用于pcr系統的新型去污劑的設計和開發的制作方法
【專利摘要】本公開涉及用于多種方法包括例如核酸擴增反應例如聚合酶鏈式反應(PCR)的新型去污劑。還描述了用于制備改性去污劑的方法。
【專利說明】用于PCR系統的新型去污劑的設計和開發
[0001]與相關申請的交叉參考
[0002]本申請在35U.S.C.§ 119(e)下要求2011年6月8日提交的標題為"Design andDevelopment of Novel Detergents for Use in PCR Systems"的美國臨時專利申請N0.61/494，812 (將其公開內容通過引用以其全部并入本文)的權益。
[0003]領域
[0004]本公開涉及用于多種方法包括例如核酸擴增反應，例如聚合酶鏈式反應(PCR)的改性去污劑。還描述了用于制備改性去污劑的方法。
[0005]背景
[0006]許多廣為人知的重組DNA技術涉及復制或聚合和/或擴增DNA。一個此種實例是聚合酶鏈式反應(PCR)。在PCR過程中，在熱穩定DNA聚合酶存在時在兩個溫度低溫與高溫(例如，55°C與95°C)之間重復地循環反應。在反應過程中在高溫下花費的總時間取決于循環的總數、每一個循環的高溫步驟的持續時間和斜坡速度(ramp speed)(即，熱循環儀從一個溫度變成另一個溫度的速度)。雖然用于PCR的DNA聚合酶是高度熱穩定的，但它們傾向于在高溫下隨時間變得失活。此外，這些聚合酶還可因被引入具有次優濃度的輔因子，或具有次優的PH水平，或包括化學或生物抑制劑的存在的反應混合物環境而變得失活。
[0007]在這種條件下穩定酶的一種方式是添加穩定劑例如表面活性劑。表面活性劑例如去污劑是表面活性化合物，其穩定酶的活性形式與其液體環境之間的界面。例如，通過添加非離子型去污劑例如NP-40或TTween? 20穩定了 Taq DNA聚合酶的活性(Bachmann,等ANuc.Acids Res.18(5):1309(1990))。然而,在一些應用中，Tweeij.20-穩定化的 DNA聚合酶具有低的擴增效率或導致非特異性產物的擴增。
[0008]此外，一些去污劑需要高的濃度。此外，還已知一些去污劑(例如，NP-40)具有毒性。因此存在對改善熱穩定DNA聚合酶在溶液中的穩定性的去污劑、特別是改善酶穩定性而不賦予目前使用的去污劑的任何弊端的去污劑的需要。
[0009]附圖概述
[0010]本申請中顯示的所有擴增曲線圖解地將核酸擴增表示為作為循環次數(X-軸)的函數的ARn(y_軸)。
[0011]圖1.使用根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案擴增的IKb和3Kb PCR產物進行的不同濃度的新型去污劑Dtl和Dt2的滴定。
[0012]圖2.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案，在新型去污劑Dtl和Dt2存在時進行的視紫紅質基因的擴增。
[0013]圖3.對于根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案擴增的0.1-1Kb PCR 產物，對 0.004% 和 0.0002% 的新型去污劑 Dt2 相較于NP- 40/Tween? 20進行的比較。
[0014]圖4.對于根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案擴增的l_2KbPCR產物，對0.004%和0.002%的新型去污劑Dt2相較于Mp.40/T\veen ° 20進行的比較。
[0015]圖5.PCR活性:對于根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案擴增的視紫紅質基因產物進行的新型去污劑Dt2與單獨的Brij-58的比較。
[0016]圖6.使用根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案擴增的Rhod-1043靶序列進行的新型去污劑Dt2和Dt4的滴定。
[0017]圖7.Dt4與Tween? 20的比較:根據本文中公開的方法和組合物的某些示例
性實施方案進行的β-2微球蛋白(Β2Μ)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、大核糖體蛋白(RPLPO)和葡糖醛酸酶β (⑶SB)的擴增。
[0018]圖8.Dt4與1'veC 20(對數標度)的比較:根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的B2M、GAPDH、RPLPO和⑶SB的擴增。
[0019]圖9.Dt4與Tween.20的比較:根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案，通過Cq表示的不同PCR產物的擴增效率。
[0020]圖10.Dtl、Dt3、Dt5、Dt6和Dt7與TweeiZ 20的比較:根據本文中公開的方法
和組合物的某些示例性實施方案進行的擴增。
[0021]圖11.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的比較Dt4與Brij-58和T-ein? 20 (每一種的0.001%和0.0008%)的活性的次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRTl)的擴增反應的擴增曲線。
[0022]圖12.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的比較Dt4與Brij-58和Tween |i: 20 (每一種的0.0006%和0.0004%)的活性的HPRTl的擴增反應的擴
增曲線。
[0023]圖13.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的比較Dt4與Brij-58和Tween- 20(每一種的0.001%和0.0008%)的活性的肽基脯氨酰異構酶A(PPIA)的擴增反應的擴增曲線。
[0024]圖14.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的比較Dt4與Brij-58和Tweene 20 (每一種的0.0006%和0.0004%)的活性的PPIA的擴增反應的擴
增曲線。
[0025]圖15.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的比較Dt4與Brij-58和Tween 20 (每一種的0.0002%和0.0001%)的活性的PPIA的擴增反應的擴
增曲線。
[0026]圖16.根據本文中 公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的比較ο.002%Dt4與0.01%和Tween? 20的活性的B2M的擴增反應的擴增曲線。
[0027]圖17.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的比較0.002%Dt4與0.01%和Τννθ?、Η? 20的活性的GAPDH的擴增反應的擴增曲線。
[0028]圖18.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的比較0.002%Dt4與ο.01%和Tween? 20的活性的rplpo的擴增反應的擴增曲線。
[0029]圖19.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案，在兩個月中以約I周的間隔進行的顯示聚合酶在5X緩沖液中的穩定性的擴增反應(Cq) (ACTB(肌動蛋白-β )、GAPDH、PPIA和RPLPO的擴增反應)的圖示。
[0030]圖20.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案，在兩個月中以約I周的間隔進行的顯示聚合酶在5X緩沖液中的穩定性的擴增反應(δ Rn) (ACTB(肌動蛋白-β )、GAPDH、PPIA和RPLPO的擴增反應)的圖示。
[0031]圖21.兩個不同的 Dt4 批次與 Tween? 20 (Cq, RPLPO、ACTB、PPIA、GAPDH、
PGKl (磷酸甘油酸酯激酶I)、B2M、⑶SB和HPRTl的擴增反應)的比較。根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案，在兩個月中以約I周的間隔進行的顯示聚合酶在5X緩沖液中的穩定性的擴增反應(Cq) (ACTB (肌動蛋白-β )、GAPDH、PPIA和RPLPO的擴增反應)的圖示。
[0032]圖22.兩個不同的 Dt4 批次與 Tween? 20 ( δ Rn, RPLPO、ACTB、PPIA、GAPDH、
PGKl (磷酸甘油酸酯激酶I)、B2M、⑶SB和HPRTl的擴增反應)的比較。根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案，在兩個月中以約I周的間隔進行的顯示聚合酶在5X緩沖液中的穩定性的擴增反應(Cq) (ACTB (肌動蛋白-β )、GAPDH、PPIA和RPLPO的擴增反應)的圖示。
[0033]圖23.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的多種TaqMan.測定間的Dt4擴增的比較。
[0034]概述
[0035]本文中提供了用于多種用途(包括但不限于核酸擴增反應)的改性去污劑。在一些實施方案中，提供了通過化學修飾簡單起始材料而合成的離子型和兩性離子型去污劑。觀察了所有中間產物并且使用LC-MS分析對其進行了分析，隨后沒有純化而使用。在一些實施方案中，提供了新型去污劑例如Dt4(下文中描述的)。這類新型去污劑可用于多種方法，包括例如核酸擴增反應例如聚合酶鏈式反應(PCR)。
[0036]在某些實施方案中，所述改性去污劑具有下列結構式:
[0037]
【權利要求】
1.式I的化合物:

2.權利要求1的化合物，其中: R1是(C8-C16)烷基或(C8-C16)取代的烷基； R2和R3各自獨立地為H或CH3 ; R4和R5各自獨立地為H、(CH2)nNH, (CH2)nN,或者，R4與R5 —起形成任選地被至少一個(C1-C30)烷基、(C1-C3tl)取代的烷基、(C1-C3tl)雜烷基、(C1-C3tl)取代的雜烷基取代的5-或6_兀環；和 每一個 η 獨立地是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30。
3.權利要求1的化合物，其中所述化合物選自:
4.一種包含聚合酶和至少一種式I的化合物的組合物:
5.權利要求4的組合物，其中: R1是(C8-C16)烷基或(C8-C16)取代的烷基； R2和R3各自獨立地為H或CH3 ; R4和R5各自獨立地為H、(CH2)nNH, (CH2)nN,或者，R4與R5 —起形成任選地被至少一個(C1-C30)烷基、(C1-C3tl)取代的烷基、(C1-C3tl)雜烷基、(C1-C3tl)取代的雜烷基取代的5-或6_兀環；和每一個 η 獨立地是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、`23、24、25、26、27、28、29 或 30。
6.權利要求4的組合物，其中所述化合物選自:
7.權利要求4的組合物，其中所述聚合酶是熱穩定的。
8.包括儲備或反應組合物的試劑盒，所述組合物包含聚合酶和至少一種式I的化合物:
9.權利要求8的試劑盒，其中: R1是(C8-C16)烷基或(C8-C16)取代的烷基； R2和R3各自獨立地為H或CH3 ; R4和R5各自獨立地為H、(CH2)nNH, (CH2)nN,或者，R4與R5 —起形成任選地被至少一個(C1-C30)烷基、(C1-C3tl)取代的烷基、(C1-C3tl)雜烷基、(C1-C3tl)取代的雜烷基取代的5-或6_兀環；和 每一個 η 獨立地是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、.21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30。
10.權利要求8的試劑盒，其中所述化合物選自:
11.權利要求8的試劑盒，其中所述聚合酶是熱穩定的。
12.試劑盒，其包含含有聚合酶和至少一種權利要求1的化合物的組合物。
13.試劑盒，其包含含有聚合酶和至少一種權利要求3的化合物的組合物。
14.用于增加聚合酶的效率的方法，所述方法包括下列步驟: a)將靶核酸與至少一種聚合酶、至少一種引物、dNTP和至少一種權利要求1的化合物混合；b)擴增所述靶核酸。
15.權利要求14的方法，其中所述增加的效率與當聚合酶在NP-40或Tween?20而非所述化合物存在時的效率相同。
16.權利要求14的方法，其中所述增加的效率比當聚合酶在NP-40或！1-?...20而非所述化合物存在時的效率更大。
17.權利要求14的方法，其中所述去污劑的有效濃度為至少一倍至十倍更少于常規去污劑所需的濃度。
18.權利要求17的方法，其中所述常規去污劑是NP-40或Tween?20。
19.權利要求17或18的方法，其中所述去污劑在5X緩沖液中至少2個月是穩定的。
20.用于檢測樣品中的靶核酸的方法，所述方法包括下述步驟: a)形成反應混合物,其包含至少一種聚合酶、至少一種引物、dNTP、至少一種權利要求1的化合物和可檢測標記； b)擴增所述靶核酸；和 c)檢測從所述可檢測標記產生的指示所述靶核酸在所述樣品中的存在和/或量的信號。
21.用于在熱循環過程中抑制聚合酶的失活的方法，所述方法包括在熱循環過程中使所述聚合酶與權利要求1的化合物接觸。
22.權利要求21的方法，其中所述聚合酶失活的抑制與當聚合酶在NP-40或Tween? 20而非所述化合物存在時的聚合酶失活的抑制相同。
23.權利要求21的方法，其中所述聚合酶失活的抑制比當聚合酶在NP-40或Tween? 20而非所述化合物存在時聚合酶失活的抑制更大。
24.一種方法，其包括組合具有聚合酶活性的酶和權利要求1的化合物以在使所述酶的所述聚合酶活性穩定化的條件下形成混合物。
25.權利要求24的方法，其中所述穩定化與當聚合酶在NP-40或TTweeJ1.20而非所述化合物存在時聚合酶活性的穩定化相同。
26.權利要求24的方法，其中所述穩定化大于當聚合酶在NP-40或Tween?20而非所述化合物存在時的聚合酶活性的穩定化。
27.權利要求14-26的任一項的方法，其中所述聚合酶是熱穩定的。
28.一種核酸擴增反應混合物，其包含: a)至少一種聚合酶；
b)dNTP ;和 c)至少一種權利要求1的化合物。
29.權利要求28的反應混合物，其中所述聚合酶是熱穩定的。
30.一種用于聚合靶核酸的方法，其包括下述步驟: a)使所述靶核酸與反應混 合物中的至少一種聚合酶和至少一種權利要求1的化合物組合；和b)聚合所述靶核酸。
31.一種用于聚合靶核酸的方法，其包括下述步驟: a)使所述靶核酸與反應混合物中的至少一種聚合酶和至少一種權利要求3的化合物組合；和 b)聚合所述靶核酸。
32.一種用于擴增靶核酸的方法，其包括下述步驟: a)使所述靶核酸與作為反應混合物的一部分的至少一種聚合酶和至少一種權利要求1的化合物組合；和 b)聚合所述靶核酸。
33.一種用于擴增靶核酸的方法，其包括下述步驟: a)使所述靶核酸與作為反應混合物的一部分的至少一種聚合酶和至少一種權利要求3的化合物組合；和 b)聚合所述靶核酸。
34.權利要求30-33的任一項的方法，其中所述反應混合物還包含至少一種核酸引物和 dNTP。
35.權利要求30-33的任一項的方法，其中檢測所述靶核酸的聚合或擴增。
36.權利要求35的方法，其中使用可檢測標記來檢測所述靶核酸的聚合或擴增。
37.權利要求36的方法，其中所述可檢測標記是引物或探針的一部分。
38.權利要求35的方法，其中定量所述靶核酸的聚合或擴增。
39.權利要求30-33的任一項的方法，其中所述聚合酶選自T7DNA聚合酶、真核生物線粒體DNA聚合酶Y、原核生物DNA聚合酶1、原核生物DNA聚合酶I1、原核生物DNA聚合酶II1、原核生物DNA聚合酶IV、原核生物DNA聚合酶V、真核生物聚合酶α、真核生物聚合酶β、真核生物聚合酶Y、真核生物聚合酶S、真核生物聚合酶ε、真核生物聚合酶η、真核生物聚合酶ζ、真核生物聚合酶1、真核生物聚合酶K ;大腸桿菌DNA聚合酶1、大腸桿菌DNA聚合酶IIIa亞基、大腸桿菌DNA聚合酶III ε亞基、大腸桿菌聚合酶IV、大腸桿菌聚合酶V、水生棲熱菌DNA聚合酶1、嗜熱脂肪芽胞桿菌DNA聚合酶1、廣古菌門聚合酶、末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)、釀酒酵母聚合酶4、跨損傷合成聚合酶、逆轉錄酶、熱穩定聚合酶和端粒酶。
40.權利要求39的方法，其中所述熱穩定聚合酶選自TaqDNA聚合酶、Tfi DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Vent?DNA聚合酶、具有減小的3’ -至-5’外切核酸酶活性的聚合酶、Superscript? DNA聚合酶、遺傳工程的DNA聚合酶、具有活性位點突變F667Y的聚合酶、具有活性位點F667Y的等同物的聚合酶、Tth聚合酶、AmpHTaq?:FS、ThermoSequenase?、Therminator 1、Therminator I1、Therminator II1、Therminator Y、它們的衍生物和片段。
41.權利要求40的方法，其中所述熱穩定的聚合酶是TaqDNA聚合酶。
42.權利要求40的方法，其中所述熱穩定的聚合酶是TflDNA聚合酶。
43.一種用于檢測樣品中的靶核酸的方法，所述方法包括: a)形成反應混合物,其包含至少一種聚合酶、至少一種引物、dNTP和至少一種權利要求I的化合物以及可檢測標記；b)擴增所述靶核酸；和 c)檢測從所述可檢測標記產生的指示所述靶核酸在所述樣品中存在的信號。
44.權利要求43的方法，其使用權利要求3的化合物。
45.一種方法，其用于通過在熱循環過程中使聚合酶與權利要求1的化合物接觸來在熱循環過程中抑制聚合酶的失活。
46.權利要求45的方法，其使用權利要求3的化合物。
47.一種方法，其包括在使酶的聚合酶活性穩定化的條件下，使具有聚合酶活性的所述酶與權利要求1的所述化合物組合以形成混合物。
48.權利要求47的方法，其使用權利要求3的化合物。
49.一種核酸擴增反應混合物，其包含至少一種聚合酶、dNTP、至少一種引物和至少一種權利要求1的化合物。
50.權利要求49的反應混合物，其使用權利要求3的化合物。
51.用于產生改性去污劑的方法，其包括: a)順次地組合化合物A、甲基三苯氧基碘化鱗和N，N-二甲基甲酰胺以產生混合物； b)在適當的溫度， 適當的氣氛下攪拌所述混合物充足的時間以產生中間產物混合物； c)向所述中間產物混合物添加氨基酸酯鹽酸鹽和Et3N； d)將c)的混合物冷卻至適當的溫度并且將其濃縮以產生粗制濃縮混合物； e)通過制備型HPLC分級分離所述粗制濃縮混合物；和 f)混合并且濃縮所需的級分以分離所述改性去污劑。
52.權利要求51的方法，其還包括使步驟(f)的級分經歷水解。
53.權利要求51或52的方法，其還包括中和所述產物。
54.權利要求53的方法，其中使用Amberlite?'中和所述產物。
55.權利要求51-54的任一項的方法，其中所述改性去污劑是式I的去污劑:
56.權利要求55的方法，其中: R1是(C8-C16)烷基或(C8-C16)取代的烷基； R2和R3各自獨立地是H或CH3 ; R4和R5各自獨立地是H、(CH2)nNH, (CH2)nN,或者，R4與R5 —起形成任選地被至少一個(C1-C30)烷基、(C1-C30)取代的烷基、(C1-C30)雜烷基、(C1-C30)取代的雜烷基取代的5-或6_元環；和 每一個 η 獨立地是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30。
57.權利要求55的方法，其中所述改性去污劑選自:
【文檔編號】C07C229/24GK103796987SQ201280037032
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年6月8日 優先權日:2011年6月8日
【發明者】P·昂里希, Z·楊, J·王 申請人:生命技術公司