專利名稱：一種免疫親和層析介質的制備方法及在純化河豚毒素中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物活性分子的分離純化領域，涉及一種層析材料，具體說是一種用于河豚毒素分離純化的免疫親和層析介質及其應用。
背景技術：
河豚毒素ktetrodotoxin，TIX)是一種毒性很強的小分子非蛋白類神經毒素，其可與神經細胞膜的鈉離子通道受體高度特異性的結合，從而阻斷鈉離子通道，抑制神經沖動的傳導。因此，河豚毒素具有出色的神經止痛作用，其麻醉效果比一般麻醉藥強1000倍以上，而且具有不成癮的優點，可取代化學藥物和中草藥用于戒毒。同時，它還具有鎮靜、抗心律失常、預防腎功能衰竭及降血壓等作用，因而具有很大的藥用開發價值。雖然河豚毒素具有極強的醫療效果，但其提取工藝極其復雜、純品的產量極低，目前只有美國、日本、中國等少數幾個國家有研究和生產的報道，而在國際市場上高純度的河豚毒素每克價格高達 18-20萬美金。目前在制備河豚毒素工藝中涉及到的分離純化方法主要有活性炭吸附法、大孔樹脂吸附層析、離子交換層析、凝膠層析等。此類方法如單獨使用都存在分離特異性差、回收率不高、產率較低等缺陷。通常是采用多種方法聯用的策略，但這同時又會帶來分離步驟過于繁瑣，目標產物損失過大，消耗大量洗脫試劑等新問題。另有報道利用超濾方法對河豚毒素進行純化的，但河豚毒素是一個分子量只有319道爾頓的小分子，使用超濾必須使用截留分子量小于500的超濾膜才能起到一定的分離效果，但仍難以將河豚毒素和分子量與之接近的鹽類很好的分離，同時超濾法對儀器設備要求極高。目前還有報道利用C18固相萃取小柱來純化河豚毒素，此方法分離步驟少，但C18固相萃取柱的介質對河豚毒素的分離特異性較低，分離到的河豚毒素達不到標準品純度，而且Cw固相萃取小柱價格高且每次處理量較少。因此，有必要對傳統的河豚毒素分離純化模式和工藝進行創新和改進。免疫親和層析(immune affinity chromatography, IAC)是一種利用抗體與抗原之間存在高度特異性的親和力而發生特異性、可逆性結合的原理，從多組分的混合物中分離特定抗原或抗體的一種層析技術。目前，該方法在抗體、激素、多肽及小分子化合物的分離純化和分析檢測中被廣泛應用。雖然免疫親和技術在上世紀80年代開始在分離純化領域得到逐步應用，但利用免疫親和層析來分離純化河豚毒素尚未見報道，更無商品化的河豚毒素免疫親和層析(介質)柱出售。

發明內容
本發明的目的是提供一種可用于河豚毒素分離純化的免疫親和層析介質。所述免疫親和介質是由經活化后的固相載體與河豚毒素特異性抗體偶聯而成。利用本發明所述免疫親和介質填料裝柱可制備成相應免疫親和色譜柱，用于河豚毒素的分離純化。1、河豚毒素免疫親和層析介質的制備。
本發明所述的免疫親和介質是由經活化的固相載體與河豚毒素特異性抗體偶聯而成。(1)先將固相載體經溴化氰法(CNBr )活化。(2)取河豚毒素特異性抗體與溶脹后的活化固相載體(濕凝膠)置于pH 6. 0-7. 5， 0. 1-0.5 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液中在室溫下振蕩偶聯，其中抗體與溶脹后的活化固相載體的質量比為1: 100。(3)將上述偶聯凝膠產物轉入其5-10倍體積的PH 6. 0-7. 5，含有0. 1-0. 5 mol/L 醋酸的Tris-HCl緩沖液中，室溫下振蕩反應2 h進行封閉；最后用5-10倍于封閉后凝膠體積的PH 6. 0-7. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液洗滌2-4次。本發明所述的固相載體可為交聯葡聚糖(S印hadex)、聚丙烯酰胺凝膠(BiO-Gel P)、交聯瓊脂糖(S印harose)、多孔玻璃等。優選為交聯瓊脂糖(S^harose CL-2B)。本發明所述的河豚毒素特異性抗體是通過河豚毒素與載體蛋白的偶聯物為免疫原來免疫動物得到的。其具體獲得有兩種途徑1、根據免疫學方法和程序自主制備；2、直接購買商品化河豚毒素特異性抗體。2、利用本發明所提供免疫親和層析介質制備成色譜柱用于河豚毒素純化的方法， 包括以下步驟。(1)含有河豚毒素的樣品前處理。(2)河豚毒素免疫親和層析柱的制備。將得到的免疫親和介質填充入固相萃取柱中，加入pH 6. 0-7. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液后自然沉降，制成河豚毒素特異性抗體免疫親和柱，于4°C保存待用。(3)上樣，將含河豚毒素樣品以每分鐘1-細1的流速通過預先用緩沖液平衡好的裝有上述免疫親和層析介質的層析柱。所說的緩沖液平衡免疫親和層析柱包括如下步驟 將PH6.0-7.0的緩沖液以每分鐘1-細1的流速通過裝有免疫親和層析介質的層析柱，用量為層析柱體積的3-10倍，通過紫外檢測保證層析柱己平衡至基線。(4)洗脫，然后用pH6. 0-7. 0的緩沖液清洗上樣后的免疫親和層析柱，再用pH為 4.5-6.5的洗脫液以每分鐘1-細1的流速將河豚毒素從層析柱上洗脫并收集洗脫峰，洗脫液的用量為層析柱體積的3-10倍。(5)收集洗脫液。本發明所述的河豚毒素純化方法步驟(3)、(4)中的pH6.0-7.0的緩沖液選自 PBS、Tris-HCl、醋酸-醋酸鈉緩沖液中的一種或兩種以上，所述的pH為4. 5-6. 5的洗脫液選自醋酸-醋酸納、檸檬酸-檸檬酸納緩沖液中的一種或兩種以上。該免疫親和介質以及由該免疫親和介質填料制備的色譜柱基于免疫反應和色譜反應，適合從樣品(河豚毒素發酵液，河豚內臟提取液)中富集、純化河豚毒素，便于樣品分析檢測和高純度精制。本發明的免疫親和層析介質具有高選擇性，對樣品中的河豚毒素有很強的保留和濃縮能力，只要加樣量不超過柱容量，在實測樣品條件下免疫親和吸附劑對組分的保留能力幾乎不受樣品體積或組分濃度的影響。本發明的方法水相操作，操作簡單， 純化效果好，免疫親和色譜柱能重復使用，能節省大量的溶劑，降低分析成本和環境污染。


圖1為經本發明的親和層柱純化后河豚毒素的高效液相(HPLC)色譜圖。圖2為經本發明的親和層柱純化后河豚毒素的質譜(MS)圖。
具體實施例方式本發明將通過以下實施例作進一步說明。實施例1 河豚毒素免疫親和層析柱的制備。其中，河豚毒素抗體購于上海雅吉生物科技有限公司，kphar0SeCL-2B購于上海銳谷生物科技有限公司，其他所需試劑購于廣東光華科技股份有限公司。(1)河豚毒素抗體及基質的預處理。將商品化的河豚毒素抗體置于pH 6.5,0. 1 mol/L醋酸-醋酸鈉偶聯緩沖液中透析過夜，稀釋至0. lmg/ml。稱取經溴化氰活化后的kpharose CL-2B凍干粉，于盛有lmmol/L HCL溶液的容器中充分溶脹得到一定體積的濕膠。用8倍以上濕膠體積的pH 6.5,0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉偶聯緩沖液快速洗滌2次，5000r/min離心2分鐘，將濕膠定容到20ml。(2)偶聯。將濕膠加入0. lmg/ml的抗體溶液中，使抗體與濕凝膠的質量比為1: 100，室溫振蕩I0h。偶聯反應結束后，用10倍偶聯膠體體積的偶聯緩沖液洗滌除去未偶聯的抗體，收集洗滌液。偶聯率計算公式偶聯率=(偶聯前抗體量-未偶聯抗體量)/偶聯前抗體量。經溴化氰活化后的kpharose CL-2B與河豚毒素抗體的偶聯率在90%以上。(3)封閉。將偶聯凝膠產物轉入其5-10倍體積的pH 6. 5的含有0. 1 mol/L醋酸的 Tris-HCl封閉緩沖液中混合，室溫下振蕩反應2 h封閉未偶聯的活化位點。(4)洗滌。凝膠用10倍體積的pH 6. 5醋酸-醋酸鈉緩沖液洗滌4次。(5)裝柱。將得到的偶聯有河豚毒素抗體的親和吸附劑填充入與其體積比為4:1的固相萃取柱里，制成偶聯有河豚毒素抗體的免疫親和層析柱，4°C保存備用。實施例2 利用免疫親和層析純化微生物源河豚毒素。(1)免疫親和層析柱采用實施例1制得的親和層析柱。(2)樣品前處理，河豚組織源樣品前處理河豚魚組織(卵巢，肝臟等)搗碎后經過 0. 1%醋酸水溶液浸泡煮沸lOmin，過濾除去殘渣，提取3次，合并澄清液，旋轉蒸發濃縮澄清液，經0.45 u m濾膜抽濾得到含河豚毒素的樣品。微生物源樣品前處理產河豚毒素的菌種發酵液經離心后(8000Xg，30min)收集上清液，用醋酸調pH 4_5，沸水浴lOmin，離心后收集上清液，旋轉蒸發10倍濃縮，經0.45 u m濾膜抽濾得到含河豚毒素的樣品。(3)上樣首先平衡柱子用0. lmol/L pH7. 0醋酸緩沖液以每分鐘Iml的流速通過裝有免疫親和層析介質的層析柱，用量為層析柱體積的5倍，通過紫外檢測保證層析柱己平衡至基線。將含河豚毒素樣品以每分鐘Iml的流速通過預先用緩沖液平衡好的親和層析柱。(4)清洗上樣完后，用0. lmol/L pH7. 0醋酸緩沖液以2ml/min的流速清洗層析柱，用量為柱體積的5倍，通過紫外檢測(205nm)以清洗至基線。(5)洗脫清洗至基線后，用PH 4. 5醋酸-醋酸納緩沖液以lml/min的流速洗脫柱上吸附的河豚毒素，收集洗脫峰，緩沖液用量為柱體積的5倍。( 6 )進行液相色譜分析。液相色譜條件分離柱Hypersil BOS C18，流動相A為超純水，流動相B為乙腈； 檢測波長為205nm，流速為0. 5ml/min，進樣量為20 ml，柱溫20°C。將上述(5)中收集的洗脫峰液以上述HPLC條件進行分析，所得色譜圖如附圖1所示。HPLC譜圖顯示只有一個吸收峰，并與報告的河豚毒素在此波段的吸收峰及保留時間相符，對峰積分峰面積達99%。由HPLC分析可知，利用實施例1所制備的親和層析柱分離純化微生物發酵液制備河豚毒素，可得到純度較高的河豚毒素。(6)進行質譜分析。質譜條件電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，噴霧電壓5.5KV，干燥氣流速8 L/m in，干燥氣溫度500°C，質量掃描范圍50- 400 m / ζ，分子離子m /ζ 320，二級碎片子離子m /z301. 6，為定量檢測離子；阱離子累積時間200 ms，最大累積電荷數50 000，二級碎裂電壓0. 80 Ampt。將經過本發明的免疫親和層析柱分離到的河豚毒素進行質譜檢測，所得質譜圖中有一個319. 92的分子離子峰(見附圖2)，即為河豚毒素的分子量，其他為碎片離子峰。說明此親和層析柱能特異性的用于河豚毒素的分離純化。
權利要求
1.一種免疫親和層析介質的制備方法，其特征是由固相載體和河豚毒素特異性抗體組成，包括以下步驟(1)先將固相載體經溴化氰法活化；(2)取河豚毒素特異性抗體與溶脹后的活化固相載體置于_6. 0-7. 5,0. 1-0. 5 mol/L 的醋酸-醋酸鈉緩沖液中在室溫下振蕩偶聯，其中抗體與溶脹后的活化固相載體的質量比為 1: 100 ；(3)將上述偶聯凝膠產物轉入其5-10倍體積的誠6.0-7. 5，含有0. 1-0. 5 mol/L醋酸的緩沖液中，室溫下振蕩反應2 h進行封閉；最后用5-10倍于封閉后凝膠體積的pH 6. 0-7. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液洗滌2-4次；所述的固相載體可為交聯葡聚糖、聚丙烯酰胺凝膠、交聯瓊脂糖或多孔玻璃等。
2.根據權利要求1所述的免疫親和層析介質的制備方法，其特征是固相載體為交聯瓊脂糖。
3.權利要求1所述的免疫親和層析介質的制備方法制備的免疫親和層析介質用于河豚毒素純化的方法，包括以下步驟(1)含有河豚毒素的樣品前處理；(2)河豚毒素免疫親和層析柱的制備將得到的免疫親和介質填充入固相萃取柱中，加入PH 6. 0-7. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液后自然沉降，制成河豚毒素特異性抗體免疫親和柱，于4°C保存待用；(3)上樣，將含河豚毒素樣品以每分鐘1-細1的流速通過預先用緩沖液平衡好的裝有上述免疫親和層析介質的層析柱；所說的緩沖液平衡免疫親和層析柱包括如下步驟將PH6. 0-7. 0的緩沖液以每分鐘 l-4ml的流速通過裝有免疫親和層析介質的層析柱，用量為層析柱體積的3-10倍，通過紫外檢測保證層析柱己平衡至基線；(4)洗脫，然后用pH6.0-7.0的緩沖液清洗上樣后的免疫親和層析柱，再用pH為 4.5-6.5的洗脫液以每分鐘1-細1的流速將河豚毒素從層析柱上洗脫并收集洗脫峰，洗脫液的用量為層析柱體積的3-10倍；(5)收集洗脫液；所述的河豚毒素純化方法步驟(3)、(4)中的pH6. 0-7. 0的緩沖液選自PBS、Tris-HCl、 醋酸-醋酸鈉緩沖液中的一種或兩種以上，所述的PH為4. 5-6. 5的洗脫液選自醋酸-醋酸納、檸檬酸-檸檬酸納緩沖液中的一種或兩種以上。
全文摘要
一種免疫親和層析介質的制備方法及在純化河豚毒素中的應用，免疫親和層析介質的制備包括固相載體溴化氰法活化；河豚毒素特異性抗體與溶脹后的活化固相載體偶聯；封閉；洗滌。所述的免疫親和層析介質用于河豚毒素純化的方法，包括含有河豚毒素的樣品前處理；河豚毒素免疫親和層析柱的制備；上樣；洗脫；收集洗脫液。本發明的免疫親和層析介質具有高選擇性，對樣品中的河豚毒素有很強的保留和濃縮能力，且水相操作，操作簡單，純化效果好，免疫親和色譜柱能重復使用，能節省大量的溶劑，降低分析成本和環境污染。
文檔編號C07K1/22GK102407098SQ20111036140
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者余勃, 陸豫, 馬春燕 申請人:南昌大學