL水稀釋 得上樣液，以HP60大孔樹脂柱上樣吸附，柱體積為90L，人參皂甙compoimd-K吸附量約為 15mg/ml濕樹脂，流速5L/h。上樣結束，先用250L 30%正丙醇水溶液洗脫，除去色素及雜 質，然后以80L 75%正丙醇水溶液洗脫得人參皂甙compoimd-K組分。減壓回收溶劑，得人 參皂甙compound-K粗品1. 25kg，加入12. 5L乙醇加熱溶解，邊攪拌邊加入17. 5L水，37°C靜 置結晶12小時。抽濾，75%稀乙醇洗滌，干燥即得人參皂甙compoimd-K成品1. 1kg，純度 為 96. 7%，收率 81. 4%。數(shù)據(jù)與文獻報道一致(I. Yosooka et al. Chem. Pharm. Bull. 1972， 20(11) :2418-2421)，m. p. 162-164°C，[a]D22+43.1 ° (c = 0· 248，MeOH)。
權利要求
一種從微生物發(fā)酵液中制備人參皂甙compound K原料藥的方法，其特征在于將微生物發(fā)酵液乙醇提取液濃縮，活性炭脫色，加水稀釋，大孔樹脂層析柱吸附，低濃度有機溶劑水溶液洗脫，除去色素及高極性皂甙，再以高濃度有機溶劑水溶液洗脫得人參皂甙compound K組分，最后通過結晶得到含量在96％以上的人參皂甙compound K原料藥。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于，用活性炭對乙醇提取液進行脫色，以通過HPLC 含量分析得到的乙醇液中人參皂甙compoimd-K的重量計，活性炭加入量為乙醇液中人參 皂甙compound-K量的0. 1 2倍，脫色溫度為10 80°C，脫色時間為20min 24小時。
3.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于，乙醇提取液在濃縮，活性碳脫色，加水稀釋后， 提取液的乙醇濃度為40% 80%。
4.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于所用大孔吸附樹脂是AB-8、DlOUHP20、H41、 HP60或者S80等弱極性或低極性大孔樹脂，或具有相同或相似性能的其他型號的大孔吸附 樹脂。
5.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于洗脫所用有機溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮、正丙 醇和異丙醇或它們的混合物。
6.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于低濃度有機溶劑水溶液中的有機溶劑濃度小于 55%。
7.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于高濃度有機溶劑水溶液中的有機溶劑濃度大于 60%。
8.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于結晶所用有機溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮、乙酸 乙酯或它們的混合物。
9.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于結晶所用有機溶劑水溶液中的有機溶劑濃度為 30% 100%。
10.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于結晶溫度為4 40°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種運用大孔樹脂從微生物發(fā)酵菌體中分離純化人參皂甙compound-K，進行原料藥制備的方法。其中純化收率達到72％以上，產(chǎn)品中人參皂甙compound-K的含量高于96％。主要由以下步驟組成發(fā)酵菌體加入乙醇提取，濃縮，活性炭脫色，過濾；濾液加水稀釋后過大孔樹脂層析柱，低濃度有機溶劑水溶液洗滌除去色素及高極性皂甙，再以高濃度有機溶劑水溶液洗脫得人參皂甙compound-K組分，最后通過結晶即得含量在96％以上的人參皂甙compound-K原料藥。本發(fā)明可為人參皂甙compound-K的藥用開發(fā)提供大量合格原料藥樣品。
文檔編號C07J17/00GK101921304SQ20091014789
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月17日 優(yōu)先權日2009年6月17日
發(fā)明者史炳照, 周偉, 白驊, 袁留生 申請人:浙江海正藥業(yè)股份有限公司