專利名稱：一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法
技術領域：
本發明屬于醫藥技術領域，具體的是涉及一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法。
背景技術：
隨著現代分析測試技術的發展，人們發現越來越多的醫藥化合物具有手性結構特征，即具有相互呈鏡像但彼此不能重合的對映異構體；手性藥物的對映異構體通常表現出 不同的生理行為，具有不同甚至截然相反的藥效[J. Chromat. A，2001，906，3-33]。因此，研究開發具有光學純度的手性藥物已成為醫藥技術領域研究的重點和難點之一。制備具有光學純度的手性藥物需要依托不對稱合成和手性拆分技術，而關鍵在于設計和研制具有高立體選擇性的手性拆分劑。目前，優先結晶法、手性膜拆分法、色譜拆分法、酶拆分法等手性拆分技術已經廣泛應用于手性藥物對映體的研究和制備中[Anal. Chem. 2010,82,4712-4722]。然而現有的這些方法都難以實現單一對映體的高效制備，通常得到的都是不同對映體的混合物。因此，如何調控手性拆分劑以實現對手性藥物不同對映異構體的高效分子識別成為當今科學家們亟待研究的一個課題[Nature Materials，2003，2，272-278]。DNA作為生物體內儲存遺傳信息的重要物質，因其獨特的手性結構特征和分子識別特性，已成為材料和信息科學領域研究的熱點[Chirality，2007，19 :658-682 ；Science,2008，321，1795-1799]，特別是利用DNA分子組裝體為模板引導蛋白質、量子點、過渡金屬等構筑單元的準確定位，以形成多尺度結構特征的、功能化超分子組裝體[NatureNanotechnol. ,2006,1,190-194]。另一方面,從化學和生物學的角度,利用分子納米技術可以調控和設計具有特定組成和特定功能的DNA序列[Nature Reviews Genetics, 2006, 7,565-576 ；Angew. Chem. Int. Ed.，2007，46，6226-6236]，使其在手性藥物的選擇性合成與特異性識別方面顯露出誘人的應用前景。基于DNA 二級結構的多樣性和可調控性，以及堿基之間相互作用力弱等特點，利用小分子物質，特別是某些金屬離子，可以誘導DNA構型發生改變。這種誘導作用與金屬離子的類型和濃度、DNA序列的組成和長度以及溶液離子強度都有關系[Nucleic AcidsResearch, 2000，28，2439-2445]。例如，特定堿基組成的核酸序列在Ni2+或精氨的誘導下，其雙螺旋結構可以由B型向Z型轉變，這種手性結構以及表現出來的光譜特征的改變，為小分子藥物特異性識別提供了依據[J. Phys. Chem. B，2011，115，10182-10188 J. Am. Chem.Soc.，2009，131，2046-2047]。另外，金屬離子的加入，可以改變DNA序列與小分子藥物之間的結合作用，增大或減少DNA對藥物的結合能力[J. Fluoresc, 2011, 21,113-118]。到目前為止，利用特定的雙鏈寡核苷酸序列，通過金屬離子的誘導調控作用，對手性藥物對映體進行拆分還未曾報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法。
本發明的技術方案概述如下—種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在pH為5-9條件下，向50-4000體積份數的摩爾濃度為O. 025-lmmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液中加入I體積份數的摩爾濃度為O. 01-lmol/L的二價金屬離子無機鹽的水溶液，在10-40°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復合物溶液；(2)在與步驟⑴相同的pH條件下，將1-100體積份數的所述雙鏈寡核苷酸-金屬離子復合物溶液與I體積份數的摩爾濃度為O. 15-2mmol/L的手 性藥物溶液混合，吸附15-60分鐘；用截留分子量為1000-10000的超濾膜進行超濾，濾液為富集的手性藥物的一種對映異構體溶液，雙鏈寡核苷酸-金屬離子復合物上的吸附物為富集的手性藥物的另一種對映異構體。步驟⑴優選為在pH為5-9條件下，向100-1000體積份數的摩爾濃度為O. 05-0. 5mmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液中加入I體積份數的摩爾濃度為O. 05-0. 5mol/L的二價金屬離子無機鹽的水溶液，在20-30°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復合物溶液。所述雙鏈寡核苷酸為優選為序列[(dG-dC)n]2或[(dA-dT)丄，η為I 0-400。所述步驟(I)中所述雙鏈寡核苷酸溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液或二甲胂酸鹽緩沖液。所述步驟(I)中所述二價金屬離子為銅離子、鎳離子、錳離子、鎂離子、鈣離子、鋅離子、鋇離子或鈷離子，所述無機鹽為鹽酸鹽、硝酸鹽或硫酸鹽。所述步驟(2)為在與步驟(I)相同的pH條件下，將4-40體積份數的所述雙鏈寡核苷酸-金屬離子復合物溶液與I體積份數的摩爾濃度為O. 25-lmmol/L的手性藥物溶液混合，吸附20-40分鐘；用截留分子量為3000-8000的超濾膜進行超濾，濾液為富集的手性藥物的一種對映異構體溶液，雙鏈寡核苷酸-金屬離子復合物上的吸附物為富集的手性藥物的另一種對映異構體。所述手性藥物為氧氟沙星、布洛芬、華法林、萘普生、酮洛芬、氟比洛芬、西酞普蘭或普萘洛爾。所述步驟(2)中所述手性藥物溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液或二甲胂酸鹽緩沖液。本發明的優點本方法利用生物相容性好的雙鏈寡核苷酸實現簡便、安全的手性藥物拆分，是一種綠色、清潔的手性藥物對映異構體拆分新方法。
具體實施例方式下面的實施例是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發明，但不對本發明作任何限制。實施例I一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在 pH = 7. 2 下，向 1000 μ L 摩爾濃度為 O. 05mmol/L 的[(dG_dC)20]2 溶液中力口入I μ L的摩爾濃度為O. lmol/L的氯化銅水溶液，在20°C混合均勻，得到[(dG_dC) 2(|]2-銅離子復合物溶液；[(dG-dC)2J2溶液的溶劑為磷酸鈉緩沖液；(2)在pH = 7. 2下，將400 μ L步驟(I)制備的[(dG_dC) J2-銅離子復合物溶液與100 μ L摩爾濃度為O. 5mmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合,吸附20分鐘，外消旋氧氟沙星溶液的溶劑為磷酸鈉緩沖液；然后將混合溶液裝入到截留分子量為3000的超濾離心管中，在8000rpm下離心20分鐘，濾液為富集的氧氟沙星的一種對映異構體溶液，[(dG-dC) J2-銅離子復合物上的吸附物為富集的氧氟沙星的另一種對映異構體。濾液中氧氟沙星的對映體過量值為9. 08%。將上述濾液經過步驟(2)重復處理三次后，最終濾液中氧氟沙星的對映體過量值達到35. 19%。
實驗證明，用本實施例的方法也可用于拆分布洛芬、華法林、萘普生、酮洛芬或氟比洛芬。實施例2一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在 pH = 8. 5 下，向 1000 μ L 摩爾濃度為 O. 05mmol/L 的[(dG_dC) 10]2 溶液中力口AlOyL的摩爾濃度為O. 5mol/L的硫酸鋅水溶液，在20°C混合均勻，得到[(dG_dC) 10]2-鋅離子復合物溶液；[(dG-dC) 10]2溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液。(2)在pH = 8. 5下，將400 μ L步驟(I)制備的[(dG_dC) 1(|]2-鋅離子復合物溶液與10 μ L摩爾濃度為2mmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合，吸附40分鐘，氧氟沙星溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；然后將混合溶液裝入到截留分子量為1000的超濾離心管中，在8000rpm下離心20分鐘，濾液為富集的氧氟沙星的一種對映異構體溶液，[(dG_dC) 10]2-鋅離子復合物上的吸附物為富集的氧氟沙星的另一種對映異構體。濾液中氧氟沙星的對映體過量值為10. 54%。將上述濾液經過步驟(2)重復處理三次后，最終濾液中氧氟沙星的對映體過量值達到40. 11%。實驗證明，本實施例的方法也可用于拆分布洛芬、華法林、萘普生、酮洛芬氟或比洛芬。實施例3一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在 PH = 8. 5 下，向 1000 μ L 摩爾濃度為 O. 025mmol/L 的[(dA-dT) 400]2 溶液中加入20yL的摩爾濃度為O. 05mol/L的硝酸鎂水溶液，在30°C混合均勻，得到[(dA-dT)4J2-鎂離子復合物溶液；[(dA-dT)4J2溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液。(2)在pH = 8. 5下，將400 μ L步驟(I)制備的[(dA_dT)4J2-鎂離子復合物溶液與400 μ L摩爾濃度為O. 15mmol/L的外消旋布洛芬溶液混合，吸附15分鐘，布洛芬溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；然后將混合溶液通過截留分子量為10000的超濾膜，濾液為富集的布洛芬的一種對映異構體溶液，[(dA-dT)4J2-鎂離子復合物上的吸附物為富集的布洛芬的另一種對映異構體。濾液中布洛芬的對映體過量值為9. 81%。將上述濾液經過步驟
(2)重復處理三次后，最終濾液中布洛芬的對映體過量值達到33.04%。實驗證明，本實施例的方法也可用于拆分氧氟沙星、酮洛芬、氟比洛芬或西酞普
ΛΑ
~O實施例4一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟
(I)在 pH = 5. 0 下，向 4000ii L 摩爾濃度為 0. 5mmol/L 的[(dG_dC)20]2 溶液中力口AluL的摩爾濃度為lmol/L的硝酸鎳水溶液，在15°C混合均勻，得到[(dG-dC)2J2-鎳離子復合物溶液；[(dG-dC)20]2溶液的溶劑為MES緩沖液；(2)在pH = 5.0下，將IOOOii L步驟(I)制備的[(dG_dC)2Q]2-鎳離子復合物溶液與100 u L摩爾濃度為lmmol/L的外消旋華法林溶液混合，吸附30分鐘，華法林溶液的溶劑為MES緩沖液；然后將混合溶液裝入到截留分子量為3000的超濾離心管中，在8000rpm下離心20分鐘，濾液為富集的華法林的一種對映異構體溶液，[(dG-dC)2J2-鎳離子復合物上的吸附物為富集的華法林的另一種對映異構體。濾液中華法林的對映體過量值為7.88%。將上述濾液經過步驟(2)重復處理三次后，最終濾液中華法林的對映體過量值達到 27. 21%。實驗證明，本實施例的方法也可用于拆分氧氟沙星、酮洛芬、氟比洛芬、西酞普蘭或普萘洛爾。 實施例5一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在pH = 5. 8下，向IOOOii L摩爾濃度為lmmol/L的[(dG_dC)丨J2溶液中加入I U L的摩爾濃度為0. 01mol/L的氯化錳水溶液，在10°C混合均勻，得到[(dG_dC) i J2-錳離子復合物溶液；[(dG-dC) 100]2溶液的溶劑為二甲胂酸鈉緩沖液。(2)在pH = 5. 8下，將500 U L步驟(I)制備的[(dG_dC) 100]2_錳離子復合物溶液與500 ii L摩爾濃度為lmmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合,吸附30分鐘,氧氟沙星溶液的溶劑為二甲胂酸鈉緩沖液；然后將混合溶液通過截留分子量為8000的超濾膜，濾液為富集的氧氟沙星的一種對映異構體溶液，[(dG-dC) 1(J2-錳離子復合物上的吸附物為富集的氧氟沙星的另一種對映異構體。濾液中氧氟沙星的對映體過量值為12.31%。將上述濾液經過步驟(2)重復處理三次后，最終濾液中氧氟沙星的對映體過量值達到34. 79%。實驗證明，本實施例的方法也可用于拆分氧氟沙星、酮洛芬、氟比洛芬、西酞普蘭或普萘洛爾。實施例6—種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在 pH = 8.0 下，向 IOOOii L 摩爾濃度為 0. lmmol/L 的[(dG_dC) 400]2 溶液中力口入IOii L的摩爾濃度為0. 3mol/L的硝酸鋇水溶液，在40°C混合均勻，得到[(dG_dC)4J2-鋇離子復合物溶液；[(dG-dC) 4(J2溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液。(2)在pH = 8.0下，將500 ii L步驟(I)制備的[(dG_dC)4J2-鋇離子復合物溶液與500 ii L摩爾濃度為lmmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合,吸附30分鐘,氧氟沙星溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；然后將混合溶液通過截留分子量為10000的超濾膜，濾液為富集的氧氟沙星的一種對映異構體溶液，[(dG-dC) 4 J 2-鋇離子復合物上的吸附物為富集的氧氟沙星的另一種對映異構體。濾液中氧氟沙星的對映體過量值為11.45%。將上述濾液按步驟(2)重復處理三次后,最終濾液中氧氟沙星的對映體過量值達到32. 25%。實驗證明，本實施例的方法也可用于拆分布洛芬、華法林、萘普生、酮洛芬或氟比洛芬。實施例7
一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(1)在？11 = 9.0下，向10001^摩爾濃度為0.05臟01/1的(dA_dT) J2溶液中加A5uL的摩爾濃度為0. 05mol/L的硝酸鈣水溶液，在20°C混合均勻，得到[(dA_dT) 10]2-鈣離子復合物溶液；[(dA-dT) 10]2溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液。(2)在pH = 9. 0下，將500 u L步驟(I)制備的[(dA_dT) 1(|]2-鈣離子復合物溶液與500 ii L摩爾濃度為0. 25mmol/L的外消旋布洛芬溶液混合，吸附60分鐘，布洛芬溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；然后將混合溶液裝入到截留分子量為1000的超濾離心管中，在8000rpm下離心20分鐘，濾液為富集的布洛芬的一種對映異構體溶液，[(dA_dT) 10]2-鈣離子復合物上的吸附物為富集的布洛芬的另一種對映異構體。濾液中布洛芬的對映體過量值為6. 50%。將上述濾液經過步驟(2)重復處理三次后，最終濾液中布洛芬的對映體過量值達到 18. 79%。實驗證明，本實施例的方法也可用于拆分氧氟沙星、華法林、萘普生、酮洛芬或氟比洛芬。實施例8一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在pH =7. 2下，向1000^摩爾濃度為0.05臟01/1的[(dG_dC): J2溶液中力口入L的摩爾濃度為0. 05mol/L的氯化鈷水溶液，在35°C混合均勻，得到[(dG_dC) i J2-鈷離子復合物溶液；[(dG-dC) 100]2溶液的溶劑為HEPES緩沖液。(2)在pH = 7. 2下，將1000 ii L步驟(I)制備的[(dG_dC): J2-鈷離子復合物溶液與10 ii L摩爾濃度為2mmol/L的外消旋氟比洛芬溶液混合,吸附40分鐘,氟比洛芬溶液的溶劑為JEPES緩沖液；然后將混合溶液通過截留分子量為8000的超濾膜，濾液為富集的 氟比洛芬的一種對映異構體溶液，[(dG-dC) 1(J2-鈷離子復合物上的吸附物為富集的氟比洛芬的另一種對映異構體。濾液中布洛芬的對映體過量值為15.26%。將上述濾液經過步驟(2)重復處理三次后,最終濾液中氟比洛芬的對映體過量值達到40. 01%。實驗證明，本實施例的方法也可用于拆分布氧氟沙星、布洛芬、萘普生、酮洛芬或普洛萘爾。
權利要求
1.ー種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，其特征包括如下步驟 (1)在pH為5-9條件下，向50-4000體積份數的摩爾濃度為O.025-lmmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液中加入I體積份數的摩爾濃度為O. 01-lmol/L的ニ價金屬離子無機鹽的水溶液，在10-40°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復合物溶液； (2)在與步驟(I)相同的pH條件下，將1-100體積份數的所述雙鏈寡核苷酸-金屬離子復合物溶液與I體積份數的摩爾濃度為O. 15-2mmol/L的手性藥物溶液混合，吸附15-60分鐘；用截留分子量為1000-10000的超濾膜進行超濾，濾液為富集的手性藥物的一種對映異構體溶液，雙鏈寡核苷酸-金屬離子復合物上的吸附物為富集的手性藥物的另ー種對映 異構體。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征是所述步驟(I)為在pH為5-9條件下，向100-1000體積份數的摩爾濃度為O. 05-0. 5mmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液中加入I體積份數的摩爾濃度為O. 05-0. 5mol/L的ニ價金屬離子無機鹽的水溶液，在20_30°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復合物溶液。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特征是所述雙鏈寡核苷酸為序列[(dG-dC)n]2或[(dA-dT)n]2, η 為 10-400。
4.根據權利要求I或2所述的方法，其特征是所述步驟(I)中所述雙鏈寡核苷酸溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液或ニ甲胂酸鹽緩沖液。
5.根據權利要求I或2所述的方法，其特征是所述步驟(I)中所述ニ價金屬離子為銅離子、鎳離子、錳離子、鎂離子、鈣離子、鋅離子、鋇離子或鈷離子，所述無機鹽為鹽酸鹽、硝酸鹽或硫酸鹽。
6.根據權利要求I所述的方法，其特征是所述步驟(2)為在與步驟⑴相同的pH條件下，將4-40體積份數的所述雙鏈寡核苷酸-金屬離子復合物溶液與I體積份數的摩爾濃度為O. 25-lmmol/L的手性藥物溶液混合，吸附20-40分鐘；用截留分子量為3000-8000的超濾膜進行超濾，濾液為富集的手性藥物的一種對映異構體溶液，雙鏈寡核苷酸-金屬離子復合物上的吸附物為富集的手性藥物的另ー種對映異構體。
7.根據權利要求I或6所述的方法，其特征是所述手性藥物為氧氟沙星、布洛芬、華法林、萘普生、酮洛芬、氟比洛芬、西酞普蘭或普萘洛爾。
8.根據權利要求I或6所述的方法，其特征是所述步驟(2)中所述手性藥物溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液或ニ甲胂酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發明公開了一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(1)在pH為5-9條件下，向雙鏈寡核苷酸溶液中加入二價金屬離子無機鹽的水溶液，混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復合物溶液；(2)在與步驟(1)相同的pH條件下，將雙鏈寡核苷酸-金屬離子復合物溶液與手性藥物溶液混合，吸附；用截留分子量為1000-10000的超濾膜進行超濾，濾液為富集的手性藥物的一種對映異構體溶液，雙鏈寡核苷酸-金屬離子復合物上的吸附物為富集的手性藥物的另一種對映異構體。本方法利用生物相容性好的雙鏈寡核苷酸實現簡便、安全的手性藥物拆分，是一種綠色、清潔的手性藥物對映異構體拆分新方法。
文檔編號C07C57/30GK102633583SQ201210063929
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月12日 優先權日2012年3月12日
發明者付雁, 張金利, 李韡, 段小麗, 陳雄飛 申請人:天津大學