家蠶微粒子病特異檢測靶標基因nbop1及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物技術領域，具體涉及家蠶微粒子病特異檢測的基因及其應 用。
【背景技術】
[0002] 家蠶微粒子病是由一種原蟲引發的毀滅性病害，可通過食下傳染或胚種傳播。鑒 于該病害潛伏周期長、病程周期長、傳播速度快、對外界的抵抗力強，因此，它是蠶桑業唯一 的法定檢疫病害，并且主要依賴于傳統的母蛾鏡檢法進行檢疫。但是該方法隨機性高、效率 性差、潛伏期長、人為誤差相對較大，因此，尋找并鑒定出家蠶微粒子病特異的檢測靶標是 高效、快速、特異的進行該病害防控的基礎。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的之一是為解決當前對家蠶微粒子病檢疫方法隨機性高、效率性差、 潛伏期長、人為誤差相對較大的問題，提供了家蠶微粒子病特異檢測靶標基因 NBOPl及其 在家蠶微粒子病的免疫檢測以及作為家蠶微粒子病防控新靶點中的應用。
[0004] 本發明通過比較基因組學分析、基因克隆、基因測序、免疫定位等技術，在家蠶微 孢子蟲中獲得了一種新的物種特異地表面蛋白，該基因被命名為NBOP1。該基因全長共計 1533bp DNA序列，共編碼511個氨基酸殘基，家蠶微粒子病特異檢測靶標基因核苷酸序列 表如SEQ ID NO: 1所示。
[0005] 本發明通過比較基因組學分析發現該基因為家蠶微孢子蟲物種特異的一個新基 因；對基因的序列分析發現，該基因可能編碼一個膜蛋白；基因表達實驗，確定該基因定位 于家蠶微孢子蟲的孢子壁；所以，該基因可以用于微粒子病的免疫檢測以及作為家蠶微粒 子病防控新靶點。
[0006] 本發明的有益效果在于：本發明提供了一種新的物種特異表面蛋白，該基因全長 1533bp DNA序列，共編碼511個氨基酸殘基，該基因可以用于微粒子病的免疫檢測以及作 為家蠶微粒子病防控新靶點。
【附圖說明】
[0007] 圖1所示為NBOPl所在染色體片段與其他微孢子蟲基因組共線性比較。
[0008] 圖2所示為該基因的疏水簇分析。
[0009] 圖3所示為不同地區微孢子蟲分離株的形態觀察圖。
[0010] 圖中：上部為吉姆薩染色觀察圖，下部為電鏡掃描觀察圖，A-廣東株家蠶微孢子 蟲，B-南陽柞蠶微孢子蟲，C-山東株那卡屬變形微孢子蟲，D-重慶株家蠶微孢子蟲。
[0011] 圖4多種家蠶病原微生物分離株的PCR檢測圖
[0012] 圖中：A-家蠶核型多角體病毒、B-家蠶微孢子蟲廣東株、C-柞蠶微孢子蟲南陽株、 D-家蠶微孢子蟲重慶株、E-那卡變形微孢子蟲山東株、F-家蠶微孢子蟲廣西株。
【具體實施方式】
[0013] 下文將結合具體實施例詳細描述本發明的內容。應當注意的是，下述實施例中描 述的技術特征或者技術特征的組合不應當被認為是孤立的，它們可以被相互組合從而達到 更好的技術效果。
[0014] 實施例1
[0015] 在中國重慶家蠶微粒子病疫區采集得到被感染的家蠶，并分離得到家蠶微孢子 蟲。對所得家蠶微孢子蟲樣品清洗，采用全基因組鳥槍法（Whole genome shot-gun, WGS) 進行家蠶微孢子蟲全基因組測序。
[0016] 1.材料與方法
[0017] 1.1家蠶微孢子蟲
[0018] 家蠶微孢子蟲CQl分離株，由西南大學蠶病室分離，并保存于中國獸醫微生物菌 種保藏管理中心（CVCC)，保藏號CVCC102059。
[0019] 1. 2小片段質粒文庫的構建
[0020] 通過極絲彈出法提取家蠶微孢子蟲基因組DNA，通過HYDROSHEAR將微孢子蟲基因 組DNA打斷成小片段I. 5-2. 5Kb或7-8Kb，經過電泳分離收集，并與pUC18載體連接，轉入 E. coli，鋪板挑斑建庫，并進行測序。
[0021] I. 3miniBAC 文庫的構建
[0022] 主要采用HindIII對制備好的高質量的基因組DNA進行不完全酶切， 收集 30-50Kbp 的片段，采用 Copy Control TM BAC Cloning Kits (EPICENTRE Biotechnologies.)進行建庫。
[0023] L 4Solexa文庫的構建
[0024] Solexa文庫的建立主要參照Illumina公司的要求進行。簡述如下，將溶于50 μ L 的2-5 μ g基因組DNA用壓縮的氮氣噴霧沖擊打斷，將片段處理成鈍端后，加接頭，再用2% 的瓊脂糖凝膠分離收集150_250bp片段，并將收集到的片段用Illumina提供的引物擴增， 8~18個循環的反應產物被用來建庫并進行測序。
[0025] 1. 5基因組數據拼接、注釋
[0026] 所有的sanger reads和solexa reads都用于拼接。首先，solexa reads用深圳 華大研宄院的拼接軟件進行拼接，將拼接的結果與Sanger Reads在混在一起，經NCBI NT 庫過濾污染的細菌序列后，用PHRAP程序進行拼接。注釋采用GLIMMER 3.0為主要程序，再 結合其它相關軟件的分析結果進行。
[0027] 1. 6重復序列的分類及分析
[0028] 米用四種獨立的軟件ReAS、PILER-DF、RepeatScout和LTR_Finder進行家香微抱 子蟲基因組序列中轉座元件的預測，并根據已知各物種的重復序列對轉座元件進行分類和 拷貝數統計。最終建立一個家蠶微孢子蟲重復序列文庫，并經手工檢驗。
[0029] 2.結果與分析
[0030] 基因組文庫及相關測序、拼接及注釋結果
[0031] 為完成家蠶微孢子蟲基因組測序，我們共建立了四種不同的文庫，其中Sanger reads的測序深度共有7. 18倍，Solexa測序深度有28. 2倍，詳細信息見表1。
[0032] 表1各文庫產出數據匯總
[0033] Table 2. I Summary of data production from four libraries
[0034]
[0035] 表2基因組拼接的統計結果
[0036] Table 2. 2 Statistics of genome assembly
[0037]
[0038] 如表2所示，經過拼接，獲得3576重疊群（contigs)，利用reads的正反向關系， 可將2864個重疊群拼接成912Scaffolds,總長約13. 79Mb，scaffolds內部仍有1952個 "洞"(Gap)。最大的Scaffold長度為571275bp，大于400Kb的序列有4條，大于200Kb有11 條，大于IOOKb有31條，大于IOOKb以上的Scaffold總長為6. 715Mb。未拼接進scaffold的 contig有696個，總長約I. 95Mb。通過測序，獲得家蠶微孢子蟲全基因組數據共約15. 7Mb。
[0039] 經過基因組注釋，共獲得4479個編碼基因。重復序列的長度占基因組全長的 45.7%，在基因組中占有重要地位，而編碼序列僅占基因組總長的21%，全基因組的GC% 為 30. 7%。
[0040] 3、通過比較基因組學分析，通過基因共線性分析基因座位及基因排布的保守性， 與兔腦炎微孢子蟲相比，篩選到139個家蠶微孢子蟲特有的基因，其中NBOP1基因為家蠶微 抱子蟲獨有，而 Encephalitozoonromaleae, Encephalitozoonintestialis, Encephalitozo onhellem, Encephalitozoonbieneusi, Nosemaceranae, Vittaformacorneae, Edhazardiaae dis, Vavraiaculicisfloridensis, Trichomonashomonas, Nematocida spl 中缺失。石角定該 基因為家蠶微孢子蟲物種特異基因。進一步并通過克隆測序分析，獲得了該基因編碼區的 全序列，基因全長共計1533bp，編碼511個氨基酸。圖1顯示的是家蠶微孢子蟲Nbombycis, 兔腦炎微孢子蟲E. cuniculi,蜜蜂微孢子蟲N. ceranae,比氏微孢子蟲E. bieneusi,腸道 微孢子蟲E. intestinalis，幢蟲微孢子蟲A. Iocustae,和皰原蟲P. falciparum七個個物種 的基因組共線性比較，結果顯示NB0P1是位于家蠶微孢子蟲一個具有嚴謹性的共線性的基 因片段內，說明該基因為家蠶微孢子蟲物種特異基因。
[0041] 4、基因序列分析
[0042] 用該基因的cDNA序列在GeneBank數據庫進行BLAST，發現該基因序列與已知基因 不存在同源性；氨基酸序列結構分析預示該基因可能編碼一個功能未知的膜蛋白。初步將 其判定為家蠶微孢子蟲重慶分離株孤兒蛋白NBOPl。通過HCA軟件對該NbOPl蛋白進行結 構預測，結果如圖2所示，該NbOPl存在四個明顯的疏水簇，并且在C末端存在假定的跨膜 結構，推測該蛋白具有較強的極性，但疏水性不強。此外，對該蛋白的二級結構預測結果可 知其主要有20個α螺旋和11個β折疊構成。
[0043] 5、基因表達分析
[0044] 將該基因在大腸桿菌BL21中實現異源表達，純化后分析該基因表達產物特征，發 現該基因位于家蠶微孢子蟲孢子壁，為家蠶微孢子蟲物種特異的一個新基因。可用于家蠶 微粒子病的免疫檢測，以及作為潛在的家蠶微粒子病防控的靶標基因。
[0045] 根據上述的研宄結果可知，NBOPl基因是家蠶微粒子病病原物的一個新基因，可以 用來研宄家蠶微粒子病的免疫檢測，并可作為潛在的家蠶微粒子病防控的新靶點。為驗證 NbOPl蛋白在家蠶微孢子蟲的成熟孢子中的表達特征，我們將不同處理的成熟孢子固定處 理制片后，以小鼠陰性血清對照，用制備的NbOP 1抗血清和為一抗，Alexa 488標記的羊抗 鼠 IgG為二抗，進行間接免疫熒光觀察。結果顯示anti-NbOPl抗體能夠特異的識別家蠶微 孢子蟲孢壁，并且這種特異性免疫反應不受透化處理的影響，顯示該蛋白可能位于家蠶微 孢子蟲成熟孢子的孢壁上。
[0046] 6、應用
[0047] 利用NBOPl基因的擴增，直接檢測該基因擴增水平的熒光原位雜交，并制備相應 的基因擴增檢測試劑盒。如圖3和圖4所示，家蠶核型多角體病毒為對照，分別提取IO7個 / μ L不同地區分離到的微孢子蟲的基因組，并進行檢測靶標基因篩選，結果顯示，NBOPl特 異性較好，靈敏度較高，可以用于家蠶微粒子病基因擴增檢測試劑盒的制備。
[0048] 本文雖然已經給出了本發明的一些實施例，但是本領域的技術人員應當理解，在 不脫離本發明精神的情況下，可以對本文的實施例進行改變。上述實施例只是示例性的，不 應以本文的實施例作為本發明權利范圍的限定。
[0049]
[0050]
【主權項】
1. 家蠶微粒子病特異檢測靶標基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。2. 如權利要求1所述的家蠶微粒子病特異檢測靶標基因在家蠶微粒子病的免疫檢測 以及作為家蠶微粒子病防控新靶點中的應用。3. 如權利要求2所述的家蠶微粒子病特異檢測靶標基因在家蠶微粒子病的免疫檢測 以及作為家蠶微粒子病防控新靶點中的應用，其特征在于，可用于制備基因擴增檢測試劑 盒。
【專利摘要】本發明提供了一種新的物種特異表面蛋白，該基因全長1533bp DNA序列，共編碼511個氨基酸殘基，該基因可以用于微粒子病的免疫檢測以及作為家蠶微粒子病防控新靶點。
【IPC分類】C12N15/12, G01N33/68, C12Q1/68, G01N33/569
【公開號】CN104928298
【申請號】CN201510346427
【發明人】周澤揚, 羅潔, 潘國慶, 杜孝田
【申請人】羅潔
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年6月19日