專利名稱：一種植物抗旱基因的制作方法
技術領域：
本發明是空心蓮子草的一種抗旱基因，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
目前，應用轉基因技術提高植物的抗旱性已經成為共識，但已分離的植物抗旱基因種類及數量還很有限，且多是從對干旱敏感植物中克隆獲得。空心蓮子草抗旱能力很強，其體內應該有一系列抗旱能力強的基因，是進行抗旱基因研究的良好材料。由于水稻和空心蓮子草均可正常生長于淡水環境中，與來自于干旱敏感植物及陸生植物的耐旱基因相比，將來自空心蓮子草的抗旱基因轉入水稻可能會更有效。因此分離空心蓮子草的抗旱基因，為應用基因工程技術提高植物尤其是水稻抗旱性，提供了更加豐富的優良候選基因。

發明內容
本發明克隆了空心蓮子草的一種抗旱基因ApCL。該基因長度為734bp，開放閱讀框從核苷酸第22-522位，編碼166個氨基酸。
具體實施例方式采用砂培法通過澆灌Hoagland營養液在室內培養空心蓮子草，白天30°C晚上25°C，空氣相對濕度70%，光照12h，光強是^Oumol/mVs1。當空心蓮子草的莖節上長出約Icm長的須根時，停止澆水3天，剪取須根。按照INVITROGEN Trizol說明書提取須根RNA，再按照TAKARA DNaseI說明書去除 RNA 中殘存的 DNA。用 5 u g 總 RNA 按照 Promega 公司的 M-MLV Reverse Transcriptase說明書進行逆轉錄得到cDNA。設計上游引物5 ' -GATCAAGTCCCCCACCTA-3 '和下游引物5 ' -CGGCAATGATTCAAATATATT-3 '進行抗旱基因ApCL的PCR擴增。PCR反應體系如下5ul 10Xbuffer, 4ul dNTP (2. 5mmol L-1), Iul 上游引物(10 u mol. L1), Iul 下游引物(IOumol L1)，0. 25ul(5U uF^Taq 酶，2ulcDNA，補充無菌 ddH20 至 50ul。PCR 反應條件如下，94°C預變性 lmin，94°C 30sec，54°C 30sec，72°C lmin，35 個循環，72°C IOmin0 在對PCR產物進行膠回收純化后，連接T載體轉化測序。通過半定量PCR技術檢測抗旱基因ApCL在干旱后表達情況。植物材料培養同上，只是材料分為兩部分，分別用于對照和干旱處理。為了消除cDNA濃度的影響，選用看家基因Actin作為內參對照。Actin的擴增方法是以干旱處理前后的cDNA為模板，用上游引物 5 ' -TGAACTTCGTGTTGCTCCAGA-3 '和下游引物 5 ' -AACCCTCGTAGATTGGCACAG-3 '進行 PCR 擴增。PCR 反應體系如下5ullOXbuffer,4ul dNTP(2. 5mmol L1)，Iul 上游引物(IOumol L1), Iul 下游引物(IOumol L1)，0. 25ul (5U ul^Taq 酶，2ulcDNA，補充無菌 ddH20 至 50ul。PCR 反應程序94 °C 3min ；94 °C 20sec，55°C 20sec，72°C20sec，72°C lOmin，擴增產物大小為230bp。再根據本發明公開的抗旱基因ApCL核苷酸序列(SEQ ID NO. I)，設計上游引物5 ' -TCGCCCTCATCCCACCAT-3 '和下游引物5' -GCAGTCACCTGGGTTCTTCG-3'，以干旱處理前后的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系如下5ullOXbuffer, 4ul dNTP (2. 5mmol LI)，Iul 上游引物(10 u mo I L1)，Iul 下游引物(IOumol L-1), 0. 25ul(5U .urOTaq 酶，2ulcDNA，補充無菌 ddH20 至 50ul。PCR 反應程序94°C 3min,94°C 10sec，59°C 10sec，72°C 10sec，72°C lOmin。擴增產物大小為102bp。為使PCR擴增在指數期進行，Actin和上述抗旱基因均進行25，30，35，40個循環的擴增。對指數擴增期PCR產物進行電泳，而后用凝膠成像系統觀察分析干旱處理前后Actin和上述抗旱基因ApCL的PCR產物條帶亮度。
通過斑點雜交技術檢測其在干旱前后表達量。為了消除cDNA濃度的影響，選用看家基因Actin作為內參對照，Actin的擴增方法同上。吸取Iul的Actin和ApCL的PCR產物分別點在兩張尼龍膜上，對干旱處理前后cDNA進行地高辛標記做為探針，用探針對尼龍膜上的Actin和ApCL進行雜交，研究抗旱基因ApCL在干旱處理前后的表達情況。將得到的抗旱基因ApCL序列提交Genbank，經Blast比對表明，該基因與腐霉菌分泌蛋白基因同源性高達95%，與其他物種沒有同源性。此類基因功能未見報道。我們的上述試驗證明該基因在干旱脅迫后表達量增加，是一種新的抗旱基因。該基因的克隆擴大了植物抗旱研究的基因資源，為運用基因工程技術提高植物尤其是水稻抗旱性，提供了更加豐富的優良候選基因。圖I,半定量PCR顯示抗旱基因ApCL在干旱不同時間表達量圖2,斑點雜交顯示抗旱基因ApCL在干旱處理前(A)、后(B)表達量。
權利要求
1.一種植物抗旱基因，其堿基序列如SEQ ID NO. I所示。
全文摘要
本發明涉及一種植物抗旱基因序列，屬于基因工程技術領域。其特征在于該基因長度為734bp，開放閱讀框從核苷酸第22-522位，編碼166個氨基酸。應用半定量PCR技術和斑點雜交技術，研究該基因在干旱脅迫后的表達，發現干旱脅迫后該基因表達量增加，為植物抗旱基因。該基因的克隆擴大了植物抗旱研究的基因資源，為運用基因工程技術提高植物尤其是水稻抗旱性，提供了更加豐富的優良候選基因。
文檔編號C12N15/29GK102776205SQ20121028949
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月15日 優先權日2012年8月15日
發明者習金根, 何光源, 劉巧蓮, 尹亮, 張世清, 易克賢, 楊峰, 楊輝, 羅才波, 肖強, 鄭金龍, 陳河龍, 高建明 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所